免疫组化抗原修复技术新进展_姚梅宏

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临床与实验病理学杂志 J Clin Exp Pathol 2013 May; 29( 5)
免疫组化抗原修复技术新进展
·综 述·
姚梅宏，郑智勇
摘要： 抗原修复是影响免疫组化染色结果的重要因素，现已 广泛应用于病理学和形态学研究领域。基于抗原修复的蛋 白质组学研究，有助于从福尔马林固定石蜡包埋组织中提取 蛋白质，为个性化医疗中相关分子生物标记物的应用建立实 用而先进的平台。该文现对抗原修复的机制与其在细胞或 组织样品的制备、免疫组化的标准化以及蛋白质组学等方面 的应用进行综述。 关键词： 抗原修复； 免疫组织化学； 组织病理学； 细胞病理学； 蛋白质组学； 文献综述 中图分类号： R 365 文献标志码： A 文章编号： 1001 － 7399（ 2013） 05 － 0544 － 04
多数情况下经福尔马林固定和 AR 处理后得到的 IHC 信号更强、背景更少、形态更佳。在冷冻组织切片的 IF 和 IHC 染色过程中经常发生的非特异性背景染色，经 AR 处理 后也明显减少。现今 AR-IHC 染色结果作为“金标准”的事 实已逐渐被接受，但在使用 FFPET 切片时应尽可能采用独 立客观的生化方法，如蛋白质印迹（ Western blot） 分析，来验 证不同样品制备条件下的抗体性能。 2． 3 IF 染色 随着新染料的开发及 IF 在图像分析定量测 量和光谱成像显微镜的多重标记上的优势，近日掀起了 IF 法在 FFPET 中 的 应 用 高 潮。经 证 实 AR 作 为 增 强 FFPET IHC 抗原性 的 程 序，具 有 减 少 非 特 异 性 自 体 荧 光 的 优 势。 Long 等［17］运用配伍试验法检测 3 种缓冲溶液（ 100 mmol / L Tris，pH 10； 0. 05% 柠康酸酐； 含 2 mmol / L EDTA 的 10 mmol / L 柠檬酸和 0. 05% 吐温 20，pH 6. 2） 经微波炉加热 AR，均得 到令人满意的 IF 染色结果。
酸的组成及顺序是决定 AR 是否成功的重要因素。此外， Kakimoto 等［5］在新鲜未固定的大鼠子宫组织切片的 IHC 染 色和大鼠蛋白质提取物点杂交的研究基础上，提出 AR 的补 充机制。他们推测蛋白质抗原自身的天然空间障碍使抗体 与相应抗原表位的接触受限，新鲜蛋白质也不例外。Fowler 等［6］在此基础上提出线性表位模型，指出一些蛋白质经福尔 马林固定后，三级结构发生改变并形成熔球蛋白； 经热诱导 AR 处理后，蛋白质发生不可逆的变性，从而获得线性表位。
收稿日期： 2012 － 12 － 17 作者单位： 南京军区福州总医院病理科，福州 350025 作者简介： 姚梅 宏，女，硕士研 究生。Tel： （ 0591 ） 24937095，E-mail：
ymeih0925@ sina． cn 郑智勇，男，教授，主任医师，硕士生导师，通讯作者。 Tel： （ 0591） 24． com
临床与实验病理学杂志 J Clin Exp Pathol 2013 May; 29( 5)
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色结果。这些实验结果表明 AR-ICC 染色程序的标准化势 在必行，应根据各种重要抗体检测的配伍试验，建立最佳 AR 方案，而非使用单一 AR 方案。 2． 1． 2 AR 在风干细胞涂片中的应用 研究证实 AR 在存 档细胞学涂片 ICC 染色中的重要价值。Fulciniti 等［14］比较 乙醇湿固定和福尔马林后固定的风干细胞涂片，发现后者经 AR 处理可提供可靠的 ICC 染色结果和更好的细胞形态。 2． 1． 3 细胞样本的扩大利用 随着 ICC 的应用与发展，细 胞块和细胞移植技术逐渐被应用于细胞病理学的标准化进 程中。根据 ICC 的目的，石蜡包埋细胞块被认为是最理想的 样本。细胞块模 拟 手 术 病 理 标 本，按 相 似 的 方 式 处 理 和 存 储，使用类似的抗原修复、IHC 方案和抗体组合进行染色，提 供优于大多数细胞涂片的 ICC 染色结果［11］。因此，建议当 细胞样本足够时首选该技术进行 ICC 分析。研究者还提出 在细胞块材料不足的情况下，可运用以刮除涂片上深染的组 织片段为特点的细胞刮除（ Cytoscrape） 法［15］，其允许在有限 的涂片上进行多重免疫染色。细胞移植技术提供另一个在 有限涂片上进行多重细胞 IHC 检测方法。近年来出现的多 重免疫染色芯片（ MI 芯片） 能够在 1 张组织切片上检测多达 50 个标记物，但其实用价值仍有待评估。随着 AR 技术在 ICC 中的不断应用，FFPET 的 IHC 染色结果更具可比性，也 提高了细胞病理学诊断的实用性。这两个领域的改进，尤其 是控制和标准化方面，仍有很大空间。 2． 2 冷冻切片 最近，热诱导 AR 技术已成功应用于冷冻 细胞 / 组织切片。Shi 等［16］比较丙酮固定和甲醛固定的冷冻 组织切片上 26 种抗体的检测结果，其中 16 种抗体经丙酮固 定和甲醛固定的 IHC 染色结果相近，8 种抗体经甲醛固定及 AR 处理后呈现更佳的 IHC 信号，只有 2 种抗体经丙酮固定 得到的 IHC 染色结果更好。他们发现大多数胞质蛋白经丙 酮固定和甲醛固定的 IHC 信号相似，但核蛋白经甲醛固定 和 AR 处理后得到更强的 IHC 信号。
1 AR 的机制
目前对 AR 技术的对其作用机制仍缺乏全面了解。多 数研究者认为，通过加热打开甲醛诱导的交联可能是 AR 的 核心机制，最新的研究对此展开进一步阐述。Mason 等［3］实 验证明牛胰核糖核酸酶 A（ RNase A） 样本经福尔马林固定所 导致的化学效应在加热处理后得到逆转，从而恢复免疫反应 性。他们认为蛋白质甲醛加合物及其交联的逆转是 AR 技 术成功的基础。Bogen 等［4］也进行类似的实验，发现组织经 福尔马林处理后，大多数的独立多肽抗原表位并未失去免疫 反应性； 若加入不相干的蛋白质，其免疫反应性则消失，但经 热诱导 AR 处理后，其免疫反应性可恢复。由此得出结论， 甲醛诱导的蛋白质交联阻断多肽抗原表位，而抗原表位氨基
加热抗原修复（ heat-induced-antigen retrieval，AR） 技术 是免疫组化（ immunohistochemistry，IHC） 发展史上的重要里 程碑［1］，其既能保留福尔马林固定石蜡包埋组织 （ formalinfixed paraffin-embedded tissue，FFPET） 良好的组 织 学 形 态， 又明显提高 抗 原 的 检 出 率，提 供 良 好 的 IHC 染 色 结 果［2］。 AR 技术在 FFPET 分子提取方面的应用，使蛋白质组学与 IHC 在分子形态学方法上相结合，这很可能成为 AR-IHC 进 一步研究的重点。本文主要归纳近 5 年 AR 技术在 IHC 中 应用的新进展，并对当前面临的挑战和今后研究的主要方向 进行探讨。
2 AR-IHC 的扩展应用
以下对近年来 AR 技术在细胞病理学、冷冻切片和免疫 荧光（ immunofluorescence，IF） 中的应用进行回顾。 2． 1 细胞病理学 Fowler 等［11］ 强调免疫细胞化学（ immunocytochemistry，ICC） 在细胞病理学中的应用面临着两大挑 战： （ 1） 缺乏适当的控制样本； （ 2） 造成不适当抗体浓度的频 繁使用。为了准确比较，ICC 的控制必须从相同的细胞学标 本制备方法开始，但是大多数病理实验室缺乏建立合适的细 胞控制体系的资源和能力，这成为解决该问题的重大实际障 碍。 2． 1． 1 AR 在细胞学涂片 ICC 中的应用 虽然 AR 技术越 来越多地应用于细胞病理学，大幅提高细胞学涂片 ICC 的灵 敏度，但标准化仍是急需解决的问题。Fetsch 等［12］ 运用单 一的热诱导 AR 方案，对 54 例转移性乳腺癌 FFPET 细胞块 切片上 3 种 主 要 的 HER2 抗 体 进 行 修 复，获 得 不 同 结 果。 Denda 等［13］证实经乙醇固定的细胞涂片的大部分抗体未经 AR 处理或经轻度热诱导 AR 处理，均可获得良好的 IHC 染
影响 AR 的因素主要包括修复的温度、加热的时间、热 源、抗原修复液的 pH 值和性质等。Yamashita 等［7］比较不同 pH 值的 SDS-PAGE 蛋白凝胶和抗原修复液，证实修复液的 pH 值和离子强度是影响 AR 的关键因素。Leong 等［8］的实 验结果表明： 对于石蜡包埋组织切片中无法表达或者染色弱 的抗体，可使 用 0. 05% 柠 康 酸 酐 作 为 抗 原 修 复 液。此 外， Syrbu 等［9］开发新型 FFPET IHC 染色的 AR 方法，主要特点 是将切片置于恒热（ 97 ℃ ） 的 Tris-EDTA-SDS 缓冲液 40 min 行脱蜡处理，同时能够更有效地扭转福尔马林固定造成的各 种抗原改变，还可减少初级抗体的用量。O’Leary 等［10］提出 AR 技术未来的研究方向，着眼于两个要点： （ 1） FFPET 蛋白 质天然空间构象的恢复； （ 2） 恢复的蛋白质数量及功能状态 评估的新技术。AR 技术的进一步发展需建立在对其分子机 制科学认知的基础上，应致力于改进细胞或组织样品制备、 AR-IHC 标准化和蛋白质组学中核酸或蛋白质提取的主要途 径。
3 FFPET 块中提取核酸和蛋白质
近年来，特别是热诱导 AR 方法被接受以后，已成功从 FFPET 块中提取出核酸和蛋白质。 3． 1 DNA 虽然从新鲜的冷冻组织切片中提取 DNA 比从 FFPET 切片中提取 DNA 易获得更好的结果，但在基于阵列 的比较基因组杂交的研究中［21］，运用热诱导 AR 方案从 FFPET 切片中提取 DNA，所获得的 DNA 质量和数量却与传统 提取方法接近，甚至更佳。在未来的研究中，我们应致力改 进基于 AR 的提取方案，尽可能消除因 FFPET 产生的 DNA 序列改变所造成的错误。 3． 2 RNA 研究证明，大多数 RNA 可从正确处理的档案组 织样本中提取获得，经缓冲液加热修复后，可用于合成 cDNA 和 RT-PCR 等。其中，RT-PCR 技术不仅可用于扩增提取 的小片段 RNA，还可用于比较不同实验组的结果。最近，Shi 等［21］分别从冷冻和 FFPET 处理、固定时间从 6 h ～ 30 天的 细胞模型中成功提取出 mRNA。运用加热或酶消化 AR 方 案，从固定长达 7 天的 FFPET 中提取获得的 RNA 具备足够 数量和质量用于 RT-PCR 试验，经扩增得到 461 bp 片段。 3． 3 蛋白质 以 AR 原则为基础，FFPET 切片高温加热提 取蛋白质的方案现已被广泛采用，而且大部分蛋白质提取的 商业试剂的设计也源于热诱导 AR 技术。 3． 3． 1 FFPET 蛋白质提取的重要因素 大多数研究者强调 高温加热是蛋白质提取的关键因素。Jiang 等［22］ 分别采用 加热和非加热方案从 FFPET 中提取蛋白质，经对比证实加 热样品提取获得的蛋白质浓度明显高于非加热样品。目前， 应用于 AR 加热过程的化学物质种类繁多，SDS 已被证实是 FFPET 蛋白质有效提取的关键化学物质。Fowler 等［23］模拟 FFPET，设计“组织代用品”检测蛋白质的提取效率，发现最 有效的蛋白质提取液为含 2% SDS 的 20 mmol / L Tris-HCl。 此外，Hatakeyama 等［24］提出新型蛋白质的提取方法，使用微 型室进行 AR，再利用质谱鉴别从 FFPET 中提取所得的蛋白 质。实验结果表明热诱导 AR 不仅能提高蛋白质的鉴定，也 有利于在合适的抗原修复液中洗脱蛋白质。 3． 3． 2 FFPET 蛋白质提取的关键问题 除加热以外，FFPET 切片在加热过程中溶解的有效性也是提高蛋白质提取 效率的关键问题之一。Fowler 等［25］在 45 000 Pa 高压条件 下，证实静水压力的增加能够增强热处理效果，明显提高蛋 白质的提取效率和甲醛诱导的蛋白质修饰的逆转。同理，一 些机械程序，如马达驱动的杵和超声均有助于 FFPET 切片 的同质化，获得较高的蛋白质产量。