细胞重组与克隆技术

第7章细胞重组与克隆技术

主要内容：7.1细胞重组7.2克隆技术

7.1 细胞重组

7.1.1 细胞重组的定义

细胞重组（Cell Reconstruction）,又称细胞拆合是指从活细胞中分离出细胞器及其组分，然后在体外一定条件下将不同细胞来源的细胞器及其组分进行重组，使其重新装配成为具有生物活性的细胞或细胞器的一种实验技术。

在探讨真核细胞的起源时。马吉利斯(MaRdls)曾于1972年提出了内共生学说：真核细胞起源于原核细胞，是几个原核细胞共生结合的结果。如蓝阴滴虫，细胞内含叶绿体，就是蓝藻在阴滴虫内共生的结果；绿草履虫体内的绿色物体，就是与之共生的一种小球藻。

这种不同细胞的结合过程类似于细胞的自然装配。

细胞的生长过程包含着细胞器的自我装配，但这是一种活体的自我装配，而细胞重组则是离体的装配过程。

7.1.2 细胞重组的意义

细胞重组技术是现代生物工程中的热点课题，细胞重组与细胞融合技术是细胞工程中的细胞或细胞器水平上主要构建手段，它与基因转移技术、干细胞技术等结合，可以人为地获得新物种或使细胞表达新的性状和新的产物。

7.1.3 细胞重组技术发展概况

7.1.4 几个重要概念

胞质体(Cytoplast)：是指除去细胞核后由膜包裹的无核细胞。

微细胞(Microcell)：是指只有一条或几条染色体和一薄层细胞质，外面包裹一层完整的细胞质膜的核质体。

核体(Karyoplast)：是指与胞质分离得到的细胞核，带有少量胞质并围有质膜，称为核体。

7.1.5 细胞重组的方式

胞质体(Cytoplast)：与完整细胞重组形成胞质杂种(Cybrid)。

微细胞(Microcell)：与完整细胞重组形成微细胞异核体(Heterokaryon)。

胞质体与核体(Karyoplast)：重新组合形成重组细胞。

7.1.6 细胞重组技术

1、显微操纵术

一般是在显微解剖镜下，把细胞放入消毒的培养液中，同时放入冷却系统中以减慢细胞发育，然后借助一台专门的装置——显微操作仪，用细微玻璃针或用微细管、微电极、微热电偶等斜插入细胞中去，可以挑取细胞核，人工造就去核细胞；也可以进一步作移核实验与电生理实验。

用这种仪器能够进行细胞各部分的解剖、细胞各部分物质的抽取和移植、各物质的注入、

测量微电位的变化等等。

意义:

1、实现细胞的拆合

2、为研究细胞内的基因表达与调控和改良动物品种提供了一种重要手段。

2、细胞分离技术

分离细胞主要是根据细胞本身的某些特殊性质来选择合适的分离技术来分离具有同一性状的细胞群、这些性质包括：细胞大小、密度、表面电荷、表面标志、细胞中一个或多个成分的荧光强弱、细胞对其他介质的吸附作用

经常采用的细胞分离方法如下：

（1）差速离心（differentialcentrifugation）

在密度均一的介质中由低速到高速逐级离心，用于分离不同大小的细胞和细胞器

在差速离心中细胞器沉降的顺序依次为：核、线粒体、溶酶体与过氧化物酶体、内质网与高基体、最后为核蛋白体。（速度升高，样品按大小先后沉淀）

由于各种细胞器在大小和密度上相互重叠，而且某些慢沉降颗粒常常被快沉降颗粒裹到沉淀块中，一般重复2～3次效果会好一些。

差速离心只用于分离密度和大小悬殊的细胞，更多用于分离细胞器。对于精细的分离，则是密度梯度离心效果更好。

（2）梯度沉降分离法

主要是根据细胞大小不同分离细胞、细胞在单位重力作用下，通过密度介质、或在低离心力作用下通过梯度密度溶液沉降，由于细胞大小不同，沉降速度不同。细胞大，沉降快。

常采用适当的分离介质形成一定的梯度密度溶液．这此介质主要有：血清、蔗糖等：（3）等密度沉降分离法

主要是根据细胞密度差异来分离细胞。

细胞在连续密度梯度分离介质中、受强离心力的作用，最后到达与其密度相同的分离介质层面，并保持平衡。

如果是非连续密度梯度介质中，细胞主要集中在介于其自身密度的两种密度介质交界面上，从而达到分离的目的。

目前常采用的分离介质有蛋白等。密度分离剂应该具有无刺激，对细胞无吸附作用，产生的渗透压小等特点

（4）流式细胞仪分离法

这种方法是以免疫荧光法使荧光抗体与细胞膜表面抗原结合，然后用超声波处理使其分散成单个细胞，再将细胞悬浮液通过一个直径为50um的喷嘴变成极细小的微滴，每个微滴一般含有一个细胞，以l0m/s的速度喷出。经激光照射是细胞上所带荧光被激发而转换成脉冲．通过测定脉冲数就可以换算出各种不同细胞表面抗原的情况。同时由于悬浮微滴中的细胞带有不同程度的负电荷，这样在施加电场后。移行偏斜的程度不同，而不带电荷的细胞仍以直线流过、借此可以收集得到不带电荷或带电荷多少不同的各种细胞。

这种方法优点是分离速度快，分离得到的细胞仍能保持其功能；缺点是需要专门的设备。

3、细胞破碎方法

细胞器的分离需要将组织细胞破碎，常用的方法有：超声波破碎法；反复冻融法；化学裂解法；高速组织捣碎法。

（1）超声波破碎法

原理是：超声波发生器产生高强度超声信号，经换能器传送至与其接触的细胞溶液中，由声波冲击和振动产生的剪切力使细胞破碎。

缺点是破碎过程中会产热，应该注意冷却。有些生物大分子不宜采用。

（2）反复冻融法

使细胞溶液或组织细胞浆在超低温冰箱或液氮罐内冻结后，在37℃复温融化，重复3-4次操作使细胞壁破碎。

（3）化学裂解法

在细胞悬浮液中加入某些化学物质如十二烷基硫酸钠等使细胞膜裂解。在使用该方法的同时常要辅助以一些机械的方法才能使细胞在短时间内完全破碎；由于化学裂解剂会干扰分析，在细胞裂解后应注意清除化学裂解剂。

（4）高速组织捣碎法

主要借助高速组织捣碎机使细胞被高速旋转的叶片破碎。

由于也会发热，可能导致分离物的降解，因此不能时间过长．必要时可使用循环水冷却

4、细胞器分离方法

为了研究细胞内某种细胞器的生化组成、生理功能，或用于细胞重组，常需大量采集细胞的某些组分。常用的方法有：研磨、超声振荡和低渗等将组织制成匀浆，细胞中的一些亚组分就从细胞中释放出来。然后采用以上介绍的沉降分离法实现分级分离。

【实验】细胞器分离、制备与观察

【目的】（1）掌握分离制备动物细胞线粒体的方法。（2）对分离得到的线粒体进行活性鉴定。【原理】线粒体（mitochondria）是真核细胞特有的，司能量转换的重要细胞器。细胞中的能源物质——脂肪、糖、部分氨基酸在此进行最终的氧化，并通过耦联磷酸化生成ATP，供给细胞生理活动之需。

将动植物组织制成匀浆，在适当的悬浮介质中用差速离心法可以分离细胞线粒体。在一定的离心场中(选用离心机的一定转速)，球心颗粒的沉降速度取决于它的密度、半径和悬浮介质的黏度。在一均匀悬浮介质中离心一定时间，组织匀浆中的各种细胞器及其他内含物由于沉降速度不同将停留在高低不同的位置。依次增加离心力和离心时间，就能够使这些颗粒按其大小、轻重分批沉降在离心管底部，从而分批收集。

细胞器沉降先后顺序是细胞核、线粒体、溶酶体和其他微体、核糖体和大分子。

悬浮介质通常采用缓冲的蔗糖溶液，它较接近细胞质的分散相，在一定程度上能保持细胞器的结构和酶的活性；

pH7.2的条件下；亚细胞组分不容易重新聚集成团，有利于分离。

整个操作过程样品要保持在0℃~4℃，避免酶失活。

细胞器标记酶的测定是评价细胞器内膜组分和分离纯度的主要依据，如线粒体内膜上分布有细胞色素氧化酶，该酶使詹纳斯绿B染料保持在氧化状态呈现蓝绿色从而使线粒体显色，而胞质中的染料被还原成无色。

******************************************************************************* 举例：鼠肝线粒体的分离

1．制备肝细胞匀浆：

实验前将鼠空腹12小时，击头处死，剖腹取肝，迅速用生理盐水洗净血水，用滤纸吸干水，称取肝组织2g，剪碎；用预冷的0.25 mol／L蔗糖溶液洗涤数次。然后按每克肝加4.5 mL 预冷的0.25 mol／L蔗糖溶液的量，分数次添加蔗糖溶液，在0~4℃冰浴中用玻璃匀浆器将肝制成匀浆，用双层纱布过滤。