琼脂糖凝胶电泳的操作步骤(精)
pcr扩增琼脂糖凝胶电泳操作流程
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琼脂糖凝胶电泳步骤
琼脂糖凝胶电泳步骤实验前准备及注意事项：将所要用到的制胶锥形瓶、胶槽、梳齿等物品清理干净，如有残胶，需将残胶尽量去除。
注意：所有用来跑核酸胶的物品，只要接触过核酸染料，一定要专门放置，专物专用，不要再将污染过的物品随意放置，以免污染其他物品。
接触过核酸染料的手套不要再碰非污染区的物品。
制胶和拿取核酸胶时佩戴一次性PE手套，再操作其他地方时将一次性手套丢弃。
实验步骤：1.按每100ml 1×TAE/TBE缓冲液中加入1g琼脂糖（1%的胶，根据核酸大小选择制胶的浓度，一般情况用1%-2%的胶）的比例，称取琼脂糖，加入专门制琼脂糖凝胶的250ml-500ml的锥形瓶中。
2.按比例量取适量的1×TAE/TBE缓冲液，加入到锥形瓶中的琼脂糖一起，适当摇晃锥形瓶初步混匀。
3.将混合液放入微波炉中，用中高火加热，加热总时间可根据制胶总量调整，一般40ml左右的胶量加热90s左右。
如果制胶量大，记得每加热1min左右将瓶从微波炉中取出，轻轻晃匀后，再继续加热，以免局部过热导致胶溢出。
注意：取出加热后的瓶时，记得垫上纸，防止烫手！4.待胶加热好，完全溶解后，稍晾凉至45-55℃左右（以基本不太烫手为宜）按照1:10000的比例加入核酸染料（如100ml胶加10ul染料），迅速摇匀。
5.将胶槽和梳齿准备好，梳齿可以预先插好，将上一步摇匀的胶倒入胶槽中，一般厚度以60mm左右为宜，具体要根据梳齿的厚度以及样品量来定。
6.待胶变白，基本表示胶已凝好，此时可以将梳齿拔出，一定要竖着往上拔梳齿，不要摇晃，以免样品孔被破坏。
7.在电泳槽中倒入1×TAE/TBE缓冲液，将制好的胶放入缓冲液，以缓冲液没过样品孔为宜。
8.点样：根据样品孔的大小决定上样量，每一排样品孔至少有一个孔用来点DNA Marker。
（上样前确定每个样品和Marker里都已经加了Loading buffer，Loading buffer 的终浓度为1×）9.确定样品孔的方向，核酸带负电，样品孔要在负极，通电后在胶孔中向正极移动。
DNA的琼脂糖凝胶电泳DNA实验技术方法
DNA的琼脂糖凝胶电泳DNA实验技术方法琼脂糖凝胶电泳（Agarose gel electrophoresis）是一种常用的分离和分析DNA分子的技术方法。
本文将对DNA的琼脂糖凝胶电泳实验技术方法进行详细介绍。
1.原理琼脂糖凝胶电泳是一种基于DNA分子大小的分离方法。
DNA分子在电场的作用下，由于带负电荷，会向阳极移动。
由于琼脂糖凝胶的孔径不同，不同大小的DNA分子会被琼脂糖凝胶所阻碍，大分子相对较慢，小分子相对较快地通过凝胶孔隙。
通过电泳，可以将不同大小的DNA分子分离开来，形成一条条带状。
2.实验步骤（1）制备琼脂糖凝胶：将适量的琼脂糖加入1×TAE缓冲液中，加热溶解，冷却至约60℃时加入适量的乙溴酸溶液，振荡均匀后倒入电泳槽中，插入梳子形成孔洞。
（2）样品制备：将待测DNA溶解在缓冲液中（常用缓冲液为1×TBE或1×TAE），加入适量的显色剂（如溴化乙锭），混合均匀。
（3）装料和电泳：将样品倒入琼脂糖凝胶的样品槽中，注意避免气泡的产生。
将电泳槽连接电源，接通电源，设定适当的电压（通常为100-150V）进行电泳。
（4）分析结果：电泳结束后，关闭电源，取出凝胶，放入紫外光透射仪中观察凝胶上的DNA带状条带，并进行照相或记录。
3.实验注意事项（1）凝胶制备：凝胶溶液要充分均匀，避免不均匀分布造成的电泳结果不准确。
（2）样品制备：样品在加入缓冲液中时要充分混匀，避免DNA在样品中的不均匀性造成的电泳结果不准确。
（3）电泳条件：电泳条件包括电压、时间、缓冲液等。
较高的电压可以加快电泳速度，但会产生较多的带展平现象。
合适的电压应根据实验需要调整。
（4）结果分析：在紫外光透射仪下观察DNA带状条带时，要小心操作，避免DNA样品受到过长时间的紫外线照射。
4.应用领域琼脂糖凝胶电泳广泛应用于分离和分析DNA分子。
常见的应用领域包括：DNA片段的分子量测定、PCR产物分析、DNA测序结果的验证、突变检测等。
简述琼脂糖凝胶电泳的基本过程
简述琼脂糖凝胶电泳的基本过程
琼脂糖凝胶电泳是一种常用的生物分子分离和分析技术。
其基本过程如下：
1. 制备琼脂糖凝胶：将琼脂糖粉溶解在缓冲液中，加热并搅拌使其溶解，然后待其冷却凝胶化。
凝胶化的时间和温度可以根据需要来调节，一般凝胶化时间为30-60分钟。
2. 电泳槽的装置：凝胶凝胶化后，将其放入电泳槽中，槽中注入足够的缓冲液，使凝胶完全浸泡其中，确保电泳过程中缓冲液的循环。
3. 样品制备：将要分析的待分离生物分子样品进行处理，通常会进行核酸或蛋白质的提取、纯化和浓缩等步骤，得到待分析的样品。
4. 样品加载：在经过处理的样品中加入适量的载体，使样品具有一定的密度，然后将样品加载到凝胶孔中。
通常在一个凝胶中加载多个样品以实现多项分离。
5. 电泳：将电泳槽连接到电源上，通常使用直流电。
电场的作用下，待分离的生物分子带上电荷，沿着电场方向迁移，根据它们的大小和形状的不同，迁移速率也会有所不同。
较小的分子会迁移得更快，而较大的分子则迁移速度较慢。
6. 分析结果：电泳进行一段时间后，关闭电源，取出凝胶进行染色或其他相关检测分析。
染色后，在紫外线照射下可以观察
到凝胶上待分离生物分子的条带，根据条带的位置和大小可以进行分析和定量。
琼脂糖凝胶电泳具有操作简单、分辨效果好等优点，广泛应用于核酸和蛋白质的分离、纯化和分析等领域。
琼脂糖凝胶电泳的基本过程
琼脂糖凝胶电泳的基本过程
琼脂糖凝胶电泳是一种常用的蛋白质分离与检测方法，其基本过程如下：
1. 准备琼脂糖凝胶：将适量的琼脂糖加入缓冲液中，加热溶解后冷却至适合凝胶形成的温度，通常为室温或4℃。
2. 注射样品：将待检测的样品（通常是蛋白质混合物）与一定量的加载缓冲液混合，并用微量注射器将样品缓慢地注射到琼脂糖凝胶的加载孔中。
3. 开始电泳：将装有琼脂糖凝胶的电泳槽中注入足够的电泳缓冲液，确保琼脂糖凝胶完全被液体覆盖。
然后将电泳槽连接到电源上，设定适当的电压和时间，开始电泳。
4. 蛋白质分离：在电场的作用下，由于蛋白质的不同特性（如分子大小、电荷等），蛋白质会在琼脂糖凝胶中以不同的速度移动。
较小的蛋白质会更快地移动，较大的蛋白质会移动得更慢。
5. 染色和可视化：电泳结束后，可以通过染色等方法对琼脂糖凝胶中的蛋白质进行标记，常见的染色方法有银染色、草酸染色、共蛋白染色等。
然后使用适当的设备（如紫外线透射仪）对染色后的凝胶进行图像记录和分析。
6. 分析结果：根据不同蛋白质在凝胶中的迁移距离和密度，可以对样品中的蛋
白质进行定性和定量分析，从而了解样品中蛋白质的组成和相对含量。
DNA琼脂糖凝胶电泳实验原理和方法步骤
DNA琼脂糖凝胶电泳实验原理和方法步骤实验原理：DNA是带有负电荷的分子，当在电场力作用下，可以根据分子的大小和形状移动到琼脂糖凝胶上。
琼脂糖凝胶的作用是形成一个微孔状的网状结构，可以筛选DNA根据大小进行分离。
较小的DNA片段能够通过网状结构移动较快，而较大的DNA片段则移动较慢。
通过观察DNA在凝胶上的迁移距离和与各种标准DNA片段的比较，可以确定样品中DNA片段的大小。
方法步骤：准备工作：1.准备琼脂糖凝胶：按照产品说明书或实验方案将琼脂糖溶解在适量的缓冲液中，同时加热至完全溶解。
2.准备电泳槽：将琼脂糖凝胶倒入电泳槽中并插入电极，确保凝胶充分固化并全部覆盖缓冲液。
样品处理：1.提取DNA样品：根据实验需求，从细胞或组织中提取DNA。
2.消化DNA：将DNA溶液加入适量的限制性内切酶反应缓冲液，并在适当的温度下孵育一段时间，以消化DNA并产生DNA片段。
3.加入标记：对DNA样品进行标记，如使用荧光染料或放射性同位素。
4.加入加载缓冲液：将DNA样品与适量的加载缓冲液混合，以便在电泳过程中均匀加载样品。
电泳：1.装载样品：将标记好的DNA样品加载到琼脂糖凝胶的孔上。
可以使用微量吸管或特殊的装载器具，确保每个孔中加载相同数量的DNA。
2.加载DNA标准：在其中一个孔中加载大小已知的DNA标准，以用于分析和确定样品中的DNA片段大小。
3.电泳运行：将电泳槽连接到电源，并设定合适数值的电流和电压。
运行电泳直到DNA杂质和标准DNA片段迁移到适当位置（通常为30分钟至数小时）。
染色和可视化：1.染色：将琼脂糖凝胶浸入DNA染色剂溶液中，以便可视化DNA片段。
2.可视化和记录：使用紫外光或其他适当的光源照射琼脂糖凝胶，观察DNA片段的迁移情况，并使用相机、成像系统或适当的分析软件记录和分析结果。
解释结果：通过比较标准DNA片段的迁移速度和位置，可以判断样品中DNA片段的大小。
较小的DNA片段会迁移至凝胶上更远的位置，而较大的DNA片段则更接近插孔。
琼脂糖凝胶电泳配方与步骤(精)
� RNA 琼脂糖凝胶电泳:配制:1. 0.5M EDTA(pH=8.0 :100ml :称取 18.61g Na 2EDTA ·2H 2O (分子量 372.24 ,加 80ml ddH 2O 剧烈搅拌, 用 NaOH 调节 PH 值至 8.0(约需 2g NaOH . 高压灭菌,室温保存。
2. 50×TAEloading buffer:(Tris acetate-EDTA buffer 电泳缓冲液组分:2MTris-乙酸;100mM EDTA(pH=8.0500mL:称 121.1g Trisbase(分子量 121.14 ,加 800ml ddH 2O 溶解,加 57.1ml 乙酸和 50ml 0.5M EDTA 溶液(pH=8.0 ,搅拌, ddH 2O 定容至 500mL . 室温保存。
3. 1×TAEloading buffer:取 20ml 50×TAE, ddH 2O 定容至 1L. 室温保存。
4. 100×Sybergreen :500ul :取 495ul 1×TAE于 1.5ml 离心管,加入 5ul Sybergreen 原液混匀,4℃锡纸避光保存。
注意:Sybergreen 原液需稀释 10000倍;6×DNAloading buffer 上样缓冲液需稀释六倍,最终稀释倍数应不小于 1×。
步骤:1. 制备 1%琼脂糖凝胶 (大胶用 70ml, 小胶用 50ml ,我们用 30ml:称 0.3g 琼脂糖置于 100ml 锥形瓶中,加入 30ml 1×TAE ,瓶口倒扣小烧杯。
微波炉加热煮沸 3次,至琼脂糖全部融化,摇匀,即成 1.0%琼脂糖凝胶液。
2. 胶板制备 :取电泳槽内的有机玻璃内槽 (制胶槽洗干净 , 晾干 , 放入制胶玻璃板 . 取透明胶带将玻璃板与内槽两端边缘封好 , 形成模子 . 将内槽置于水平位置 , 并放好梳子 .将冷却到 65℃左右的琼脂糖凝胶液混匀小心地倒入内槽玻璃板上 , 使胶液缓慢展开 , 直到整个玻璃板表面形成均匀胶层 . 室温下静置直至凝胶完全凝固 , 垂直轻拔梳子 , 取下胶带 , 将凝胶及内槽放入电泳槽中 . 添加 1×TAE 电泳缓冲液至没过胶板为止 . 3. 加样 :样品制备:(10ul 体系 /样品槽于 0.25ml 离心管中样品 RNA (最后加 :2ul /3ul/5ul6×DNA loading buffer:10/6=1.7ul100×Sybergreen :0.1ulDEPC 水:至 10ul(注意 :加样前要先记下加样的顺序 . 分别将样品加入胶板的样品小槽内 , 每加完一个样品 , 应更换一个枪头 , 以防污染 , 加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面 .4. 电泳 :加样后的凝胶板立即通电进行电泳 , 电压 60-100V , 样品由负极 (黑色向正极(红色方向移动 . 电压升高 , 琼脂糖凝胶的有效分离范围降低 . 当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约 1cm 处时 , 停止电泳 .5. 电泳完毕后 , 取出凝胶 , 利用科 212凝胶成像系统 , 在紫外灯(trans UV 下观察拍照保存 .DNA 存在则显示出红色荧光条带 . RNA 完美提出应该是三条带:28, 18, 5.8。
pcr产物的琼脂糖凝胶电泳及成像和导流杂交仪操作步骤
pcr产物的琼脂糖凝胶电泳及成像和导流杂交仪操作步骤PCR产物的琼脂糖凝胶电泳及成像和导流杂交仪操作步骤一、引言PCR（聚合酶链式反应）是一种常用的分子生物学技术，可以在体外扩增DNA片段。
为了确认PCR反应是否成功以及检测扩增产物的大小和纯度，常常需要进行琼脂糖凝胶电泳和成像。
为了检测特定序列的存在或缺失，可以使用导流杂交仪进行导流杂交实验。
下面将详细介绍PCR产物的琼脂糖凝胶电泳及成像和导流杂交仪操作步骤。
二、PCR产物的琼脂糖凝胶电泳及成像操作步骤1. 准备琼脂糖凝胶a. 在称量皿中称取适量琼脂糖粉末。
b. 加入适量TAE缓冲液（含有Tris-Acetate和EDTA），搅拌溶解。
c. 将混合液倒入搭配好模具的平板上。
d. 等待凝固后，将平板放入电泳槽中。
2. 加载样品a. 将PCR产物与DNA标记物混合。
b. 加入适量的加载缓冲液，混匀。
c. 使用微量移液器将样品缓冲液吸取到电泳孔中。
3. 进行电泳a. 打开电泳槽电源，设置合适的电压和运行时间。
b. 进行电泳，直到样品移动到合适位置。
4. 凝胶染色a. 将凝胶浸泡在含有DNA染料（如溴化乙锭）的溶液中。
b. 静置一段时间，直至凝胶被染色。
5. 洗涤和成像a. 将凝胶放入洗涤缓冲液中，去除多余染料。
b. 将凝胶放在紫外线转照仪中进行成像，并记录结果。
三、导流杂交仪操作步骤1. 准备导流杂交试剂a. 根据试剂盒说明书配制导流杂交试剂。
b. 加入适量探针或引物，混合均匀。
2. 处理样品a. 提取待检测的DNA或RNA样品。
b. 根据实验需要进行纯化、消化或修饰处理。
3. 杂交反应a. 将处理后的样品与导流杂交试剂混合。
b. 加入适量的杂交缓冲液，混合均匀。
c. 将混合物在合适的温度下进行杂交反应。
4. 杂交膜制备a. 准备含有DNA或RNA探针的杂交膜。
b. 将杂交膜放入预先准备好的孔板中。
5. 杂交过程a. 将杂交膜和样品混合物加入孔板中。
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琼脂糖凝胶电泳是用琼脂或琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。
对于分子量较大的样品, 如大分子核酸、病毒等, 一般可采用孔径较大的琼脂糖凝胶进行电泳分离。
琼脂糖凝胶约可区分相差 100bp 的 DNA 片段, 其分辨率虽比聚丙烯酰胺凝胶低,但它制备容易,分离范围广,尤其适于分离大片段 DNA 。
普通琼脂糖凝胶分离DNA 的范围为 0.2-20kb ,利用脉冲电泳,可分离高达 10^7bp的 DNA 片段。
操作流程
准备干净的配胶板和电泳槽
注意 DNA 酶污染的仪器可能会降解 DNA , 造成条带信号弱、模糊甚至缺失的现象。
选择电泳方法
一般的核酸检测只需要琼脂糖凝胶电泳就可以;如果需要分辨率高的电泳, 特别是只有几个 bp 的差别应该选择聚丙烯酰胺凝胶电泳;用普通电泳不合适的巨大DNA 链应该使用脉冲凝胶电泳。
注意巨大的 DNA 链用普通电泳可能跑不出胶孔导致缺带。
正确选择凝胶浓度
对于琼脂糖凝胶电泳,浓度通常在 0.5~2%之间,低浓度的用来进行大片段核酸的电泳, 高浓度的用来进行小片段分析。
低浓度胶易碎, 小心操作和使用质量好的琼脂糖是解决办法。
注意高浓度的胶可能使分子大小相近的 DNA 带不易分辨,造成条带缺失现象。
适合的电泳缓冲液
常用的缓冲液有 TAE 和 TBE ,而 TBE 比 TAE 有着更好的缓冲能力。
电泳时使用新制的缓冲液可以明显提高电泳效果。
注意电泳缓冲液多次使用后, 离子强度
降低, PH 值上升,缓冲性能下降,可能使 DNA 电泳产生条带模糊和不规则的 DNA
带迁移的现象。
电泳的合适电压和温度
电泳时电压不应该超过 20V/cm, 电泳温度应该低于 30℃, 对于巨大的 DNA 电泳,温度应该低于 15℃。
注意如果电泳时电压和温度过高,可能导致出现条
带模糊和不规则的 DNA 带迁移的现象。
特别是电压太大可能导致小片段跑出胶而出现缺带现象
DNA 样品的纯度和状态
是电压太大可能导致小片段跑出胶而出现缺带现象 DNA 样品的纯度和状态注意样品中含盐量太高和含杂质蛋白均可以产生条带模糊和条带缺失的现象。
乙醇沉淀可以去除多余的盐,用酚可以去除蛋白。
注意变性的 DNA 样品可能导致条带模糊和缺失,也可能出现不规则的 DNA 条带迁移。
在上样前不要对 DNA 样品加热,用 20mM NaCl缓冲液稀释可以防止 DNA 变性。
DNA 的上样
正确的 DNA 上样量是条带清晰的保证。
注意太多的 DNA 上样量可能导致DNA 带型模糊,而太小的 DNA 上样量则导致带信号弱甚至缺失。
TIANGEN 公司DNA 分子量标准每次上样 6ul 即可得到清晰均匀的条带。
Marker 的选择
DNA 电泳一定要使用 DNA Marker 或已知大小的正对照 DNA 来估计 DNA 片段大小。
Marker 应该选择在目标片段大小附近 ladder 较密的,这样对目标片段大小的估计才比较准确。
TIANGEN 公司的 DNA Marker条带清晰, 亮度均匀, 质量稳定,是您实验的首选。
需要注意的是 Marker 的电泳同样也要符合 DNA 电泳的操作标准。
如果选择λDNA/HindIII或者λDNA/EcoRI的酶切 Marker ,需要预先 65℃加热
5min ,冰上冷却后使用。
从而避免 HindIII 或 EcoRI 酶切造成的粘性接头导致的片
段连接不规则或条带信号弱等现象。
凝胶的染色和观察
实验室常用的核酸染色剂是溴化乙啶(EB ,染色效果好,操作方便,但是稳定性差, 具有毒性。
而其他系列例如 SYBR Green, GelRed , 虽然毒性小, 但价格昂贵。
TIANGEN 公司的 GeneGreen 相比则是性价比高的低毒替代染料, 其灵敏度比传统EB 染料高 10倍以上。
注意观察凝胶时应根据染料不同使用合适的光源和激发波长, 如果激发波长不对, 条带则不易观察, 出现条带模糊的现象。
步骤如下:
1. 制备 1%琼脂糖凝胶 (大胶用 70ml, 小胶用 50ml: 称取 0.7 g(0.5 g琼脂糖置于锥形瓶中 , 加入 70 ml(50ml1×TAE, 瓶口倒扣小烧杯 . 微波炉加热煮沸 3次至琼脂
糖全部融化 , 摇匀 , 即成 1.0%琼脂糖凝胶液 .
2. 胶板制备 :取电泳槽内的有机玻璃内槽 (制胶槽洗干净 , 晾干 , 放入制胶玻璃板 . 取透明胶带将玻璃板与内槽两端边缘封好 , 形成模子 . 将内槽置于水平位置 , 并在固定位置放好梳子 . 将冷却到 65℃左右的琼脂糖凝胶液混匀小心地倒入内槽玻
璃板上 , 使胶液缓慢展开 , 直到整个玻璃板表面形成均匀胶层 . 室温下静置直至凝胶完全凝固 , 垂直轻拔梳子 , 取下胶带 , 将凝胶及内槽放入电泳槽中 . 添加
1×TAE 电泳缓冲液至没过胶板为止 .
3. 加样 :在点样板或 parafilm 上混合 DNA 样品和上样缓冲液 , 上样缓冲液的最终稀释倍数应不小于 1X. 用 10 ul 微量移液器分别将样品加入胶板的样品小槽内 , 每加完一个样品 , 应更换一个加样头 , 以防污染 , 加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶
面 .(注意 :加样前要先记下加样的顺序 .
4. 电泳 :加样后的凝胶板立即通电进行电泳 , 电压 60-100V, 样品由负极 (黑色向正极 (红色方向移动 . 电压升高 , 琼脂糖凝胶的有效分离范围降低 . 当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约 1cm 处时 , 停止电泳 .
(5电泳完毕后 , 取出凝胶 , 用含有 0.5 ug/ml的溴化乙锭 1×TAE 溶液染色约 20 min,再用清水漂洗 10 min.
(6观察照相 :在紫外灯下观察 ,DNA 存在则显示出红色荧光条带 , 采用凝胶成像系统拍照保存 .。