南美白对虾虾头中虾青素的提取工艺及稳定性

南美白对虾虾头中虾青素的提取工艺及稳定性张婧;商建伟;贺瑶;王连杰;李钰金;胡增淼;林洪;毛相朝【摘要】以嗜热链球菌发酵虾头后的固体产物为原料提取虾青素,研究了乙醇提取纯化虾青素的条件,并对所提取的虾青素的稳定性进行了分析.实验结果表明,最优提取条件为用乙醇以固液比1∶6(m/V)于30℃下提取60 min.最优皂化方案为1 mol/L的氢氧化钠甲醇皂化液在4℃下恒温皂化12 h.以正己烷、二氯甲烷和丙酮(5∶2∶2,V/V/V)为流动相过柱纯化,可以得到较优的虾青素纯品.虾青素提纯液在高温下不稳定;对日光或紫外光不稳定,对室内光或避光较稳定;Mg2+、Na+和Ca2+对虾青素的破坏较小,Zn2+、Cu2+、Fe2+和Fe3+对虾青素的破坏较为严重;VE、Na2SO3和Vc对虾青素都有一定的保护作用,其中VE的保护作用最为明显.本研究优化了从南美白对虾中回收虾青素的方法,对其他甲壳类下脚料的综合利用具有一定的参考价值.【期刊名称】《中国渔业质量与标准》【年(卷),期】2014(004)001【总页数】10页(P43-52)【关键词】虾青素;提纯;稳定性;虾头;嗜热链球菌【作者】张婧;商建伟;贺瑶;王连杰;李钰金;胡增淼;林洪;毛相朝【作者单位】中国海洋大学食品工程与科学学院,山东青岛266003;中国海洋大学食品工程与科学学院,山东青岛266003;中国海洋大学食品工程与科学学院,山东青岛266003;中国海洋大学食品工程与科学学院,山东青岛266003;泰祥集团,山东省海洋食品营养研究院,山东荣成264309;泰祥集团,山东省海洋食品营养研究院,山东荣成264309;中国海洋大学食品工程与科学学院,山东青岛266003;中国海洋大学食品工程与科学学院,山东青岛266003【正文语种】中文【中图分类】S98虾青素(astaxanthin，3，3＇ -二羟基-4，4＇ -二酮基-β，β＇ -胡萝卜素，分子式为C40H52O4)是发现于包括虾在内的许多水生动物体内的一种类胡萝卜素［1］，呈艳丽红色，为脂溶性，具有高效抗氧化、抗癌变和增强免疫等功能［2-3］。

经调查，目前天然的虾青素市场价格为1 600 元/g，市场上供不应求，应用前景十分广阔。

中国虾类资源极为丰富，多用于加工虾仁粗产品，并冷冻出口。

在加工生产过程中，占虾体重30% ～40%的虾头将被剔除，据报道，每年生产虾头下脚料50 万t 以上［4-7］。

在之前的研究中，虾头废物的利用具有局限性，主要由于它易腐烂，并且生产受季节性限制，产品在使用之前通常会发生分解。

所以大部分废物被丢弃或者用酸碱处理，造成了资源浪费和环境污染问题［8］。

探索环保节能的回收虾青素的方法，对甲壳类加工下脚料的综合利用具有重要的意义。

目前从甲壳类下脚料中提取虾青素的方法主要有以下4 种:碱提法、油溶法、有机溶剂法以及超临界CO2 流体萃取法。

碱提法主要是运用碱液脱蛋白的原理，当用热碱液处理甲壳类下脚料时，可将结合的蛋白质和虾青素水解出来，从而达到提取虾青素的目的［9］。

油溶法是根据虾青素良好的脂溶性这一特性进行的［9］。

油提取的温度一般较高(60 ～90 ℃)，高温会影响虾青素的稳定性，另外提取后含色素的油不易浓缩，产品浓度不高，应用范围受到限制。

有机溶剂是提取虾青素的有效试剂，提取后可将溶剂蒸发，进而浓缩虾青素，得到浓度较大的虾青素油。

同时溶剂也可回收循环利用。

常见的溶剂有丙酮、乙醚、乙醇、氯仿、石油醚和正己烷等，其中丙酮的提取效果最佳［10-11］。

但是像丙酮等这类有机溶剂，易挥发，沸点低，且有一定的毒性，加工过程中存在健康与安全问题，在实际应用中受到一定的限制。

超临界流体萃取技术是近几年发展起来的高新技术，其可以得到高品质的产品。

但由于设备前期投资大、成本高和生产技术要求高，目前用于大规模工业生产尚存在一定的困难［10］。

本研究利用嗜热链球菌发酵虾头下脚料，以发酵后产物为原料。

利用无毒可回收的乙醇提取虾青素，探索提取纯化方法并将其进行优化。

研究各种因素对其稳定性的影响。

以最优提取纯化方案获取虾青素并寻求合理的贮藏条件，减少再利用过程中色素的损失。

1 材料与方法1.1 原料与预处理新鲜南美白对虾(Litopenaeus vannamei)虾头来自于海南高远食品有限公司。

将新鲜虾头切碎至2 ～10 mm，冷藏备用。

嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)菌株(本实验室保藏)，用MRS 培养基活化培养24 h。

发酵条件如下:以总重量为100%计，10%虾头中加入5%葡萄糖，接种量5%，蒸馏水80%，42 ℃发酵60 h。

发酵结束后将发酵液离心取固体部分，保藏备用。

1.2 试剂与仪器除高效液相色谱流动相为色谱纯外，其他试剂均为分析纯，水为蒸馏水;虾青素(Sigma)。

旋转蒸发器(RE52—99，上海亚荣生化仪器厂);循环水式多用真空泵(SHB—I，郑州长城科工贸有限公司);电子天平(PC230，梅特勤托利多仪器);高速离心机(TCL，长沙英泰仪器有限公司);恒温摇床(KHY-10，长沙湘仪离心机仪器);高效液相色谱仪(Agilent Technologies 1260 Infinity)。

2 实验方法2.1 实验流程图南美白对虾虾头素的提取工艺见图1。

图1 实验流程图Fig.1 Flow diagram of the process2.2 虾青素提取方法的确定选取不同的提取技术，对经过发酵处理(方法见1.1)的虾残留固体进行处理，通过比较提取后的收率和提取质量，选取最优的提取方法。

所有提取方法所用的提取试剂均为无水乙醇。

2.2.1 索氏提取法称取15 g 发酵后固体(分为3 份，每份5 g)，用滤纸包好后装入250 mL 索氏提取器，依次加入200 mL无水乙醇，80 ℃水浴中各回流24 h，利用高效液相色谱法检测提取液中虾青素含量，取3 份的平均值，并计算提取率［12］。

2.2.2 超声法2.2.2.1 超声时间的单因素实验保持其他条件不变的情况下，超声提取10、30、50、70 和90 min。

利用高效液相色谱法检测提取液虾青素含量，取3 份的平均值，并计算虾青素得率。

确定最适的提取时间。

2.2.2.2 超声提取次数的单因素实验保持其他条件不变的情况下，用最适提取时间超声提取直到提取液为无色，利用高效液相色谱法检测提取液虾青素含量。

取3 份的平均值，并计算虾青素得率。

确定最适的提取次数。

2.2.2.3 超声法提取称取15 g 发酵后固体(分为3 份，每份5 g)，用无水乙醇浸泡，固液比为1︰20(m/V)，超声波的频率为40 kHz。

超声波提取2 次，每次超声波提取50 min，提取温度为25 ℃［13］。

超声结束后取提取液，利用高效液相色谱法检测提取液虾青素含量，取3 份的平均值，并计算提取率。

2.2.3 加热浸泡法2.2.3.1 加热提取次数的单因素实验称取15 g 发酵后固体(分为3 份，每份5 g)，用无水乙醇以固液比1︰6(m/V)在45 ℃下浸泡1 h，连续提取4 次，利用高效液相色谱法分别检测每次提取液虾青素含量，取3 份的平均值，并计算虾青素得率。

2.2.3.2 加热浸泡法提取称取15 g 发酵后固体(分为3 份，每份5 g)，用无水乙醇以固液比1︰6(m/V)在45 ℃下浸泡1 h，重复提取2 次，合并提取液。

利用高效液相色谱法检测提取液虾青素含量［14］，取3 份的平均值，并计算提取率。

2.3 优化提取方法经过上述实验，得出加热浸泡法效果最佳。

通过正交实验法优化，以确定最适提取时间、提取温度和固液比。

正交试验的浸提温度选择30、45 和60 ℃;浸提时间选择30、45 和60 min;固液比选择1︰3(m/V)、1︰6(m/V)和1︰9(m/V);每组实验重复3次，提取结果利用高效液相色谱法进行分析，取平均值。

2.4 虾青素的纯化优化2.4.1 皂化反应将提取溶液浓缩后加入等体积甲醇，再加入氢氧化钠-甲醇溶液充氮后低温皂化一定时间，再在常温下放置2 h 左右。

皂化后的溶液加入等体积蒸馏水和二氯甲烷，液液萃取，离心，将下层有机相取出，再用蒸馏水洗2 次以上，洗至pH 中性为止，旋转蒸发至10 mL，待过柱。

2.4.2 优化皂化反应条件综合碱浓度、皂化温度和皂化时间对皂化结果的影响［15-16］，设计正交实验，确定最佳皂化工艺。

皂化碱浓度选择0.5、1.0 和1.5 mol/L，皂化温度选择4、10 和16℃，皂化时间选择4、8 和12 h。

收集得到不同二氯甲烷相，用高效液相色谱法测定其游离的虾青素浓度。

比较不同皂化工艺得到的游离虾青素含量，以最高的为最优皂化条件。

2.4.3 原料对照采用未发酵的虾头为原料，利用最优的提取条件和最适的皂化工艺获得虾青素，用高效液相色谱法测定游离的虾青素浓度。

2.4.4 薄层层析法选取最优流动相用玻璃毛细点样管将样品溶液点到薄层硅胶板下端距边缘约1.0 cm 处，待样品溶液干后，将薄层板斜放到装有少量展开剂的层析缸中展开。

等到展开剂前沿接近硅胶板上端，拿出硅胶板，放在空气中，待展开剂挥发，目视。

通过对不同极性的溶剂介质展开效果和展开时间的比较，选择最优的流动相。

本实验设计了4 组有机试剂组合:二氯甲烷-乙酸乙酯、正己烷-丙酮-二氯甲烷、石油醚-丙酮、正己烷-乙醚。

根据溶剂不同体积比调节展开剂的极性强弱，通过不同极性强弱的展开剂对同一种样品展开效果即比移值(Rf)和分离的样品个数进行比较，从而选出最好的展开剂方案［17］。

2.4.5 柱层析分离纯化取80 g 300 ～400 目硅胶，预先用洗脱液浸泡过夜。

填柱后，上样10 mL 匀速洗脱过柱。

收集虾青素层。

2.5 虾青素的稳定性研究［18 -19］2.5.1 光源对虾青素溶液稳定性的影响取以乙醇为溶剂的虾青素提纯溶液各2 mL，分别置于太阳光可照射处、紫外光可照射处、室内自然光可照射处、灯光可照射处以及完全避光处。

静置12 h 后，测虾青素含量。

3 次重复，取平均值并计算留存率。

2.5.2 温度对虾青素油溶液稳定性的影响取用乙醇为溶剂的虾青素提纯溶液各2 mL，分别置于10、20、30、40、50、60、70 和80 ℃下避光恒温水浴锅5 h。

测虾青素含量。

3 次重复，取平均值并计算留存率。

2.5.3 金属离子对虾青素油溶液稳定性的影响取用乙醇为溶剂的虾青素提纯溶液各2 mL，分别加入1 mg Mg2+、Na+、Zn2+、Ca2+、Cu2+、Fe2+ 和Fe3+金属离子的硫酸盐。

振荡混合，室温(20 ℃)下置于室内阴暗处，2 d 后测虾青素含量。

3 次重复，取平均值并计算留存率。

2.5.4 还原剂对虾青素溶液稳定性的影响取用乙醇为溶剂的虾青素提纯溶液各2 mL，分别以30 和60 mg/mL 的添加量加入Na2SO3、VC 和VE。