间接免疫荧光法检测ANA标准操作程序
抗核抗体临床检测程序的
抗核抗体临床检测程序的建立及其结果报告与解释李金明卫生部临床检验中心抗核抗体（ANA）l泛指针对细胞核及其组成成分的抗体，通常以较高滴度存在于自身免疫病患者血液中，是自身免疫病诊断、治疗监测、预后等的重要指标，其包括由间接免疫荧光法（Indirect immunofluorescence, IIF）检测的ANA、抗双链DNA、抗Sm 、抗组蛋白、抗Scl-70、抗U1 RNP和抗Jo-1抗体等，这些抗体也是国内临床实验室目前应用较为广泛的自身抗体检测指标ANA检测方法l基于HEp-2细胞的间接免疫荧光法（IIF）l酶联免疫吸附试验（ELISA）l全自动免疫化学发光测定l联合HEp-2细胞上IIF的近经红外成像系统（near-infrared imaging ，NII)l多重荧光微球免疫测定l免疫胶体金传感器l使用非HEp-2细胞的间接免疫荧光法l免疫印迹法（LIAs)则可以作为确认实验。
抗核抗体间接免疫荧光类型名称的标准化l均质型（Homogeneous pattern）l核周型(Rim pattern)和纤维型(Fibrillar pattern)l斑点型（Speckled patterns）（包括染色体阴性细小斑点型和粗斑点型、染色体阳性离散斑点型）l核仁型（Nucleolar pattern）l独特的类型（Unique Patterns）（染色体阳性纺锤体型、假着丝点型、中间体型、中心粒型、增殖细胞核抗原型、抗核膜抗体型l胞浆型（Cytoplasmic Patterns）（线粒体型、高尔基体型、溶酶体型、核糖体型和细胞骨架型）NCCLS I/LA2-A检测程序的标准化•NCCLS I/LA2-A•Hyoun-Ah Kim, et al. Korean J Intern Med 2009;24:76-79•周仁芳等。
中华检验医学杂志2009，32：抗核抗体（ANA）检测的临床意义l用于系统性类风湿疾病的筛查和诊断。
间接免疫荧光讲ppt课件
3. 为了保证荧光染色的正确性，首次试验时需设置下述对 照，以排除某些非特异性荧光染色的干扰。 • 标本自发荧光对照：标本加1-2滴0.01mol/L，pH7.4的PBS 。 荧光标记物对照：PBS+荧光标记物 • 特异性对照（抑制试验）：标本加未标记的特异性抗体， 再加荧光标记的特异性抗体。 阴性对照：阴性血清+荧光标记物 阳性对照：已知的阳性标本加荧光标记的特异性抗体。 阳性对照：阳性血清+荧光标记物 如果标本自发荧光对照和特异性对照呈无荧光或弱荧光， 阳性对照和待检标本呈强荧光，则为特异性阳性染色。 •
1. 对荧光标记的抗体的稀释，要保证抗体的蛋白有一 定的浓度，一般稀释度不应超过1：20，抗体浓度 过低，会导致产生的荧光过弱，影响结果的观察。
注意事项
2. 染色的温度和时间需要根据各种不同的标本及抗原 而变化，染色时间可以从10 min到数小时，一般30 min已足够。染色温度多采用室温（25℃左右）， 高于37℃可加强染色效果，但对不耐热的抗原（如 流行性乙型脑炎病毒）可采用0-2℃的低温，延长 染色时间。低温染色过夜较37℃30 min效果好的多 。
试剂与仪器
磷酸盐缓冲盐水（PBS）：0.01mol/L，pH7.4 荧光标记的抗体溶液：以0.01mol/L，pH7.4的PBS 进 行稀释 缓冲甘油：分析纯无荧光的甘油9份+/L，pH7.4的PBS 1500ml ）
有盖搪瓷盒一只（内铺一层浸湿的纱布垫）
3. 取出玻片，置玻片架上，先用0.01mol/L，pH7.4的 PBS冲洗后，再按顺序过0.01mol/L，pH7.4的PBS三 缸浸泡，每缸3-5 min，不时振荡。
4. 取出玻片，用滤纸吸去多余水分，但不使标本干燥， 加一滴缓冲甘油，以盖玻片覆盖。
间接免疫荧光讲ppt课件
• 阳性对照：已知的阳性标本加荧光标记的特异性抗体。
阳性对照：阳性血清+荧光标记物
如果标本自发荧光对照和特异性对照呈无荧光或弱荧光，
阳性对照和待检标本呈强荧光，则为特异性阳性染色。
.
7
4. 一般标本在高压汞灯下照射超过3min，就
有荧光减弱现象，经荧光染色的标本最好在 当天观察，随着时间的延长，荧光强度会逐 渐下降。
有盖搪瓷盒一只（内铺一层浸湿的纱布垫）
荧光显微镜、玻片架、滤. 纸、37℃温箱等。
3
实验步骤
1. 滴加0.01mol/L，pH7.4的PBS于待检标本片上， 10min后弃去，使标本保持一定湿度。
2. 滴加以0.01mol/L，pH7.4的PBS适当稀释的待检抗体
标本，覆盖已知抗原标本片。将玻片置于有盖搪瓷 盒内，37℃保温30min。
体。
.
2
试剂与仪器
磷酸盐缓冲盐水（PBS）：0.01mol/L，pH7.4
荧光标记的抗体溶液：以0.01mol/L，pH7.4的PBS 进 行稀释
缓冲甘油：分析纯无荧光的甘油9份+ pH9.2 0.2M 碳 酸盐缓冲液1份配制
搪瓷桶三只（内有0.01mol/L，pH7.4的PBS 1500ml ）
.
6
3. 为了保证荧光染色的正确性，首次试验时需设置下述对 照，以排除某些非特异性荧光染色的干扰。
• 标本自发荧光对照：标本加1-2滴0.01mol/L，pH7.4的PBS 。
荧光标记物对照：PBS+荧光标记物 • 特异性对照（抑制试验）：标本加未标记的特异性抗体， 再加荧光标记的特异性抗体。
阴性对照：阴性血清+荧光标记物
.
5
ANA检测
IMTEC ANA相关产品
ACR --ANA检测
100年前，保罗·艾尔利希首次提出“自身免疫”概念 60年前，ANA检测方法的诞生，临床免疫学的里程碑 ANA检测方法逐年更新，敏感性和特异性得以提高 2009年，将间接免疫荧光法（IIF）作为ANA检测的金标准 2014年，IIF法就已经被称为“参考方法” 2015年，Wener教授建议用特异性方法配合检测（ELISA 法或印迹法）
高滴度的自身抗体或ANAS的存 在预示着自身免疫性疾病的风险。 99% 以上的 SLE 患者在其病程的 某一阶段会表现为 ANAs 阳性。 最近一些研究发现，ANAs 和其 他一些自身抗体于 SLE 出现典型 临床症状 10 年之前即可被检测 到。
青少年 关节炎 狼疮
硬皮病
Sjögren’s 综合征
自身免疫性疾病
“5D”疾病
自身免疫性疾病研究背景
1854-1915年, Paul Ehrlich 用(“horror auto-toxicus”) 描述 自身免疫性疾病
1940年, Waaler 描述了一种 因子(之后发现是类风湿因子)
1948年, Hargraves et al. 发现红斑狼疮细胞, 巨噬细胞吞噬 变性细胞
蝶状红斑
网状青斑
光敏感
盘状狼疮伴脱发
硬腭溃疡
系统性红斑狼（SLE，Lupus） 临床诊断标准
1982年，美国 风湿学会提出 的分类标准
1997年，ACR 标准进行修改
2012年，最新 的 SLE 诊断标 准由 SLICC 工 作组所提出
多年来，SLE 的诊断主要围绕着一系列的临床症状和实验室指标。
Tonuttia E，Bassetti D，Piazza A，Visentini D，Poletto M， Bassetto F，Caciagli P，Villalta D，Tozzoli R，Bizzaro N.
免疫荧光技术操作步骤
免疫荧光技术操作步骤一. 直接免疫荧光法测抗原基本原理将荧光素标记在相应的抗体上，直接与相应抗原反应。
其优点是方法简便、特异性高，非特异性荧光染色少，相对使用标记抗体用量偏大。
试剂与仪器磷酸盐缓冲盐水（PBS）：0.01mol/L，pH7.4荧光标记的抗体溶液：以0.01mol/L，pH7.4 的PBS 进行稀释缓冲甘油：分析纯无荧光的甘油9 份+ pH9.2 0.2M 碳酸盐缓冲液1 份配制搪瓷桶三只（内有0.01mol/L，pH7.4 的PBS 1500ml）有盖搪瓷盒一只（内铺一层浸湿的纱布垫）荧光显微镜玻片架滤纸37℃温箱等。
实验步骤1. 滴加0.01mol/L，pH7.4 的PBS于待检标本片上，10min后弃去，使标本保持一定湿度。
2. 滴加适当稀释的荧光标记的抗体溶液，使其完全覆盖标本，置于有盖搪瓷盒内，保温一30min定时间（参考：30min）。
3. 取出玻片，置玻片架上，先用0.01mol/L，pH7.4 的PBS 冲洗后，再按顺序过0.01mol/L，pH7.4 的PBS 三缸浸泡，每缸3-5 min，不时振荡。
4. 取出玻片，用滤纸吸去多余水分，但不使标本干燥，加一滴缓冲甘油，以盖玻片覆盖。
5. 立即用荧光显微镜观察。
观察标本的特异性荧光强度，一般可用“+”表示：（-）无荧光；（±）极弱的可疑荧光；（+）荧光较弱，但清楚可见；（++）荧光明亮；（+++ --++++）荧光闪亮。
待检标本特异性荧光染色强度达“++”以上，而各种对照显示为（±）或（-），即可判定为阳性。
注意事项1. 对荧光标记的抗体的稀释，要保证抗体的蛋白有一定的浓度，一般稀释在1：20-100 之间，要自行摸索最佳梯度，建立最好的稀释比例，抗体浓度过低，会导致产生的荧光过弱，影响结果的观察。
2. 染色的温度和时间需要根据各种不同的标本及抗原而变化，染色时间可以从10 min 到数小时，一般30 min 已足够。
免疫荧光 标准方法
免疫荧光标准方法一、样品制备1. 选取适当的组织样品，用冷丙酮固定，并保存在-80°C。
2. 将样品切成5μm厚的切片，放置在载玻片上。
3. 用PBS漂洗切片，5分钟/次，共三次。
4. 用3%的H2O2在室温下处理切片10分钟，以消除内源性过氧化物酶活性。
5. 用PBS漂洗切片，5分钟/次，共三次。
6. 用0.1%的Triton X-100在室温下处理切片10分钟，以增加细胞膜的通透性。
7. 用PBS漂洗切片，5分钟/次，共三次。
二、免疫荧光染色1. 用5%的牛血清白蛋白(BSA)封闭切片，室温下放置30分钟。
2. 取出切片，用特异性一抗溶液封闭切片，4°C孵育过夜。
3. 用PBS漂洗切片，5分钟/次，共三次。
4. 用荧光二抗溶液封闭切片，室温下孵育1小时。
5. 用PBS漂洗切片，5分钟/次，共三次。
6. 用DAPI染色液染色核，室温下孵育5分钟。
7. 用PBS漂洗切片，5分钟/次，共三次。
8. 用抗荧光淬灭封片液封片，避免强光照射。
三、观察和记录1. 用荧光显微镜观察切片，记录荧光信号的位置、强度和分布情况。
2. 对每个样本至少观察三个不同的视野，并记录数据。
四、结果分析1. 根据荧光信号的位置、强度和分布情况进行分析。
2. 可使用图像分析软件进行定量分析。
3. 根据分析结果进行数据处理和统计。
五、标准化1. 采用阳性对照和阴性对照作为内标。
2. 阳性对照应呈现强烈的荧光信号，阴性对照应无荧光信号。
3. 对所有样本进行标准化处理，以保证结果的可靠性。
六、质量控制1. 实验过程中应避免交叉污染和样品间的干扰。
2. 对实验数据进行及时记录和分析，确保数据的准确性和完整性。
ana间接免疫荧光题
ana间接免疫荧光题
免疫荧光是一种常用的免疫学实验技术，用于检测和定位特定
抗原或抗体在细胞或组织中的分布情况。
而ana（抗核抗体）间接
免疫荧光是一种特定的免疫荧光实验，用于检测人体血清中是否存
在抗核抗体。
在ana间接免疫荧光实验中，首先需要制备出固定的细胞或组
织切片，这些切片上含有核抗原。
然后，将待测血清样本与这些切
片接触，如果血清中存在抗核抗体，它们会与切片上的核抗原结合。
接着，通过加入荧光标记的二抗（抗人类免疫球蛋白抗体）来检测
这些抗体的存在。
最后，使用荧光显微镜观察切片上是否有荧光信号，从而确定是否存在抗核抗体。
ana间接免疫荧光实验可以用于许多自身免疫性疾病的诊断，
如系统性红斑狼疮（SLE）、干燥综合征、硬皮病等。
这些疾病的发
生与人体免疫系统异常激活有关，导致产生抗核抗体。
通过ana间
接免疫荧光实验，医生可以观察到抗核抗体的分布情况和强度，从
而辅助诊断这些疾病。
需要注意的是，ana间接免疫荧光实验只是一种辅助诊断手段，
结果需要结合临床症状、其他实验室检查以及医生的综合判断来进
行综合诊断。
此外，实验操作的准确性和结果的解读都需要经过专
业训练和经验积累的医学人员来进行，以确保结果的准确性和可靠性。
总结来说，ana间接免疫荧光是一种用于检测人体血清中抗核
抗体的免疫学实验技术。
它可以辅助诊断许多自身免疫性疾病，但
结果需要结合其他临床信息进行综合判断。
这项实验需要专业训练
和经验的医学人员进行操作和解读，以确保结果的准确性和可靠性。
免疫荧光技术操作步骤
免疫荧光技术操作步骤 Prepared on 22 November 2020免疫荧光技术操作步骤一. 直接免疫荧光法测抗原基本原理将荧光素标记在相应的抗体上，直接与相应抗原反应。
其优点是方法简便、特异性高，非特异性荧光染色少，相对使用标记抗体用量偏大。
试剂与仪器磷酸盐缓冲盐水（PBS）：L，荧光标记的抗体溶液：以 L，的 PBS 进行稀释缓冲甘油：分析纯无荧光的甘油 9 份+ 碳酸盐缓冲液 1 份配制搪瓷桶三只（内有 L，的 PBS 1500ml）有盖搪瓷盒一只（内铺一层浸湿的纱布垫）荧光显微镜玻片架滤纸37℃温箱等。
实验步骤1. 滴加 L，的PBS于待检标本片上，10min后弃去，使标本保持一定湿度。
2. 滴加适当稀释的荧光标记的抗体溶液，使其完全覆盖标本，置于有盖搪瓷盒内，保温一30min定时间（参考：30min）。
3. 取出玻片，置玻片架上，先用 L，的 PBS 冲洗后，再按顺序过 L，的 PBS 三缸浸泡，每缸 3-5 min，不时振荡。
4. 取出玻片，用滤纸吸去多余水分，但不使标本干燥，加一滴缓冲甘油，以盖玻片覆盖。
5. 立即用荧光显微镜观察。
观察标本的特异性荧光强度，一般可用“+”表示：（-）无荧光；（±）极弱的可疑荧光；（+）荧光较弱，但清楚可见；（++）荧光明亮；（+++--++++）荧光闪亮。
待检标本特异性荧光染色强度达“++”以上，而各种对照显示为（±）或（-），即可判定为阳性。
注意事项1. 对荧光标记的抗体的稀释，要保证抗体的蛋白有一定的浓度，一般稀释在 1：20-100 之间，要自行摸索最佳梯度，建立最好的稀释比例，抗体浓度过低，会导致产生的荧光过弱，影响结果的观察。
2. 染色的温度和时间需要根据各种不同的标本及抗原而变化，染色时间可以从 10 min 到数小时，一般 30 min 已足够。
染色温度多采用室温（25℃左右），高于 37℃可加强染色效果，但对不耐热的抗原（如流行性乙型脑炎病毒）可采用 0-2℃的低温，延长染色时间。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
间接免疫荧光法(idirect immunoflorescence, IIF )检测ANA标准操作程序【目的】保证检测结果准确可靠，为临床诊断提供可靠的参考依据【该SOP变动程序】本标准操作程序的变动，可由任一使用本SOP的工作人员提出，并报经下述人员批准签字：专业主管、科主任。
【方法】间接免疫荧光法(idirect immunoflorescence, IIF)。
【标本的采取和保存】随机静脉血3ml，分离血清备用。
也可使用血浆标本进行检测。
标本宜新鲜，无污染，避免溶血，避免反复冻融，不可用NaN3防腐。
【原理】稀释后的待检血清或脑脊液、胸水、腹水等体液标本滴加在Hep -2细胞(人喉癌上皮细胞)抗原基质上，如果被检清中存在抗细胞抗原成分的抗体，则可以特异性地和抗原基质片上Hep-2细胞中的抗原成分结合形成抗原抗体复合物(主要是IgG类)，再与兔或羊抗人免疫球蛋白IgG荧光标记抗体结合，在荧光显微镜下可观察到Hep-2细胞细胞核和/或细胞浆抗原位置发出特异的亮绿色荧光，为抗核抗体(antinuxlear antibodies, ANA )阳性。
【仪器】荧光显微镜【试剂】ANA IIF试剂盒，德国欧蒙公司产品，每个反应区有两种抗原复合基质：猴肝组织和人Hep-2细胞。
【操作程序】1.准备检查加样板是否反应区亲水而周边疏水。
如果不是，用湿纸巾擦干净，必要时可用一点家用洗涤剂，再用足量的水冲洗。
随后从试剂盒中取出载片，等平衡到室温时方可打开包装。
注意不要触及生物薄片。
必要时可用笔编号、标记：(为了使实验操作标准化，欧蒙开发了滴定平板技术：滴加标本或标记抗体至加样板的反应区，然后将生物薄片载片盖在加样板表面的凹槽里，这时，载片上的所有生物薄片均与液滴接触，反应同时开始。
系统的几何结构决定了液滴的位置和高度。
因为液体被局限在一封闭的空间里，所以不再需要传统的“湿盒”。
并且可在一致的反应条件下同时温育任何数量的标本。
）。
2.稀释：根据实验设计，用试剂盒中配备的磷酸盐缓冲液（PBS-Tween 20） 1：1稀释待检血清。
注意：阳性和阴性对照不需稀释，使用前要混匀，每次实验均须做对照。
3.加样：将加样板放在泡沫板上，按顺序分别滴加25ul稀释后的血清至加样板的反应区中，避免产生气泡。
滴加完所有待测标本后才开始温育（一次最多2份）。
4.第一次温育：将载片覆有生物薄片的一面朝下，盖在加样板的凹槽里，反应立即开始。
确保每一个标本均与生物薄片接触，且标本间互不接触。
室温温育30分钟。
5.清洗：用烧杯盛磷酸盐缓冲液流水冲洗载片1秒钟（注意水流不要太急，不要直接对着基质冲），然后立即（不要吹干）将其浸入装有磷酸盐缓冲液的小杯中浸洗至少1分钟。
不需振荡。
6.加样：滴加20ul FITC标记的抗人免疫球蛋白（结合物）至洁净加样板的反应区中，完全加完所有的二抗后，方可继续温育。
注意：FITC标记的抗人免疫球蛋白使用前需混匀。
为节约时间，可在第一步温育的同时滴加荧光二抗至另一个加样板的反应区中。
7.第二次温育：从磷酸盐缓冲液中取出一张载片，5秒钟内用吸水纸擦一下背面和边缘后，立即将载片覆有生物薄片的一面朝下，盖在加样板的凹槽里。
注意：为防止破坏基质，不要擦拭反应区的间隙。
检查生物薄片是否与液滴接触良好，然后继续下一张。
室温温育30分钟。
从现在开始，注意避免阳光直射载片。
8.清洗：用烧杯盛磷酸盐缓冲液流水冲洗载片1秒钟（注意水流不要太急，不要直接对着基质冲），然后立即将其浸入装有磷酸盐缓冲液的小杯中浸洗至少1分钟。
可在每150ml磷酸盐缓冲液中加10滴伊文氏蓝作为衬染。
9.封片：将盖玻片直接放在泡沫板的凹槽里。
滴加甘油/PBS至盖玻片：每一个反应区约10ul。
从磷酸盐缓冲液中取出一张载片，用纸擦干背面和四边，注意不要擦拭反应区间隙，尤其避免接触到抗原基区，导致抗原基质组织或细胞形态破坏或被涂掉。
将载片覆有生物薄片的一面朝下放在已准备好的盖玻片上，立即查看并轻轻调整使盖玻片嵌入到载片的凹槽里。
然后继续下一张。
封片后的抗原基质片即可在荧光显微镜下观察结果。
如不能及时观察，可将抗原基质片置4C 冰箱保存，3日内观察结果，不可过长。
10.结果判断：荧光显微镜下观察特异的荧光模型。
当被检标本中存在抗核抗体(ANA ),在荧光显微镜下可观察到Hep-2细胞核位置上出现生亮绿色荧光染色为ANA\阳性，ANA阴性则无特异性荧光染色。
IIF检测ANA,因被检血清中存在不同性质的特异性的ANA,同检测底物靶抗原结合，而呈现形态各异的荧光模型。
通过荧光染色模型分析，可初步判断相应抗体性质范围。
从而指示进一步检测特异性抗体。
临床常规检测ANA,常见的荧光染色模型有下述6种：(1 )均质型(homegeneous pattern , H )：又称弥散型。
核质染色均匀一致，中期细胞染色质阳性(亦呈均质型)。
此染色与抗dsDNA抗体、抗组蛋白抗体有关。
(2 ) 斑点型(speckled pattern , S ):又称颗粒型，核斑块型。
核质染色呈斑点状.斑块状，核仁阴性，中期细胞染色质阴性。
此荧光染色模型与可溶性抗原(ENA)抗体有关。
(3 ) 核仁型(nucleolar pattern , N )：核仁着染荧光，中性细胞染色质阴性。
核仁颗粒型，常与抗U 3nRNP/Fibrillarin抗体、抗RNA多聚酶I抗体相关；仁均质型，常与抗PM-Scl (PM - 1)抗体、抗7 - 2 - RNP (To)抗体，抗4 -6 - RNA抗体相关；核仁点型(1-2点)，常与抗核仁形成中心(NOR )抗体有关。
(4 ) 核膜型(membranous pattern , M )：又称周边型(rim)。
荧光染色在核膜周围，中期细胞染色质阴性。
此荧光染色型与抗核层蛋白(Lamin)抗体相关。
有学者认为，由于抗原底物片固定方法或制备过程中的影响，某些抗dsDNA抗体亦呈核膜型，中期细胞荧光染色质阴性或呈周边型。
（5 ）着丝点型（centromere pattern ）：又称散在斑点型（discretrspeckled pattern）o核内均匀散布大小一致的着染荧光细颗粒（ 40-60个），无核膜结构，中期细胞荧光染质着丝点密集排列。
如中期细胞阳性，可判断抗着丝点抗体阳性。
（6 ）胞浆型（cytoplasmic pattern ）:细胞胞浆荧光染色阳性。
又可分：①线粒体型（胞浆粗颗粒型）②核糖体型（胞浆细颗粒型或均质型，有时可见核仁阳性）③Jo-1型（核、浆颗粒型）④ 细颗粒型（PL-7、PL-12）④溶酶体型、高尔基体型等。
除上述常见的荧光染色模型外，还可见一些少见的荧光染色模型。
这些少见的荧光染色模型，除PCNA （抗增殖性细胞核抗原抗体）型外，多数荧光染色型所对应的ANA,其临床意义还不十分清楚。
关于ANA荧光染色模型，应该指出的是一种抗体可以出现不同的荧光染色模型，不同的抗体也可以出现同样的荧光染色模型。
荧光染色模型具有一定的提出示作用，但仅根据荧光染色模型特点来推断抗体的特异性是片面的。
除了抗着丝点抗体、抗PCNA特异性抗体及一些具有特殊性殊荧光染色模型抗体外（如抗高尔基抗体、抗中心体抗体等）。
对ANA特异性的判断应根据特异性抗体检测方法（如ELISA、对流电泳法、免疫扩散法、免疫印记法等）来确定。
IIF检测ANA,结果判断时应注意有丝分裂期（Mitotic phase ）细胞，尤其是中期细胞胞浆荧光染色特点，对荧光染色模型分析有重要帮助。
有时一份血清兴因含有多种抗体，可出现不同的染色模型（混合型）。
用不同稀释的血清检测，有助于区分所含有的各种荧光染色模型。
【注意事项】1.每资实验必须设阳性和阴性对照。
2.Hep-2细胞抗原片制备时已固定，实验使用时勿需再固定。
3.实验完毕后最好短时间内荧光显微镜下观察结果，如需放置过夜，可将抗原片4C避光保存。
阳性结果荧光片置-20C可保存很长时间。
4.抗核抗体（antinuclear antibody,ANA）新概念：在自身免疫性疾病中，细胞核常成为自身免疫反应的靶子。
抗核抗体传统定义（狭义定义）顾名思义是指抗细胞核抗原成分的自身抗体的总称。
这是一组针对细胞核内DNA, RNA,蛋白质，脂类，酶类或这些物质的分子复合物的抗体。
随着免疫荧光技术的改进，先进的免疫学技术的应用和分子生物学的发展，目前对ANA的理解已不局限于细胞核成分，而是指抗核酸（nucleic acid）和核蛋白（nucleprotein）-抗体的总称。
ANA靶抗原分布由传统的细胞核扩展到现在的整个细胞，包括细胞核，细胞浆，细胞骨架，细胞分裂周期蛋白等。
因此，抗核抗体现代定义（广义定义）是指抗细胞内所有抗原成分的自身抗体的总称。
抗核抗体谱实际上是自身抗体的一个“家族”，随着分子生物学、细胞生物学、免疫化学的深入研究，人们对这一“家族”成员的特征及其在自身免疫病中扮演的“角色”的认识逐步加深，并不断有新的抗核抗原抗体被发现。
目前根据细胞内靶抗原分子的理化特性分布部位，可将ANAs分为以下五大类，每一大类又因不同的抗原特性再分为许多亚类。
即：（1）抗DNA 抗体：anti-dsDNA , anti-ssDNA（2）抗组蛋白抗体：histons: H1, H2A, H2B, H3, H4, H2A-H2B 复合物（3）抗非组蛋白抗体：① 抗ENA抗体：抗体Sm, nRNP, SSA/Ro, SSB/La,rRNP, Scl-70, Jo-1, PCNA, RA33, Ku, RANA, Mi-1,Mi-2, PL-7, PL-12 等②抗着丝点抗体：anti-CENP-A, B, C, D, E, F（4）抗核仁抗体：抗体RNA-polymerase-1, 4-6-S-RNA ,PM-Scl/PM-1,Th/To, NOR-90, U3nRNP/Fibrillarin（5）抗其他细胞成分抗体：高乐基体，中心体，纺缍体，线粒体，溶酶体，肌动蛋白（Actin）,波形纤维蛋白（Vimeentun），细胞角蛋白，核层蛋白（Lamin）抗体。
ANAs各类抗体无统一命名方式，有的是以第一个检出该抗体的患者的名字缩写命名（如抗Sm抗体、抗Jo-1抗体）；有的是按抗体相关疾病的病名命名（如抗PM-Scl抗体、抗SSA 和抗SSB抗体）；有的是按靶抗原分布位置命名（如抗线粒体抗体、抗着丝点抗体等。
5.IIF检测ANA最佳抗原底物Hep-2细胞目前【压检测ANA商品盒，多数选择HEP-2细胞作为抗原底物片。
HEP-2细胞具有如下优点：属人来源培养细胞（人喉上皮细胞），核抗原丰富、特异性强、含量高；核大、细胞结构清晰、易于结果观察及荧光染色核型分析。