不同大孔吸附树脂对葛根总黄酮分离纯化效果的影响

两部．｛ｒ医　刎５年第２８卷第ＪＪ期　方　药・矮鼍分１Ｉ　不同大孔吸附树脂　对葛根总黄酮分离纯化效果的影响冰　

王海峰’，张红　１武警工程大学医院，陕西西安７１　００８６；２陕西省中医药研究院　

［摘要］目的：考察三种大孔吸附树脂对葛根总黄酮的吸附及解吸性能，为分离纯化葛根总黄酮提供选　择依据。方法：以葛根总黄酮为筛选指标，考察ＡＢ－８、ＮＫＡ和Ｘ－５三种大孔树脂对葛根总黄酮的吸附量和解吸　率。结果：以ＡＢ一８树脂为吸附剂。最佳分离条件为上样浓度：１　ｇ／ｍＬ（按生药计算），流速：２～３　ｍＬ／ｍｉｎ，７Ｏ％乙醇　为洗脱剂，用量为２．５　ＢＶ，总黄酮得率７６．２２％。结果：ＡＢ－８大孔吸附树脂可用于分离纯化葛根总黄酮，总黄酮　得率７６．２２％。结论：三种大孔吸附树脂相比较，以ＡＢ－８为分离纯化葛根总黄酮的最佳吸附剂。　［关键词］葛根总黄酮；葛根素；大孔吸附树脂　［中图分类号］Ｒ５６７．１　［文献标识码］Ａ　［文章编号］１　００４－６８５２（２０１５）１１－００２７－０３　

Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ　ｏｆＭａｅｒｏｐｏｒｏｕｓ　Ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ　Ｒｅｓｉｎ　ｏｎ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆＴｏｔａｌ　Ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ　ｆｒｏｍ　ＧｅＧｅｎ　ＷＡＮＧ　Ｈａｉｆｅｎ　，ＺＨＡＮＧ　Ｈｏｎ　Ｊ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ　Ａｆｆｉｌｉａｔｅｄ　ｔｏ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆＣＡＰＦ，Ｘｉ　肌７１００８６，Ｃｈｉｎｃ￣　２　Ｓｈａａｎｘｉ　Ｐｒｏｖｉｎｅｉａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆＴｒａｄｉｔｉｏｎａｌ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　

＾ｂ暑１睫薯ｃｔ　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏ　ｐｒｏｖｉｄｅ　ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　ｆｏｒ　ｐｕｒｉｆｙｉｎｇ　ｔｏｔａｌ　ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ　ｆｒｏｍ　ＧｅＧｅｎ［Ｐｕｅｒ￣ｉａｅ　ｌｏｂａｔａ（Ｗｉｌｌｄ．１　ｏｈｗｉ］ｂｙ　ｏｂｓｅｒｖｉｎｇ　ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍａｃｒｏｐｏｒｏｕｓ　ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ　ｒｅｓｉｎ　ｔｏ　ｔｏｔａｌ　ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ　ｆｒｏｍ　ＧｅＧｅｎ．　Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｂｙ　ｔａｋｉｎｇ　ｔｏｔａｌ　ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ　ｆｒｏｍ　ＧｅＧｅｎ　ａｓ　ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ｉｎｄｅｘ．ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ　ｖｏｌｕｍｅ　ａｎｄ　ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ　ｒａｔｅ　ｏｆ　ｔｃＩｔａｌ　ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ　ｆｒｏｍ　ＧｅＧｅｎ　ｗｅｒｅ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ　ｂｙ　ｔｈｒｅｅ　ｋｉｎｄｓ　ｏｆｍａｃｒｏｐｏｒｏｕｓ　ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ　ｒｅｓｉｎｓ　ＡＢ－８，ＮＫＡ　ａｎｄ　Ｘ－５．Ｒｅ—　ｓｕｉｔｓ：ＡＢ－８　ｒｅｓｉｎ　ｗａｓ　ｔａｋｅｎ　ａｓ　ａｄｓｏｒｂｅｎｔ．Ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍａｌ　ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　ｗｅｒｅ　ｓａｍｐｌｅ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ：１　ｇ／ｍＬ（ｃａｌ－　ｃｕｌａｔｅｄ　ａｃｃｏｒｄｉｎｇ　ｔｏ　ｃｒｕｄｅ　ｄｒｕｇｓ），ｆｌｏｗ　ｒａｔｅ：２～３　ｍＬ／ｍｉｎ，７０％ｅｔｈａｎｏｌ　ａｓ　ｅｌｕｅｎｔ，ｄｏｓａｇｅ：２．５ＢＶ，ｔｏｔａｌ　ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ　ｙｉｅｌｄ　ｗａｓ　７６．２２％．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：ＡＢ－８　ｉｓ　ｃｈｏｓｅｎ　ａｓ　ｔｈｅ　ｂｅｓｔ　ａｄｓｏｒｂｅｎｔ　ｏｆ　ｓｅｐａｒａｔｉｎｇ　ａｎｄ　ｐｕｒｉｆｙｉｎｇ　ｔｏｔａｌ　ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ　ｆｒｏｍ　ＧｅＧｅｎ　ａｆｔｅｒ　ｃｏｍｐａｒｉｎｇ　ｔｈｒｅｅ　ｋｉｎｄｓ　ｏｆｍａｃｒｏｐｏｒｏｕｓ　ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ　ｒｅｓｉｎｓ．　墨耵－　ｔｏｔａｌ　ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ　ｆｒｏｍ　ＧｅＧｅｎ；ｐｕｅｒａｒｉｎ；ｍａｃｒｏｐｏｒｏｕｓ　ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ　ｒｅｓｉｎ　

葛根（Ｐｕｅｒａｒｉａ　ｌｏｂａｔａ（Ｗｉｌｌｄ．）Ｏｈｗｉ）是豆科落　叶藤本植物野葛根，最早载于《｝申农本草经》，性平，　味甘辛，功效解肌退热，生津止渴，升阳透疹［１］。　药理研究发现葛根具有抗缺氧，改善脑循环，保　护心肌缺血，降血压等作用［１　。临床主要用于急　性脑梗塞，急性心肌梗塞，不稳定性心绞痛，高粘　血症的治疗［蚋］。葛根含黄酮类化合物高达７．６％，　主要有葛根素、大豆素、大豆素４　，７一二葡萄糖苷　黄豆苷等［　１０］。本研究采用葛根７０％乙醇回流得　到粗提液为原料，比较ＡＢ一８、ＮＫＡ一９和ｘ一５三种大　孔吸附树脂对葛根总黄酮的分离效果，并考察　ＡＢ一８大孔吸附树脂分离纯化葛根总黄酮的工艺　和方法。　ｌ　材料与方法　１．１材料葛根采白陕西省安康市镇平县。葛根　素标准品购于中国药品生物制品检定所，批号：　１１０７５２—２００５１１；ＡＢ－８、ＮＫＡ及Ｘ一５大孔吸附树脂　购于天津南开大学化工厂；其他化学试剂均为分　析纯。　１．２仪器ＵＶ一２２０１型紫外分光光度计；层析柱　（‘ｐ１５　ｍｍｘ２００　ｃｍ）。　１．３方法　１．３．１葛根粗提液制备将葛根药材（３００　ｇ）烘　干，粉碎成粗粉，采用３０％乙醇为溶剂回流提取３　次，１．５ｈ／次，滤过，滤液合并，减压浓缩至３００ｍＬ，　得到葛根粗提液。　１．３．２　葛根总黄酮含量测定　以葛根素为对照　品，采用紫外分光光度法测定葛根总黄酮含量。　１．３．２．１标准曲线的绘制　精密称取葛根素　４．８８　ｍｇ，置于２５　ｍＬ量瓶中，加９５％乙醇溶解并稀释　

２７　方　药・凄　分铴　Ｗｅｓｔｅｒｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２０１５　ＶｏＬ２８　Ｎｏ．１１　至刻度，摇匀，作为储备液（含葛根素０．１９５２　ｍｇ／ｍＬ）。　精密量取储备液０．００，０．４０，０．８０，１．２０，１．６０，　２．００　ｍＩＪ，置于２５　ｍＩ｜量瓶中，加９５％乙醇稀至刻　度，摇匀。分别于２５４　ｒｌｌｎ波长处测定吸光度，并建　立浓度对吸光度的线性回归方程：Ａ＝６２．２１６Ｃ＋　０．００４３；相关系数ｒ＝Ｏ．９９９　７，见图１。　

ｌ　２。　１．。。　ｇ。・８０　。　。　。　。・２。　Ｏ　ＯＯ　

葛根素浓度／（ｍｇ　ｍ　）　图１标准曲线　１．３．２．２含量测定取葛根粗提液０．１　ｍＬ，置于　２５　ｍＬ容量瓶中，加９５％乙醇至刻度，摇匀。另取　１．０　ｍＬ乙醇同法稀释作空白对照，在２５４　ｎｍ波长　处测定吸光度。计算葛根总黄酮的含量，结果为　３．９９７　ｍｇ／ｍＬ。　１．３．３　３种大孔吸附树脂吸附性能的比较（柱层　析分离纯化）　１．３．３．１　大孔吸附树脂预处理ＡＢ一８、ＮＫＡ和　Ｘ－５　３种树脂各取１００　ｇ，加９５％乙醇适量，浸泡３　天，让树脂充分溶胀，然后用９５％乙醇洗脱至流出　液中加水后无白色浑浊出现，再用蒸馏水洗尽乙　醇，备用。　１．３．３．２吸附量与解吸率测定精密称取预处　理过的树脂５　ｇ，置于三角瓶中，精密加入葛根粗　提液５０　ｍＬ，振荡２４小时，滤过，测定滤液中总黄　酮浓度。计算３种树脂的吸附量和吸附率。再向吸　附的树脂中精密加入９５％乙醇５０　ｍＬ，振荡２４小　时，滤过，测定滤液中总黄酮浓度，根据总黄酮解　吸量计算解吸率。　己　结果　２．１　吸附量与解吸率测定结果标准曲线的建　立以“１．３．２．１”项下方法绘制标准曲线，建立总黄　酮浓度对吸光度的线性回归方程：Ａ＝６６．１６３Ｃ＋　０．０４３　５；ｒ＝Ｏ．９９９　５，计算吸附量和解吸率。实验结　果可见３种树脂中，ＡＢ一８大孔树脂对葛根总黄酮　的吸附量和解吸率最大，见表１。　表１　３种树脂对葛根总黄酮的吸附量与解吸率测定ｍｇ　２．２　ＡＢ－８大孔树脂对葛根总黄酮的分离纯化　２．２．１　吸附流速对吸附效果的影响　吸附流速　对吸附效果的影响主要是影响溶质向树脂表面的　扩散。如果流速太高，溶质分子来不及扩散到树脂表　面，就会发生漏过。对相同的葛根浸提液（ＳＯｍＬ）在　相同条件下，分别进行了ＡＢ一８树脂在吸附流速为　小流速（２～３　ｍＬ／ｍｉｎ），中档流速（４—５　ｍＬ／ｍｉｎ）、最　高流速（６　７　ｍＬ／ｍｉｎ）的吸附实验，结果表明流速　为２　３　ｍＬ／ｍｉｎ时黄酮洗脱量最大，见表２。　表２吸附流速对吸附效果的影响　２．２．２洗脱剂及洗脱浓度的选择取ＡＢ一８树　脂，湿法装柱（径高比１：１５），准确吸取５０　ｍＬ样品　原液，以流速ｌ　ｍＬ／ｍｉｎ上柱，分别准确配制３０％、　５０％、７０％、８０％和９０％的乙醇洗脱剂，检测它们在相　同条件下通过树脂柱时的解吸率，实验发现７０％　以下乙醇洗脱曲线光滑，无拖尾，其解吸率适中，　因此选用７０％乙醇洗脱，见表３，洗脱曲线见图２。　表３不同浓度乙醇洗脱剂对吸附效果的影响　洗脱剂／％　黄酮洗脱量／ｍｇ　３０　２６７．２ｌ　５Ｏ　１　７７．０１　７Ｏ　２５３．４１　８Ｏ　３３３．５０　９０　３３８．９６　２．２．３　洗脱剂用量的选择用ＡＢ一８大孔树脂　（树脂体积２５　ｍＬ）饱和吸附葛根粗提液，分别用　６０、９０、１２０、１５０、１８０、２００、２４０、２７０　ｍＬ　７０％的乙醇　洗脱，收集每一树脂流出液体积，计算黄酮洗脱　率，依据累积洗脱率确定７０％乙醇用量，见表４。　表４洗脱剂用量考察结果　树脂体积／ｍＬ　乙醇用量／ｍＥ　黄酮累计洗脱率／％　２５　２　５　０．６２　２５　５０　３．６５　２５　７５　３５．９５　２５　１　ＯＯ　５８．５５　２５　１２５　７６．２２　２　５　１５　Ｏ　７８．５４　２　５　１７５　７８．６１　！！：　实验发现当洗脱剂用量大于８倍树脂体积得　到的黄酮量少，因７０％乙醇用量是树脂体积５倍　时洗脱率累积达到７６．２２％，说明此时大孔树脂吸　附的黄酮已基本被洗脱下来，并且在其用量为４　

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