pH对红豆杉愈伤组织生长_PAL活性和紫杉醇含量的影响_盛长忠
诱导子对红豆杉培养细胞紫杉醇产量的影响
的竹 子 。 熊猫 必 须 快 速 消 化 才 能 获 得 较 多 的 营 养 物 大
竹、 拐棍 竹 为 主 食 ， 食 短 雉 玉 山 竹 ， 熊 猫 在 此 处 选 兼 大
质， 据研 究 食 物 在 大 熊 猫 消 化 道 中 滞 留时 间 为 ８ ３ｈ ＋ ， 吃 竹 笋 时 间 只需 ５ｈ 竹 秆 需 １ ， 叶 约 需 １ 。 ， ０ｈ 竹 ４ｈ 大 熊 猫 食 量 大 ， 化 快 才 能 获 得 足 够 的能 量 和 营 养 。此 消
进 展 ， 中如 何 提 高 紫 杉 醇 的 产 量 是 研 究 的 关键 。 目前 通 过 促 进 紫杉 醇代 谢 来提 高产 量 最 常 用 、 重 其 最
要 的 方 法之 一 是 添 加 诱 导 子 。这 是 来 源 于 病 原微 生 物 的 一 类化 学 物 质 ， 有 诱 导 植 物 细胞 中防 卫基 因 具 表 达 诱 发 植 物 过 敏 反 应 和 促 进 植 物 细 胞 中特 定 次 生代 谢 产 物 的 合 成 等 多种 功 能 。 近 年 来在 红 豆杉 细 就 胞 培 养 生 产 紫杉 醇 方 面的研 究进 展 进 行 简要 论 述 ． 重介 绍 了 添加 诱 导子 在 促 进 紫 杉 醇 生 物 合 成 中的 着
应用。
关 键 词 红 豆 杉 紫杉 醇 细 胞 培 养 诱 导 子 紫 杉 醇 （ａｌａｅ， 品 名 为 Ｔ ｘ１是 仅 存 在 于 红 ｐｃｔｘｌ商 ｉ ａｏ） 豆 杉 科 （ａａｅｅ 红 豆 杉 属 （ａｕ） 澳 洲 红 豆 杉 属 Ｔｘｃａ ） Ｔｘｓ和 （ ｓ ｏ ｘｓ植 物 中 的一 种 四环 二 萜 酰 胺 类 化 合 物 。 Ａｕｔ ｔ ｕ） ｒａ 它
ｍｅ ｉ，．ａｃｔ ） ｄ Ｔｂ ｃａａ等 的外 植 体诱 导 出愈 伤 组 织 。 目前 为 ａ
重楼的组织培养
重楼的组织培养1.外植体的选择与消毒1.1外植体的选择据李群等对重楼组织培养外植体有4个取材时期，即萌芽期、展叶期、花冠露白期和倒苗期，子房取自花冠露白期，叶片取自萌芽和展叶期，幼芽取自萌芽期、展叶期、倒苗期，试验结果表明，其中以展叶期旺盛生长的根茎作外植体，其愈伤组织的诱导频率最高，达16.6%，萌芽期取材次之，在花冠露白期和倒苗期，根茎则很难诱导产生愈伤组织。
根和叶片既不能诱导出愈伤，也不能诱导出小球茎，接种后很少启动，污染也较少，大约2个月后干枯死亡。
而根茎、子房、幼芽都能不同程度地诱导出愈伤组织，特别是幼芽，不但诱导出的愈伤组织块数最多，诱导频率最高，达68. 25%，且还能诱导出小球茎。
可见，不同的外植体的诱导频率差异很大。
在四川峨眉山海拔2000 m左右的环境下，重楼属植物的生长期一般为4月至5月中下旬，大约二个月左右的时间。
因此，取材时间应在4月至5月上旬这段时间。
但在这段时间取材培养，会发现外植体极易污染。
必须采取一些措施减轻或控制外植体的污染。
.1.2外植体的消毒接种前置于18 e 弱光下保存，一般滞留2-4d即接种培养。
取重楼的芽，自来水冲洗2-3h，去除表层的芽鞘，再用自来水冲洗干净后，蒸馏水冲洗3遍。
在无菌条件下，用75,酒精消毒30S，无菌水冲洗3-5次，0.1,升汞灭菌15min，无菌水冲洗5-8次。
将芽外部的芽鞘按层剥下，切成长宽分别为1cm 左右的小块，芽内部不能分层的部分按切外层芽鞘的大小切成小块，接种到愈伤组织诱导培养基上，一般幼嫩的芽和叶片灭菌3-4min;根茎灭菌10min，子房和根灭菌6-8min。
灭菌以后的材料用无菌水清洗3-5次，最后接种于培养基(1)上，置于(20?2 )?培养温度，光照时间8h/d的条件下培养。
培养基:(1)MS+BA 1.0 +IAA 2.0 和 MS+BA 2.0 +IAA 1.0 培养基上，不但能诱导愈伤组织，还能诱导出小球茎。
红豆杉内生真菌发酵培养过程中的碳源优化
红豆杉内生真菌发酵培养过程中的碳源优化1绪论1.1引言肿瘤的治疗在很大程度上依赖于抗肿瘤药物，抗肿瘤药物研究方兴未艾。
紫杉醇(Paclitaxel，商品名Taxol)是从红豆杉树皮中分离提纯得到的植物抗肿瘤药，已有40余年的研究历史。
由于其具有良好的抗癌活性和独特的抗癌机理，因而被认为是抗癌药物的“明星”。
自1992年以来，紫杉醇已在许多国家成为治疗卵巢癌和乳腺癌的重要药物[1]。
由于紫杉醇的药源植物——红豆杉属植物生长缓慢，紫杉醇含量很低(低于为树皮干重的0.015%)，而现有的资源又有限，因而紫杉醇的供应一开始就受到人们的关注。
多年来人们一直在寻找能替代直接从植物中提取紫杉醇的方法[2、3]。
紫杉醇的化学全合成虽已完成，但路线复杂，目前无商业价值；紫杉醇的半合成在一定程度上为缓解紫杉醇的供求矛盾；近年来分别从红豆杉属（Taxus）中的短叶红豆杉（T. brevifolia Nutt.）、云南红豆杉（T. yunnanensis）、西藏红豆杉（T. wallichinana）等树皮中分离中得到能产生紫杉醇的内共生真菌，这无疑为解决紫杉醇药源危机提供了一种新的途径。
1.2内共生真菌内共生真菌(endophytic fungus)是一大类尚未被充分认识的真菌，它泛指那些生活在健康植株中而不引起任何明显病害症状的所有真菌。
在整个真菌发展史上，内共生真菌的研究历史并不长[4]。
1924年，Lewis首次报道禾本科植物叶片中存在内共生真菌，但此后的研究工作一直很少，直到近30年，对于植物内共生真菌的研究才趋于活跃。
自从A. Stierle证明Taxus brenifoli a nutt中的内共生真菌Ｔaxomyces andreanae可以产生紫杉醇，对于植物内共生真菌的研究更加引人瞩目[5]。
目前为止，内共生真菌生产紫杉醇产量也极低，这就需要进行多方面的研究。
本课题是以不同的碳源种类和配比对红豆杉内共生真菌发酵培养条件优化的研究。
水杨酸对红豆杉细胞的诱导作用
水杨酸对红豆杉细胞的诱导作用
梅兴国;张舟宁;苏湘鄂;龚伟
【期刊名称】《生物技术》
【年(卷),期】2000(10)6
【摘要】通过添加不同浓度的水杨酸 (SA) ,比较了它们对红豆杉细胞过氧化物酶(POD)、苯丙氨酸解氨酶 (PAL)、过氧化氢 (H2 O2 )含量及对细胞生长和紫杉醇含量的影响 ,结果表明 ,SA可提高POD及PAL的活性 ,促进细胞内H2 O2 含量的上升并有利于紫杉醇的合成 ,其中 2 0mg/LSA对紫杉醇合成的促进效果最明显 ,紫杉醇含量可达对照组的 13倍。
【总页数】3页(P18-20)
【关键词】紫杉醇;水杨酸
【作者】梅兴国;张舟宁;苏湘鄂;龚伟
【作者单位】华中科技大学生命科学与技术学院
【正文语种】中文
【中图分类】Q942.6;Q946.826
【相关文献】
1.水杨酸作用下东北红豆杉细胞的二维凝胶电泳分析 [J], 乔建军;赵红;葛志强;元英进;曾安平
2.磷脂酶A2在诱导红豆杉细胞产生活性氧中的作用 [J], 兰文智;陈超;黄雅芬;余龙江
3.脂氧合酶在诱导红豆杉细胞产紫杉醇中的作用 [J], 黄雅芬;余龙江;兰文智;杨希
4.水杨酸对真菌诱导子诱导红豆杉悬浮细胞膜脂过氧化和紫杉醇生物合成的影响[J], 兰文智;余龙江;吴元喜
5.茉莉酸甲酯与真菌诱导物、水杨酸组合对红豆杉细胞中紫杉醇含量的影响 [J], 苏湘鄂;梅兴国;龚伟;张舟宁
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ORCA3转录因子对红豆杉细胞中紫杉醇生物合成的影响
收稿日期：2012－04－23；修回日期：2012－05－13基金项目：国家自然科学基金青年基金项目（200906036）；国家自然科学基金面上项目（20776058）作者简介：于小青（1982－），女，山东潍坊人，硕士研究生。
研究方向：植物次生代谢与调控。
△该作者目前就读于华中科技大学生命科学与技术学院，系2009级本科生。
*通讯作者：付春华。
E－mail：fuch2003@126．com ·研究报告·ORCA3转录因子对红豆杉细胞中紫杉醇生物合成的影响*于小青1，杨海燕△，张蒙1，栗茂腾1，2，付春华1，2*，余龙江1，2（1．华中科技大学生命科学与技术学院，资源生物学与生物技术研究所，湖北武汉430074；2．华中科技大学分子生物物理教育部重点实验室，湖北武汉430074）摘要：ORCA3是一个受MeJA诱导的调控植物基础和次生代谢的转录调控因子。
本文拟探讨ORCA3转录因子对红豆杉细胞中紫杉醇生物合成的影响，旨在为创制紫杉醇稳定高产的红豆杉细胞系，解决细胞大规模培养中紫杉醇含量低的瓶颈问题提供参考。
从长春花中克隆ORCA3基因后，采用农杆菌介导法转入红豆杉细胞中，通过PCR、组织化学活性染色等检测法，筛选得到20余株转基因细胞系。
HPLC检测转基因细胞系内紫杉醇含量表明：与阴性对照相比，转基因细胞系的紫杉醇含量增加了0．5 2．5倍，最高可达159．315μg/g。
因此，ORCA3转录因子可以调控红豆杉细胞中紫杉醇合成。
关键词：红豆杉；遗传转化；ORCA3；紫杉醇中图分类号：Q789文献标识码：A文章编号：1008－0457（2012）03－0189－05紫杉醇（Taxol）是一种重要的抗肿瘤药物，由于它在红豆杉植物中含量极低（约为0.01%），市场供求矛盾突出［1］。
目前，紫杉醇主要靠天然提取和化学半合成法获得，这两种方式均需要依赖有限的红豆杉资源。
因此，细胞大规模培养方法被认为是生产紫杉醇最有希望的替代途径之一［2］。
三种抗氧化剂对曼地亚红豆杉愈伤组织褐化及相关物质含量的影响_郑超
植物生理学报 Plant Physiology Journal 2013, 49 (3): 259~263259收稿 2012-12-26 修定 2013-02-06资助 国家高技术研究发展计划(“863”计划)子课题(2011AA-10A206)、江苏省农业自主创新资金项目[CX(12)2041]、江苏省苏北发展计划(BN2012078)。
* 通讯作者(E-mail: jswangren@; Tel: 025-********)。
三种抗氧化剂对曼地亚红豆杉愈伤组织褐化及相关物质含量的影响郑超, 徐晟, 夏冰, 郑玉红, 贺佳, 彭峰, 汪仁*江苏省中国科学院植物研究所, 南京210014摘要: 采用不同浓度聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、维生素C (VC)、柠檬酸3种抗氧化剂处理褐化的曼地亚红豆杉愈伤组织, 检测结果表明, 在柠檬酸5 mg·L -1、VC 10 mg·L -1或PVP 5 mg·L -1处理下总酚含量为最低, VC 、柠檬酸处理后总酚含量下降显著, 分别比对照减少77.8%、87.4%, 而PVP 处理后下降不显著; 与愈伤组织褐化相关的多酚氧化酶(PPO)和过氧化物酶(POD), 在PVP 浓度为2.5和10.0 mg·L -1时活性分别达到最低, 与对照相比下降72.6%和97.8%。
相关性分析结果表明, 愈伤组织褐化程度与总酚含量呈显著正相关, 而总酚含量与PPO 、POD 活性则呈负相关。
可见, 抗氧化剂VC 和柠檬酸处理红豆杉愈伤组织, 能有效抑制总酚的积累, 降低其褐化程度。
关键词: 曼地亚红豆杉; 愈伤组织褐化; 总酚含量; POD; PPOEffects of Three Antioxidants on Callus Browning and Its Related Substance Contents in Taxus media RehderZHENG Chao, XU Sheng, XIA Bing, ZHENG Yu-Hong, HE Jia, PENG Feng, WANG Ren *Institute of Botany, Jiangsu Province and Chinese Academy of Sciences, Nanjing 210014, ChinaAbstract: Different concentrations of polyvinylpyrrolidone (PVP), vitamin C (VC) and citric acid were performed on callus browning of Taxus media . The result showed that the total phenolic content was the lowest at 5 mg·L -1 of citric acid, 10 mg·L -1 of VC or 5 mg·L -1 of PVP. Compared with the control, the total phenolic content was signi fi cantly decreased by 77.8% and 87.4% after treatment with VC and citric acid. Additionally, activities of callus browning-related enzymes PPO and POD were reduced by 72.6% and 97.8% at their lowest levels under treatments with 2.5 and 10.0 mg·L -1 PVP respectively. The correlation analysis among the browning degrees of callus, total phenolic content, PPO and POD activities was also carried out. A signi fi cant positive correlation between total phenolic content and callus browning was found. But total phenolic content was negatively correlated to PPO and POD activities. It indicates that VC and citric acid are more effective to inhibit total phenolic accumulation in T. media callus, and thus reducing callus browning. Key words: Taxus media ; callus browning; total phenolic content; POD; PPO 自在太平洋紫杉中发现紫杉醇(Wani 等1971)以来, 红豆杉的相关研究已成为植物研究领域的一大热点。
不同抗褐化剂对青钱柳愈伤组织酶活性和生长的影响
第４７卷㊀第６期２０２３年１１月南京林业大学学报（自然科学版）ＪｏｕｒｎａｌｏｆＮａｎｊｉｎｇＦｏｒｅｓｔｒｙＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（ＮａｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓＥｄｉｔｉｏｎ）Ｖｏｌ．４７，Ｎｏ．６Ｎｏｖ．，２０２３㊀收稿日期Ｒｅｃｅｉｖｅｄ：２０２２⁃０３⁃２１㊀㊀㊀㊀修回日期Ａｃｃｅｐｔｅｄ：２０２２⁃０５⁃１１㊀基金项目：江苏省农业重点研发项目（ＢＥ２０１９３８８）；国家自然科学基金项目（３２０７１７５０）㊂㊀第一作者：王纪（４３８２６７８１＠ｑｑ．ｃｏｍ），助教，博士㊂∗通信作者：方升佐（ｆａｎｇｓｚ＠ｎｊｆｕ．ｅｄｕ．ｃｎ），教授㊂㊀引文格式：王纪，方升佐．不同抗褐化剂对青钱柳愈伤组织酶活性和生长的影响［Ｊ］．南京林业大学学报（自然科学版），２０２３，４７（６）：１６７－１７４．ＷＡＮＧＪ，ＦＡＮＧＳＺ．Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔａｎｔｉ⁃ｂｒｏｗｎｉｎｇａｇｅｎｔｓｏｎｅｎｚｙｍｅａｃｔｉｖｉｔｙａｎｄｇｒｏｗｔｈｉｎｃａｌｌｕｓｏｆＣｙｃｌｏｃａｒｙａｐａｌｉｕｒｕｓ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＮａｎｊｉｎｇＦｏｒｅｓｔｒｙＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（ＮａｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓＥｄｉｔｉｏｎ），２０２３，４７（６）：１６７－１７４．ＤＯＩ：１０．１２３０２／ｊ．ｉｓｓｎ．１０００－２００６．２０２２０３０７１．不同抗褐化剂对青钱柳愈伤组织酶活性和生长的影响王㊀纪１，２，方升佐２∗（１．南京晓庄学院，江苏㊀南京㊀２１１１７１；２．南京林业大学林草学院，江苏㊀南京㊀２１００３７）摘要：ʌ目的ɔ青钱柳（Ｃｙｃｌｏｃａｒｙａｐａｌｉｕｒｕｓ）在组织培养中的褐化问题一直是造成愈伤组织死亡和制约其规模化生产的重要原因，对褐化问题进行研究为青钱柳快速繁殖体系的建立和离体生产次生代谢物质奠定基础㊂ʌ方法ɔ以青钱柳无菌实生苗茎段㊁叶片和根系作外植体，研究维生素Ｃ（ｖｉｔａｍｉｎＣ，ＶＣ）㊁聚乙烯吡咯烷酮（ｐｏｌｙｖｉ⁃ｎｙｌｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ，ＰＶＰ）和活性炭（ａｃｔｉｖｅｃａｒｂｏｎ，ＡＣ）３种抗褐化剂及其不同浓度对青钱柳愈伤组织褐化率㊁增长量及相关酶活性的影响㊂ʌ结果ɔ不同抗褐化剂与不同浓度处理对青钱柳愈伤组织褐化率㊁增长量㊁苯丙氨酸解氨酶（ＰＡＬ）活性㊁多酚氧化酶（ＰＰＯ）活性和过氧化物酶（ＰＯＤ）活性均具有显著影响（Ｐ＜０．０５）㊂愈伤组织褐化率随ＰＶＰ和ＡＣ浓度的增加而降低，随ＶＣ浓度的增加呈先降低后增加趋势㊂与ＶＣ和ＰＶＰ相比，ＡＣ处理的愈伤组织褐化率最低，其中，以茎㊁根和叶为外植体的愈伤组织褐化率均以４．０ｇ／ＬＡＣ处理最低，分别为１６ ３％㊁３３ ３％和２６ ７％㊂不同处理下，以叶片为外植体的愈伤组织褐化率高于茎段和根系的㊂愈伤组织累计增长量随ＰＶＰ和ＡＣ质量浓度的增加而增加，随ＶＣ浓度的增加呈先增加后降低趋势㊂添加ＶＣ和ＰＶＰ处理不同外植体愈伤组织累计增长量高于ＡＣ处理，以ＶＣ浓度为０．４ｇ／Ｌ时茎段愈伤组织累计增长量最高，为６．６９ｇ㊂添加ＰＶＰ和ＡＣ处理的茎段㊁叶片和根系愈伤组织ＰＡＬ和ＰＯＤ活性略高于ＡＣ处理，而添加ＰＶＰ处理的茎段㊁叶片和根系愈伤组织ＰＰＯ活性高于添加ＡＣ和ＶＣ处理的㊂随着抗褐化剂浓度增加，愈伤组织ＰＡＬ活性逐渐降低㊁ＰＰＯ和ＰＯＤ活性呈单峰变化趋势㊂其中，以叶片为外植体的愈伤组织的ＰＡＬ㊁ＰＯＤ和ＰＰＯ活性均高于茎段和根系的㊂Ｐｅａｒｓｏｎ相关分析结果表明，青钱柳愈伤组织褐化率与ＰＡＬ活性呈极显著正相关（Ｐ＜０．０１），愈伤组织增长量与ＰＰＯ活性㊁ＰＯＤ活性呈极显著正相关（Ｐ＜０．０１）㊂ʌ结论ɔ抗褐化剂种类和浓度对青钱柳愈伤组织褐化及生长均有显著影响，以ＡＣ抗褐化效果最好，但高浓度的ＡＣ会一定程度抑制愈伤组织的生长㊂ＰＡＬ活性在愈伤组织褐化过程中起关键作用，可以作为青钱柳组织培养过程中褐化控制的主要参考酶指标，同时外植体器官的类型选择也是控制褐化考虑的因素㊂关键词：青钱柳；组织培养；外植体；愈伤组织；褐化率；酶活性中图分类号：Ｓ６８２．２９㊀㊀㊀㊀㊀㊀文献标志码：Ａ开放科学（资源服务）标识码（ＯＳＩＤ）：文章编号：１０００－２００６（２０２３）０６－０１６７－０９Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔａｎｔｉ⁃ｂｒｏｗｎｉｎｇａｇｅｎｔｓｏｎｅｎｚｙｍｅａｃｔｉｖｉｔｙａｎｄｇｒｏｗｔｈｉｎｃａｌｌｕｓｏｆＣｙｃｌｏｃａｒｙａｐａｌｉｕｒｕｓＷＡＮＧＪｉ１，２，ＦＡＮＧＳｈｅｎｇｚｕｏ２∗（１．ＮａｎｊｉｎｇＸｉａｏｚｈｕａｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ２１１１７１，Ｃｈｉｎａ；２．ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＦｏｒｅｓｔｒｙａｎｄＧｒａｓｓｌａｎｄ，ＮａｎｊｉｎｇＦｏｒｅｓｔｒｙＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ２１００３７，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：ʌＯｂｊｅｃｔｉｖｅɔＴｈｅｂｒｏｗｎｉｎｇｉｎｔｈｅｃａｌｌｕｓｃｕｌｔｕｒｅｐｒｏｃｅｓｓｏｆＣｙｃｌｏｃａｒｙａｐａｌｉｕｒｕｓｉｓａｎｉｍｐｏｒｔａｎｔｐｒｏｂｌｅｍｆｏｒｔｈｅｄｅａｔｈｏｆｃａｌｌｕｓ，ｗｈｉｃｈｏｂｖｉｏｕｓｌｙｒｅｓｔｒｉｃｔｓｉｔｓｌａｒｇｅ⁃ｓｃａｌｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．Ｒｅｄｕｃｉｎｇｔｈｅｂｒｏｗｎｉｎｇｒａｔｅｗｉｌｌｌａｙｔｈｅｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｆｏｒｔｈｅｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔｏｆａｒａｐｉｄｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍａｎｄｉｎｖｉｔｒｏｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｓｅｃｏｎｄａｒｙｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ．ʌＭｅｔｈｏｄɔＴｈｅｓｔｅｍｓｅｇｍｅｎｔｓ，ｌｅａｖｅａｎｄｒｏｏｔｓｏｆＣ．ｐａｌｉｕｒｕｓｓｅｅｄｌｉｎｇｓｗｅｒｅｕｓｅｄａｓｅｘｐｌａｎｔｓｔｏｓｔｕｄｙｔｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆｔｈｒｅｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔａｎｔｉ⁃ｂｒｏｗｎｉｎｇａｇｅｎｔｓ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇｖｉｔａｍｉｎＣ（ＶＣ），ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ（ＰＶＰ）ａｎｄａｃｔｉｖｅｃａｒｂｏｎ（ＡＣ）ｗｉｔｈｄｉｆｆｅｒｅｎｔ南京林业大学学报（自然科学版）第４７卷ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｏｎｔｈｅｂｒｏｗｎｉｎｇｒａｔｅ，ｉｎｃｒｅｍｅｎｔａｓｗｅｌｌａｓｅｎｚｙｍｅａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｏｆＣ．ｐａｌｉｕｒｕｓｃａｌｌｕｓ．ʌＲｅｓｕｌｔɔＤｉｆｆｅｒｅｎｔａｎｔｉ⁃ｂｒｏｗｎｉｎｇａｇｅｎｔｓａｎｄｔｈｅｉｒｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｈａｄｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｅｆｆｅｃｔｓｏｎｔｈｅｂｒｏｗｎｉｎｇｒａｔｅ，ｇｒｏｗｔｈａｎｄａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｏｆｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅａｍｍｏｎｉａｌｙａｓｅ（ＰＡＬ），ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌｏｘｉｄａｓｅ（ＰＰＯ）ａｎｄｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＰＯＤ）ａｃｔｉｖｉｔｙｉｎＣ．ｐａｌｉｕｒｕｓｃａｌｌｕｓ（Ｐ＜０．０５）．ＴｈｅｃａｌｌｕｓｂｒｏｗｎｉｎｇｒａｔｅｄｅｃｒｅａｓｅｄｗｉｔｈｉｎｃｒｅａｓｉｎｇＰＶＰａｎｄＡＣｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ，ｗｈｅｒｅａｓｔｈｅｒａｔｅｆｉｒｓｔｄｅｃｒｅａｓｅｄａｎｄｔｈｅｎｉｎｃｒｅａｓｅｄｗｉｔｈｉｎｃｒｅａｓｉｎｇＶＣｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ．Ａｍｏｎｇｔｈｅｍ，ｔｈｅｂｒｏｗｎｉｎｇｒａｔｅｉｎｃａｌｌｕｓｏｆｓｔｅｍｓｅｇｍｅｎｔｓ，ｒｏｏｔｓａｎｄｌｅａｖｅｓｗａｓｔｈｅｌｏｗｅｓｔｗｈｅｎｔｈｅＡＣｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆ４．０ｇ／Ｌｗａｓａｄｄｅｄ，ｒｅａｃｈｉｎｇ１６．３％，３３．３％ａｎｄ２６．７％，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．ＴｈｅｇｒｏｗｔｈｏｆｃａｌｌｉｉｎｔｈｅｅｘｐｌａｎｔｓｔｒｅａｔｅｄｗｉｔｈＶＣａｎｄＰＶＰｗａｓｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈａｔｉｎｔｈｅＡＣｔｒｅａｔｍｅｎｔ．Ｈｏｗｅｖｅｒ，ｗｈｅｎｔｈｅ０ ４ｇ／ＬｏｆＶＣｗａｓａｐｐｌｉｅｄ，ｔｈｅｃｕｍｕｌａｔｉｖｅｇｒｏｗｔｈｏｆｃａｌｌｉｉｎｓｔｅｍｓｅｇｍｅｎｔｓｗａｓｔｈｅｈｉｇｈｅｓｔ（６．６９ｇ）．Ｗｉｔｈｉｎｃｒｅａｓｉｎｇｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｏｆａｎｔｉ⁃ｂｒｏｗｎｉｎｇａｇｅｎｔｓ，ＰＡＬａｃｔｉｖｉｔｙｉｎｃａｌｌｕｓｇｒａｄｕａｌｌｙｄｅｃｒｅａｓｅｄ，ｗｈｅｒｅａｓｔｈｅａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｏｆＰＰＯａｎｄＰＯＤｓｈｏｗｅｄａｕｎｉｍｏｄａｌｔｒｅｎｄ．Ｍｏｒｅｏｖｅｒ，ｔｈｅｅｎｚｙｍａｔｉｃａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｃａｌｌｕｓｅｘｐｌａｎｔｓｆｒｏｍｌｅａｖｅｓｗａｓｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈａｔｏｆｓｔｅｍｓｅｇｍｅｎｔｓａｎｄｒｏｏｔｓ．ＰｅａｒｓｏｎｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｃａｌｌｕｓｂｒｏｗｎｉｎｇｒａｔｅｗａｓｐｏｓｉｔｉｖｅｌｙｃｏｒｒｅｌａｔｅｄｗｉｔｈＰＡＬａｃｔｉｖｉｔｙ（Ｐ＜０．０１），ｗｈｅｒｅａｓｃａｌｌｕｓｇｒｏｗｔｈｗａｓｐｏｓｉｔｉｖｅｌｙｃｏｒｒｅｌａｔｅｄｗｉｔｈＰＰＯａｎｄＰＯＤａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ（Ｐ＜０．０１）．ʌＣｏｎｃｌｕｓｉｏｎɔＴｈｅｔｙｐｅｓａｎｄｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｏｆａｎｔｉ⁃ｂｒｏｗｎｉｎｇａｇｅｎｔｓｈａｖｅａｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｅｆｆｅｃｔｏｎｔｈｅｂｒｏｗｎｉｎｇａｎｄｇｒｏｗｔｈｏｆＣ．ｐａｌｉｕｒｕｓｃａｌｌｕｓ．ＡＣｈａｓｔｈｅｂｅｓｔａｎｔｉ⁃ｂｒｏｗｎｉｎｇｅｆｆｅｃｔ，ｂｕｔｓｏｍｅｗｈａｔｉｎｈｉｂｉｔｓｃａｌｌｕｓｇｒｏｗｔｈ．ＰＡＬｅｎｚｙｍｅａｃｔｉｖｉｔｙｐｌａｙｓａｋｅｙｒｏｌｅｉｎｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇｃａｌｌｕｓｂｒｏｗｎｉｎｇ，ａｎｄｔｈｅｓｅｌｅｃｔｉｏｎｏｆｅｘｐｌａｎｔｏｒｇａｎｓｉｓｃｒｕｃｉａｌｄｕｒｉｎｇｔｉｓｓｕｅｃｕｌｔｕｒｅｏｆＣ．ｐａｌｉｕｒｕｓ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｃｙｃｌｏｃａｒｙａｐａｌｉｕｒｕｓ；ｔｉｓｓｕｅｃｕｌｔｕｒｅ；ｅｘｐｌａｎｔ；ｃａｌｌｕｓ；ｂｒｏｗｎｉｎｇｒａｔｅ；ｅｎｚｙｍｅａｃｔｉｖｉｔｙ㊀㊀青钱柳（Ｃｙｃｌｏｃａｒｙａｐａｌｉｕｒｕｓ）又名青钱李㊁摇钱树等，系胡桃科（Ｊｕｇｌａｎｄａｃｅａｅ）青钱柳属，主要分布于安徽㊁浙江㊁湖南㊁四川等亚热带地区［１］㊂研究发现，青钱柳中富含多酚类㊁黄酮类和三萜类等生物活性成分，具有抗氧化㊁抗肿瘤㊁抗菌等功效［２－４］㊂然而，青钱柳因其雌雄异型异熟的特性，导致其种子饱满率低，并且具有深度休眠特性，严重限制了青钱柳的开发和利用［５－６］㊂而基于组织培养技术的离体快繁技术不仅可以解决种苗供应不足，对突破季节限制组织培养生产次生代谢物质也具有特殊的理论和现实意义［７－８］㊂但由于青钱柳中含有较高的酚类物质，组培中的褐化问题成为其愈伤组织死亡和制约建立其快速繁殖体系的重要原因㊂褐化主要是由于植物组织细胞中的酚类物质氧化形成醌类物质，从而使组织呈现褐色的现象，因此在培养基中添加抗氧化剂抑制酚类物质的合成和氧化成为目前缓解外植体褐化问题的主要措施［９－１０］㊂目前，关于青钱柳组培褐化控制的研究主要集中在外植体的预处理［１１］㊁调整继代时间［１２］㊁添加抗氧化剂［１０，１３］和激素处理［１４］等４个方面㊂研究表明，添加抗氧化剂和激素在一定程度起到增加愈伤组织的增长量和降低褐化率的效果［１５－１７］㊂也有研究表明，外植体的取样部位也是影响褐化的重要因素，木质化程度越高的外植体褐化程度越高，幼嫩的材料褐化率相对较低［１８］㊂然而，有关青钱柳不同部位外植体愈伤组织褐化率㊁添加吸附剂活性炭（ＡＣ）及相关生理指标的研究鲜见报道㊂因此，本研究以无菌实生苗的不同器官为试验材料，添加具有抗氧化作用的维生素Ｃ（ＶＣ）㊁对酚类物质具有专一吸附作用的聚乙烯吡咯烷酮（ＰＶＰ）和具有无选择性吸附作用的ＡＣ作为抗褐化剂，并探究抗褐化剂种类和浓度对青钱柳愈伤组织褐变及其相关代谢酶活性的影响，旨在筛选褐化率低和愈伤组织生长量较高的抗褐化剂种类和最适浓度，为解决青钱柳组织培养过程中愈伤组织的褐化问题提供数据支撑和科学依据，为进一步组织培养生产次生代谢物质和建立快速繁殖体系奠定基础㊂１㊀材料与方法１．１㊀无菌实生苗培养材料及培养条件试验材料为采自江苏省镇江种苗基地（１１９ʎ３２ᶄ５２ᵡＥ，３０ʎ１６ᶄ４０ᵡＮ）的青钱柳成熟种子，种子采集后进行去翅㊁水筛，将沉淀的种子置于４ħ冰箱内保存㊂接种前对种子进行消毒处理，先用饱和洗衣粉水冲洗５ｍｉｎ，再在流水下冲洗１ｈ㊂冲洗干净后在超净工作台上对种子进行表面灭菌，先用７０％（体积分数，下同）酒精浸泡１ｍｉｎ，之后用０ ２％（质量分数，下同）ＨｇＣｌ２浸泡２０ｍｉｎ，最后用无菌水冲洗８次，用无菌水浸泡封口后置于超净台上过夜㊂于第２天和第３天在无菌条件下各换１次无菌水，继续浸泡㊂第４天在无菌条件下换０ １％ＨｇＣｌ２摇动５ｍｉｎ，浸泡过夜㊂第５天将浸泡后的种子用无菌水冲洗８次后，在超净工作台上进行剥种㊂取含胚轴和至少１／２子叶完整的胚作为接种试材，以获得无菌实生苗㊂无菌实生苗的培养基配方为：ＷＰＭ＋蔗糖３０ｇ／Ｌ＋琼脂６ｇ／Ｌ，ｐＨ调至５．８，１２１ħ高压灭菌８６１㊀第６期王㊀纪，等：不同抗褐化剂对青钱柳愈伤组织酶活性和生长的影响２０ｍｉｎ，培养温度２５ħ㊁相对湿度６０％㊁光照时间１２ｈ／ｄ㊁光照度２０００ｌｘ㊂１．２㊀愈伤组织诱导材料及培养条件分别取无菌实生苗的完整叶片㊁根部和茎部的１ｃｍ段作为外植体接入诱导培养基中进行愈伤组织诱导，３０ｄ后将诱导的愈伤组织进行两次继代㊂愈伤组织诱导培养基配方为：ＭＳ＋２．０ｍｇ／Ｌ６⁃ＢＡ＋１．０ｍｇ／ＬＩＢＡ＋蔗糖３０ｇ／Ｌ＋琼脂６ｇ／Ｌ，ｐＨ调至５．８，１２１ħ高压灭菌２０ｍｉｎ，培养温度２５ħ，相对湿度６０％，光照时间１２ｈ／ｄ，光照度１２００ｌｘ㊂１．３㊀抗褐化剂处理以愈伤组织诱导培养基为基本培养基，分别添加质量浓度为０．１㊁０．２㊁０．４和１．０ｇ／Ｌ的ＶＣ（分别记为ｚ１㊁ｚ２㊁ｚ３㊁ｚ４），１．０㊁３．０㊁５．０ｇ／Ｌ的ＰＶＰ（分别记为ｚ５㊁ｚ６㊁ｚ７）和１．０㊁２．０㊁４．０ｇ／Ｌ的活性炭ＡＣ（分别记为ｚ８㊁ｚ９㊁ｚ１０），共１０种处理㊂分别取茎段㊁叶片和根系经继代培养后外观条件基本一致的愈伤组织作为试验材料，分别接种到经１０种处理的培养基上，每种处理３个重复，每个重复１０瓶，每瓶接４块愈伤继续培养㊂１．４㊀测定指标方法１．４．１㊀愈伤组织鲜质量增长量和褐化率接种后于１０㊁２０㊁３０和４０ｄ统计愈伤组织鲜质量增长量和增长率，于４０ｄ时统计其褐化率㊂愈伤组织鲜质量增加量（ｇ／瓶）为每瓶收获鲜质量与每瓶接种鲜质量之差㊂愈伤组织褐化率为褐化数目占接种数目的百分比㊂１．４．２㊀生理指标的测定接种后于１０㊁２０㊁３０和４０ｄ分别取样，以鲜样进行生理指标的测定㊂苯丙氨酸解氨酶（ＰＡＬ）活性测定采用苯丙氨酸比色法，多酚氧化酶（ＰＰＯ）活性测定采用邻苯二酚比色法，过氧化物酶（ＰＯＤ）活性测定采用愈创木酚比色法［１９］㊂１．５㊀统计分析统计分析使用ＳＰＳＳ２０．０软件，多重比较采用新复极差法（Ｄｕｎｃａｎ，α＝０．０５），图表绘制分别使用Ｏｒｉｇｉｎ２０１７和Ｅｘｃｅｌ２０１６，数据为均值ʃ标准差㊂２㊀结果与分析２．１㊀抗褐化剂对青钱柳愈伤组织褐化的影响由不同处理下不同外植体愈伤组织的褐化率（表１）可知，不同种类和浓度抗褐化剂对青钱柳茎段㊁叶片和根系愈伤组织褐化率有显著影响（Ｐ＜０．０５）㊂３种外植体愈伤组织褐化率一般随抗褐化剂ＰＶＰ和ＡＣ浓度的升高而逐渐降低，其中叶片为外植体添加ＰＶＰ抗褐化剂时呈现先降低后升高的趋势㊂添加ＶＣ的３种外植体的愈伤组织褐化率都随着浓度的升高呈现先降低后升高的趋势㊂与ＶＣ和ＰＶＰ相比，添加ＡＣ抑制褐化效果最佳，茎段㊁叶片和根系愈伤组织在ＡＣ质量浓度为４．０ｇ／Ｌ时褐化率最低分别为１６．７％㊁３３．３％和２６．７％㊂表１㊀抗褐化剂对青钱柳不同器官愈伤组织褐化率的影响Ｔａｂｌｅ１㊀Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆａｎｔｉ⁃ｂｒｏｗｎｉｎｇａｇｅｎｔｓｏｎｂｒｏｗｎｉｎｇｒａｔｅｏｆｃａｌｌｕｓｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｏｒｇａｎｓｏｆＣｙｃｌｏｃａｒｙａｐａｌｉｕｒｕｓ单位：％编号ｃｏｄｅ处理ｔｒｅａｔｍｅｎｔ抗褐化剂ａｎｔｉ⁃ｂｒｏｗｎｉｎｇａｇｅｎｔ质量浓度／（ｇ㊃Ｌ－１）ｍｅａｓｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ茎段ｓｔｅｍｓｅｇｍｅｎｔ叶片ｌｅａｆ根系ｒｏｏｔｚ１ＶＣ０．１５０．０ʃ１０．００ａ６６．７ʃ５．７７ａ４３．３０ʃ５．７７ａｂｃｚ２ＶＣ０．２４６．７ʃ５．７７ａｂ５６．７ʃ１１．５５ａｂ４０．００ʃ１０．００ａｂｃｚ３ＶＣ０．４４３．３ʃ５．７７ａｂ５３．３ʃ１５．２８ａｂｃ３６．７０ʃ１１．５５ａｂｃｚ４ＶＣ１．０５３．３ʃ５．７７ａ５６．７ʃ５．７７ａｂｃ５３．３０ʃ５．７７ａｚ５ＰＶＰ１．０５３．３ʃ１１．５５ａ５６．７ʃ５．７７ａｂ５３．３０ʃ２０．８２ａｚ６ＰＶＰ３．０４０．０ʃ１０．００ａｂｃ５０．０ʃ１０．００ａｂｃ５０．００ʃ１０．００ａｂｚ７ＰＶＰ５．０３３．３ʃ５．７７ｂｃｄ５３．３ʃ１１．５５ａｂｃ４３．３０ʃ５．７７ａｂｃｚ８ＡＣ１．０２６．７ʃ５．７７ｃｄｅ４３．３ʃ１５．２８ｂｃ３０．００ʃ１０．００ｂｃｚ９ＡＣ２．０２３．３ʃ５．７７ｄｅ３６．７ʃ１１．５５ｂｃ２６．７０ʃ５．７７ｃｚ１０ＡＣ４．０１６．７ʃ５．７７ｅ３３．３ʃ５．７７ｃ２６．７０ʃ１５．２８ｃ㊀㊀注：同列不同小写字母表示不同抗褐化剂处理间差异显著，（Ｐ＜０．０５）㊂下同㊂Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｌｏｗｅｒｃａｓｅｌｅｔｔｅｒｓｉｎｔｈｅｓａｍｅｃｏｌｕｍｎｉｎ⁃ｄｉｃａｔｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓｂｅｔｗｅｅｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔａｎｔｉ⁃ｂｒｏｗｎｉｎｇａｇｅｎｔｔｒｅａｔ⁃ｍｅｎｔｓ（Ｐ＜０．０５）．Ｔｈｅｓａｍｅｂｅｌｏｗ．㊀㊀由表１还可以看出，不同处理叶片愈伤组织褐化率高于茎段和根系㊂添加质量浓度为０ １㊁０ ２和０ ４ｇ／Ｌ的ＶＣ处理茎段愈伤组织褐化率略高于根系，添加ＰＶＰ（３．０和５．０ｇ／Ｌ）和ＡＣ处理根系愈伤组织褐化率略高于茎段㊂２．２㊀抗褐化剂对青钱柳愈伤组织增长量的影响不同种类和浓度抗褐化剂处理对青钱柳茎段㊁叶片和根系愈伤组织增长量均具有显著影响（Ｐ＜０．０５，表２）㊂在培养过程中，添加ＶＣ㊁ＰＶＰ和ＡＣ处理的茎段㊁叶片和根系愈伤组织每１０ｄ的增长量随浓度增加并未呈现一致变化规律，但添加ＰＶＰ和ＡＣ处理愈伤组织累计增长量（０ ４０ｄ）随浓度增加呈增加趋势，添加ＶＣ处理随浓度增加呈先增加后降低趋势，在０．４ｇ／Ｌ（ｚ３处理）时最高㊂由表２还可以看出，添加ＶＣ和ＰＶＰ处理不同外植体愈伤组织增长量高于ＡＣ处理，且这一差距随培养时间延长而增大㊂茎段愈伤组织累计增长量在ＶＣ质量浓度为０．４ｇ／Ｌ（ｚ３）时最高为６．６９ｇ，在ＡＣ质量浓度为２．０ｇ／Ｌ（ｚ９）时最低仅为０．３４ｇ；叶片和根系愈伤组织累计增长量在ＰＶＰ质量浓度为９６１南京林业大学学报（自然科学版）第４７卷５ ０ｇ／Ｌ（ｚ７）时最高，分别为６．４４和５ ５６ｇ，在ＡＣ质量浓度为１．０ｇ／Ｌ（ｚ８）时最低，分别为０．２５ｇ和０．４５ｇ㊂除个别处理外，茎段㊁叶片和根系愈伤组织增长量随培养时间呈逐渐增加趋势，在３０ ４０ｄ增长量最高，且不同外植体平均愈伤组织增长量从大到小依次为：茎段＞叶片＞根系，茎段愈伤组织质量为３ ５７ｇ，分别为叶片和根系的１．１７和１．１９倍㊂表２㊀抗褐化剂对青钱柳不同器官愈伤组织增长量的影响Ｔａｂｌｅ２㊀Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆａｎｔｉ⁃ｂｒｏｗｎｉｎｇａｇｅｎｔｓｏｎｃａｌｌｕｓｇｒｏｗｔｈｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｏｒｇａｎｓｏｆＣ．ｐａｌｉｕｒｕｓ单位：ｇ器官ｏｒｇａｎ处理时间／ｄｔｒｅａｔｍｅｎｔｔｉｍｅ增长量ｇｒｅｗｔｈｚ１ｚ２ｚ３ｚ４ｚ５ｚ６ｚ７ｚ８ｚ９ｚ１０茎段ｓｔｅｍｓｅｇｍｅｎｔ１００．４３ʃ０．１０ａｂ０．６８ʃ０．２０ａ０．７０ʃ０．２１ａ０．３８ʃ０．０７ａｂ０．３６ʃ０．０８ａｂ０．３９ʃ０．０８ａｂ０．４０ʃ０．１６ａｂ０．１３ʃ０．０３ｂ０．１６ʃ０．０５ｂ０．１４ʃ０．０２ｂ２００．９８ʃ０．１６ａ１．１３ʃ０．３８ａ１．０９ʃ０．３９ａ０．７５ʃ０．１５ａ０．７０ʃ０．１６ａ０．９０ʃ０．２２ａ０．９２ʃ０．１２ａ０．１２ʃ０．０７ｂ０．１２ʃ０．０３ｂ０．１５ʃ０．０５ｂ３０１．１１ʃ０．４４ａ１．７２ʃ０．９６ａ１．５７ʃ０．６１ａ１．３７ʃ０．４２ａ０．９６ʃ０．１ａ１．２８ʃ０．２７ａ１．６４ʃ０．５５ａ０．０１ʃ０．０５ｃ０．０３ʃ０．１１ｃ０．１５ʃ０．０６ｂ４０１．３３ʃ０．２８ｂ２．３２ʃ２．６ａｂ３．３３ʃ１．０６ａ２．６０ʃ０．３９ａｂ１．４０ʃ０．０７ｂ１．９２ʃ０．５７ａｂ２．１８ʃ１．０７ａｂ０．０９ʃ０．４６ｃ０．０３ʃ０．０５ｄ０．０４ʃ０．１９ｄ叶片ｌｅａｆ１００．５０ʃ０．１２ａ０．４３ʃ０．１３ａｂ０．４ʃ０．１５ａｂ０．３６ʃ０．１１ａｂ０．５２ʃ０．１５ａ０．３５ʃ０．１１ａ０．５１ʃ０．１４ａｂ０．１９ʃ０．０６ｂ０．１９ʃ０．０４ｂ０．２３ʃ０．０６ｂ２００．８２ʃ０．２３ａｂ０．６８ʃ０．２２ｂ０．５５ʃ０．１４ｂ０．５２ʃ０．２０ｂ０．７５ʃ０．１４ａ０．７０ʃ０．２５ａｂ１．０２ʃ０．２３ａｂ０．１２ʃ０．０４ｃ０．１０ʃ０．０４ｃ０．１７ʃ０．０７ｃ３０１．２８ʃ０．３７ａｂ１．０６ʃ０．３３ａｂ１．０６ʃ０．１８ａｂ０．８７ʃ０．２０ａｂ１．０７ʃ０．１４ａ１．１７ʃ０．４８ａｂ１．６０ʃ０．１４ａｂ－０．０５ʃ０．０１ｂ－０．０２ʃ０．０１ｃ０．０７ʃ０．０３ｄ４００．７３ʃ０．２０ｃ２．２３ʃ０．５３ａｂ２．１６ʃ０．４３ａｂ１．３３ʃ０．２６ｂ１．６６ʃ０．０６ａ１．８４ʃ０．３４ｂｃ３．３１ʃ０．７５ａｂ－０．０２ʃ０．００ｄ０．００ʃ０．００ｅ０．０７ʃ０．０２ｅ根系ｒｏｏｔ１００．３６ʃ０．１１ａ０．２８ʃ０．０８ａｂ０．３１ʃ０．０７ａ０．２９ʃ０．１０ａ０．２４ʃ０．０６ａ０．４０ʃ０．０９ａ０．４４ʃ０．０６ａ０．１３ʃ０．０４ｃ０．１８ʃ０．０５ｂｃ０．２０ʃ０．０７ｂｃ２００．３６ʃ０．１１ａ０．５３ʃ０．１６ａｂ０．５４ʃ０．１６ａｂ０．６１ʃ０．２３ａｂ０．６６ʃ０．２２ａｂ０．７６ʃ０．２８ｂ０．８６ʃ０．２８ａ０．４４ʃ０．１５ｂ０．１７ʃ０．０６ｃ０．１８ʃ０．０３ｃ３００．６１ʃ０．２２ａ０．８８ʃ０．３３ａｂ１．０１ʃ０．４９ａｂ０．９４ʃ０．３１ａｂ１．０１ʃ０．２５ａｂ１．４３ʃ０．５７ｂ１．５６ʃ０．３６ａ－０．２４ʃ０．０６ｃ０．１１ʃ０．０４ｂｃ０．１８ʃ０．０３ｂ４００．９８ʃ０．３ａｂ０．９３ʃ０．１６ａｂ２．７２ʃ１．０４ｂ２．２０ʃ０．６３ａ２．５０ʃ０．５１ａｂ２．２０ʃ０．６２ｂ２．７０ʃ０．２１ａｂ０．１１ʃ０．０４ｃ０．１１ʃ０．０４ｃ０．１４ʃ０．０５ｃ㊀㊀２．３㊀抗褐化剂对青钱柳愈伤组织相关酶活性的影响２．３．１㊀苯丙氨酸解氨酶（ＰＡＬ）活性由抗褐化剂对青钱柳不同器官愈伤组织ＰＡＬ活性的影响结果（图１ａ）可知，青钱柳茎段㊁叶片和根系愈伤组织ＰＡＬ活性在不同抗褐化剂种类和浓度处理间有显著差异（Ｐ＜０．０５）㊂添加ＰＶＰ和ＶＣ处理的茎段㊁叶片和根系愈伤组织ＰＡＬ活性略高于ＡＣ处理㊂在０ ４０ｄ，所有处理不同器官愈伤组织ＰＡＬ活性均值在叶片中最高为７５２６．８Ｕ／（ｇ㊃ｈ），比茎段和根系分别高出４２．３％和不同小写字母表示不同抗褐化剂处理间有显著差异（Ｐ＜０．０５）㊂下同㊂Ｔｈｅｓａｍｅｂｅｌｏｗ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｌｏｗｅｒｃａｓｅｌｅｔｔｅｒｓｉｎｄｉｃａｔｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓａｍｏｎｇｔｈｅｔｅｎａｎｔｉ－ｂｒｏｗｎｉｎｇａｇｅｎｔｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ（Ｐ＜０．０５）．Ｔｈｅｓａｍｅｂｅｌｏｗ．图１㊀抗褐化剂对青钱柳不同器官愈伤组织ＰＡＬ活性的影响Ｆｉｇ．１㊀Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆａｎｔｉ⁃ｂｒｏｗｎｉｎｇａｇｅｎｔｓｏｎＰＡＬａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｃａｌｌｕｓｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｏｒｇａｎｓｏｆＣｙｃｌｏｃａｒｙａｐａｌｉｕｒｕｓ㊀㊀由图１还可以看出，愈伤组织ＰＡＬ活性随抗褐化剂添加浓度的增加整体呈逐渐降低的趋势㊂在０ ４０ｄ，ｚ３㊁ｚ４㊁ｚ６和ｚ７处理茎段愈伤组织ＰＡＬ活性变化相对平稳；ｚ１０处理ＰＡＬ活性显著低于其他处理，而ｚ１和ｚ５处理ＰＡＬ活性较高（图１ａ）㊂除ｚ３处理外，其他处理叶片愈伤组织ＰＡＬ活性在０ ４０ｄ均具有较大变化幅度，ｚ１处理的ＰＡＬ活性显著高于其他处理（图１ｂ）㊂根系愈伤组织ＰＡＬ活性在培养过程中整体呈逐渐降低的趋势；ｚ１处理愈伤组织ＰＡＬ活性最高，而以ｚ９和ｚ１０处理ＰＡＬ活性最低（图１ｃ）㊂２．３．２㊀多酚氧化酶（ＰＰＯ）活性抗褐化剂种类和浓度对青钱柳茎段㊁叶片和根系愈伤组织ＰＰＯ活性有显著影响（Ｐ＜０．０５，图２）㊂添加ＰＶＰ处理（ｚ５ ｚ７）的茎段㊁叶片和根系愈伤组织ＰＰＯ活性高于添加ＡＣ（ｚ８ ｚ１０）和ＶＣ（ｚ１ ｚ４）０７１㊀第６期王㊀纪，等：不同抗褐化剂对青钱柳愈伤组织酶活性和生长的影响处理㊂在０ ４０ｄ，不同处理愈伤组织ＰＰＯ活性在不同器官中均值从大到小依次为：叶片＞茎段＞根系，分别为８５８．１㊁７１３．７和７０５．５Ｕ／（ｇ㊃ｍｉｎ）㊂茎段㊁叶片和根系愈伤组织ＰＰＯ活性随抗褐化剂添加浓度的增加整体呈先增加后降低的单峰变化趋势㊂在０ ４０ｄ，添加ＡＣ处理的茎段愈伤组织ＰＰＯ活性变化相对平稳，ｚ８处理ＰＰＯ活性低于其他处理（图２ａ）㊂除ｚ２和ｚ４处理外，其他叶片愈伤组织ＰＰＯ活性在培养过程中均有较大变化幅度，ｚ３和ｚ６处理ＰＰＯ活性高于其他处理，而ｚ８低于其他处理（图２ｂ）㊂根系愈伤组织ＰＰＯ活性在培养过程中均有较大变异幅度，ｚ６和ｚ７处理在第３０ｄ时活性最高，而其他处理均在第３０ｄ活性最低（图２ｃ）㊂图２㊀抗褐化剂对青钱柳不同器官愈伤组织ＰＰＯ活性的影响Ｆｉｇ．２㊀Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆａｎｔｉ⁃ｂｒｏｗｎｉｎｇａｇｅｎｔｓｏｎＰＰＯａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｃａｌｌｕｓｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｏｒｇａｎｓｏｆＣ．ｐａｌｉｕｒｕｓ２．３．３㊀过氧化物酶（ＰＯＤ）活性抗褐化剂种类和浓度对青钱柳茎段㊁叶片和根系愈伤组织ＰＯＤ活性有显著影响（Ｐ＜０．０５）㊂与茎段㊁叶片和根系愈伤组织ＰＯＤ活性较低㊂在培养阶段，不同处理愈伤组织ＰＯＤ活性在不同器官中均值从大到依次为：叶片＞茎段＞根系，分别为图３㊀抗褐化剂对青钱柳不同器官愈伤组织ＰＯＤ活性的影响Ｆｉｇ．３㊀Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆａｎｔｉ⁃ｂｒｏｗｎｉｎｇａｇｅｎｔｓｏｎＰＯＤａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｃａｌｌｕｓｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｏｒｇａｎｓｏｆＣ．ｐａｌｉｕｒｕｓ㊀㊀由图３还可看出，不同器官愈伤组织ＰＯＤ活性随抗褐化剂添加浓度的增加与ＰＰＯ呈一致单峰变化趋势㊂在培养过程中，不同处理茎段愈伤组织ＰＯＤ活性呈先增加后降低变化趋势，在第２０天或３０天达到最大值；ｚ３和ｚ６处理ＰＯＤ活性高于其他处理（图３ａ）㊂添加ＡＣ处理叶片愈伤组织ＰＯＤ活性在培养过程中变化平稳，ｚ２㊁ｚ３㊁ｚ５和ｚ７处理在第３０天和第４０天远高于第１０天和２０天；ｚ６处理ＰＯＤ活性显著高于其他处理（图３ｂ）㊂由图３ｃ可知，在０ ４０ｄ，ｚ８和ｚ９处理根系愈伤组织ＰＯＤ活性变化平稳，ｚ２㊁ｚ５和ｚ６处理变化明显，呈先增加后降低趋势；ｚ８和ｚ１０处理ＰＯＤ活性显著低于其他处理㊂２．４㊀相关性分析相关性分析结果（表３）表明，青钱柳愈伤组织褐化率与ＰＡＬ活性呈极显著正相关（Ｐ＜０．０１），但与ＰＰＯ和ＰＯＤ活性相关关系不显著㊂愈伤组织增长量与ＰＰＯ和ＰＯＤ活性显著正相关（Ｐ＜０ ０５），但与ＰＡＬ活性相关关系不显著㊂表３㊀青钱柳愈伤组织褐化率㊁增长量与生物酶活性指标的相关性分析Ｔａｂｌｅ３㊀Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓｏｆｂｒｏｗｎｉｎｇｒａｔｅ，ｇｒｏｗｔｈａｎｄｅｎｚｙｍｅａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｉｎｃａｌｌｕｓｏｆＣ．ｐａｌｉｕｒｕｓ指标ｉｎｄｅｘＰＡＬ活性ＰＡＬａｃｔｉｖｉｔｙＰＰＯ活性ＰＰＯａｃｔｉｖｉｔｙＰＯＤ活性ＰＯＤａｃｔｉｖｉｔｙ褐化率ｂｒｏｗｎｉｎｇｒａｔｅ０．５１６∗∗０．３５９０．３４７愈伤组织增长量ｃａｌｌｕｓｇｒｏｗｔｈ０．３１７０．６０８∗∗０．６３１∗∗㊀㊀注：∗∗．Ｐ＜０．０１㊂３㊀讨㊀论植物组织初代培养㊁愈伤组织的继代培养过程１７１南京林业大学学报（自然科学版）第４７卷中经常出现褐化现象，这对离体培养的外植体诱导和生长产生不利影响［７，２０］㊂在植物组织培养过程中，褐变的底物是酚类化合物，而ＰＡＬ是酚类化合物合成途径中的关键酶和限速酶［２１］，因此，ＰＡＬ与植物组织培养的愈伤组织褐变有密切的关系㊂谢寅峰等［１０］对青钱柳愈伤组织褐化的研究结果表明，青钱柳愈伤组织的ＰＡＬ活性在不同种类抗褐化剂处理下均受到抑制，并且随着抗褐化剂浓度的增加呈下降趋势㊂本研究也证实，３种抗褐化剂对青钱柳茎段㊁叶片和根系的愈伤组织内的ＰＡＬ活性的抑制效果在不同种类和浓度的抗褐化剂处理间存在显著差异（Ｐ＜０．０５），且ＰＡＬ活性均随着抗褐化剂添加量的增加而降低㊂同时，叶片的愈伤组织ＰＡＬ活性高于茎段和根系的愈伤组织，这可能是由于青钱柳叶是酚类物质合成的主要部位［２２］㊂另外，添加ＡＣ处理的愈伤组织ＰＡＬ的活性低于ＰＶＰ和ＶＣ处理的，这可能是因为ＡＣ的吸附没有选择性，导致了培养基中的营养物质也被吸附，从而造成酚类物质的合成底物减少［２３］㊂ＰＰＯ和ＰＯＤ是植物体内普遍存在的氧化酶，在组织培养中将酚类物质氧化成醌类物质，从而引起愈伤组织褐变，因此，ＰＰＯ和ＰＯＤ活性的高低也是引起愈伤组织褐变的关键［２４－２５］㊂本研究结果显示，青钱柳叶片的愈伤组织内ＰＰＯ和ＰＯＤ活性显著高于茎段和根系愈伤组织的，这可能是因为青钱柳叶的酚类物质含量显著高于根和茎的［２２］，且ＰＰＯ和ＰＯＤ活性均与愈伤组织内酚类物质含量呈正相关关系［２５－２６］㊂同时，青钱柳茎段㊁叶片和根系愈伤组织内的ＰＰＯ和ＰＯＤ活性均随着３种抗褐化剂浓度的增加呈现单峰趋势，这可能是由于过高浓度的抗褐化剂抑制了愈伤组织内的酚类物质的合成㊂添加ＰＶＰ处理的愈伤组织ＰＰＯ和ＰＯＤ活性高于ＡＣ和ＶＣ处理，这可能是因为ＡＣ处理的愈伤组织合成的酚类物质较少，而ＶＣ作为一种强抗氧化剂，既能作为醌类物质的还原剂，又能抑制ＰＰＯ的活性，从而起到抗褐化的作用［２７］㊂由于不同外植体的酚类物质含量存在差异，因此抗褐化剂种类的选择及其浓度对不同组织的抗褐化能力和愈伤组织增长的影响并不一致［１８，２７］，本研究结果也表明青钱柳茎段㊁叶片和根系的愈伤组织褐化率和增长量在不同种类和浓度的抗褐化剂的处理间存在差异㊂此外，研究发现，植物愈伤组织的褐化与相关酶活性密切相关［２８］㊂本研究的相关分析表明，青钱柳愈伤组织褐化率与ＰＡＬ活性呈极显著正相关（Ｐ＜０．０１），而愈伤组织增长量与ＰＰＯ和ＰＯＤ活性显著正相关（Ｐ＜０．０５）㊂这说明ＰＡＬ的活性在青钱柳愈伤组织褐化过程中到关键作用，而愈伤组织增长量受到ＰＰＯ和ＰＯＤ活性的影响㊂综合上述ＰＡＬ㊁ＰＰＯ和ＰＯＤ３种酶的研究结果发现，添加ＡＣ的处理对青钱柳愈伤组织褐化抑制效果最好，青钱柳茎段㊁叶片和根系的愈伤组织褐化率结果也显示添加ＡＣ处理的褐化率最低㊂但是，添加ＡＣ处理的茎段㊁叶片和根系的愈伤组织增长量也是最低的，甚至抑制青钱柳愈伤组织的生长，这与陈雪梅等［２６］和冯代弟［２９］的研究结果一致，ＡＣ是一种无选择性的吸附剂，其在吸附酚类物质的同时也会影响培养基的营养物质的含量，导致生长受阻㊂同时高浓度的ＰＶＰ会抑制青钱柳茎段㊁叶片和根系的愈伤组织增长，可能是因为高浓度的ＰＶＰ会抑制植物对６⁃ＢＡ等有益物质的吸收利用［３０］㊂而高浓度的ＶＣ会增加青钱柳茎段㊁叶片和根系的愈伤组织褐化率，这可能是因为ＶＣ浓度过高时，部分ＶＣ会与氨基酸发生反应，增加褐化程度［３１－３２］㊂因此，在对青钱柳进行组织培养时，除了选择最适宜抗褐化剂及其最适浓度，还需对青钱柳外植体材料进行选择㊂综上所述，不同抗褐化剂及其不同浓度对青钱柳愈伤组织褐化率和生长的影响有所差异，以４ ０ｇ／Ｌ的ＡＣ处理褐化率最低，以０ ４ｇ／Ｌ的ＶＣ处理茎段愈伤组织累计增长量最高㊂进一步探索愈伤组织的褐化率与相关酶活性的关系，ＰＡＬ酶活性在愈伤组织褐化过程中起到关键作用，可以作为青钱柳组织培养过程中褐化控制的主要参考酶指标，同时外植体器官的类型选择也是控制褐化要考虑的因素㊂研究结果为青钱柳建立组织培养快速繁殖体系和离体生产次生代谢物质提供了一定的理论基础和技术支撑，但对其次生代谢物质的积累和褐化机理还有待进一步深入研究㊂参考文献（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）：［１］方升佐，洑香香．青钱柳资源培育与开发利用的研究进展［Ｊ］．南京林业大学学报（自然科学版），２００７，３１（１）：９５－１００．ＦＡＮＧＳＺ，ＦＵＸＸ．ＰｒｏｇｒｅｓｓａｎｄｐｒｏｓｐｅｃｔｓｏｎｓｉｌｖｉｃｕｌｔｕｒｅａｎｄｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎｏｆＣｙｃｌｏｃａｒｙａｐａｌｉｕｒｕｓｒｅｓｏｕｒｃｅｓ［Ｊ］．ＪＮａｎｊｉｎｇＦｏｒＵｎｉｖ（ＮａｔＳｃｉＥｄ），２００７，３１（１）：９５－１００．ＤＯＩ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１０００－２００６．２００７．０１．０２３．［２］ＺＨＯＵＭＭ，ＱＵＥＫＳＹ，ＳＨＡＮＧＸＬ，ｅｔａｌ．ＧｅｏｇｒａｐｈｉｃａｌｖａｒｉａｔｉｏｎｓｏｆｔｒｉｔｅｒｐｅｎｏｉｄｃｏｎｔｅｎｔｓｉｎＣｙｃｌｏｃａｒｙａｐａｌｉｕｒｕｓｌｅａｖｅｓａｎｄｔｈｅｉｒｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙｅｆｆｅｃｔｓｏｎＨｅＬａｃｅｌｌｓ［Ｊ］．ＩｎｄＣｒｏｐｓＰｒｏｄ，２０２１，１６２：１１３３１４．ＤＯＩ：１０．１０１６／ｊ．ｉｎｄｃｒｏｐ．２０２１．１１３３１４．［３］ＷＵＺＦ，ＭＥＮＧＦＣ，ＣＡＯＬＪ，ｅｔａｌ．ＴｒｉｔｅｒｐｅｎｏｉｄｓｆｒｏｍＣｙｃｌｏｃａｒｙａｐａｌｉｕｒｕｓａｎｄｔｈｅｉｒｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙｅｆｆｅｃｔｏｎｔｈｅｓｅｃｒｅｔｉｏｎｏｆａｐｏｌｉｐｒｏｔｅｉｎＢ４８ｉｎＣａｃｏ⁃２ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１７，１４２：２７１㊀第６期王㊀纪，等：不同抗褐化剂对青钱柳愈伤组织酶活性和生长的影响７６－８４．ＤＯＩ：１０．１０１６／ｊ．ｐｈｙｔｏｃｈｅｍ．２０１７．０６．０１５．［４］ＸＩＥＰＪ，ＨＵＡＮＧＬＸ，ＺＨＡＮＧＣＨ，ｅｔａｌ．Ｐｈｅｎｏｌｉｃｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ，ａｎｄａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｏｆｏｌｉｖｅｌｅａｆａｎｄｆｒｕｉｔ（ＯｌｅａｅｕｒｏｐａｅａＬ．）ｅｘｔｒａｃｔｓａｎｄｔｈｅｉｒｓｔｒｕｃｔｕｒｅ⁃ａｃｔｉｖｉｔｙｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ［Ｊ］．ＪＦｕｎｃｔＦｏｏｄｓ，２０１５，１６：４６０－４７１．ＤＯＩ：１０．１０１６／ｊ．ｊｆｆ．２０１５．０５．００５．［５］黄鹏，毛霞，韩歌，等．雌雄异型异熟青钱柳花发育过程中养分的动态变化［Ｊ］．南京林业大学学报（自然科学版），２０１８，４２（５）：１－９．ＨＵＡＮＧＰ，ＭＡＯＸ，ＨＡＮＧ，ｅｔａｌ．ＤｙｎａｍｉｃｃｈａｎｇｅｓｏｆｎｕｔｒｉｅｎｔｓｄｕｒｉｎｇｆｌｏｒａｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｉｎｈｅｔｅｒｏｄｉｃｈｏｇａｍｏｕｓＣｙｃｌｏｃａｒｙａｐａｌｉｕｒｕｓ［Ｊ］．ＪＮａｎｊｉｎｇＦｏｒＵｎｉｖ（ＮａｔＳｃｉＥｄ），２０１８，４２（５）：１－９．ＤＯＩ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１０００－２００６．２０１８０２０１８．［６］杨万霞，方升佐．青钱柳种子综合处理过程中内源激素的动态变化［Ｊ］．南京林业大学学报（自然科学版），２００８，３２（５）：８５－８８．ＹＡＮＧＷＸ，ＦＡＮＧＳＺ．Ｄｙｎａｍｉｃｃｈａｎｇｅｓｏｆｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓｈｏｒ⁃ｍｏｎｅｓｉｎＣｙｃｌｏｃａｒｙａｐａｌｉｕｒｕｓｓｅｅｄｄｕｒｉｎｇｓｔｒａｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ［Ｊ］．ＪＮａｎ⁃ｊｉｎｇＦｏｒＵｎｉｖ（ＮａｔＳｃｉＥｄ），２００８，３２（５）：８５－８８．ＤＯＩ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１０００－２００６．２００８．０５．０１９．［７］梁艳，赵雪莹，许昕，等．黑皮油松外植体的抗褐化处理与诱导培养［Ｊ］．分子植物育种，２０２０，１８（２１）：７１７３－７１７８．ＬＩＡＮＧＹ，ＺＨＡＯＸＹ，ＸＵＸ，ｅｔａｌ．Ａｎｔｉ⁃ｂｒｏｗｎｉｎｇｔｒｅａｔｍｅｎｔｓａｎｄｉｎｄｕｃｅｄｃｕｌｔｕｒｅｏｎｔｈｅｅｘｐｌａｎｔｓｏｆＰｉｎｕｓｔａｂｕｌｉｆｏｒｍｉｓｖａｒ．ｍｕｋｄｅｎｓｉｓ［Ｊ］．ＭｏｌＰｌａｎｔＢｒｅｅｄ，２０２０，１８（２１）：７１７３－７１７８．ＤＯＩ：１０．１３２７１／ｊ．ｍｐｂ．０１８．００７１７３．［８］李琰，王冬梅，姜在民，等．培养基及培养条件对杜仲愈伤组织生长及次生代谢产物含量的影响［Ｊ］．西北植物学报，２００４，２４（１０）：１９１２－１９１６．ＬＩＹ，ＷＡＮＧＤＭ，ＪＩＡＮＧＺＭ，ｅｔａｌ．Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆｂａｓｉｃｍｅｄｉａａｎｄｃｕｌｔｕｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｏｎｇｒｏｗｔｈｏｆｃａｌｌｕｓｅｓａｎｄｐｒｏ⁃ｄｕｃｔｉｏｎｏｆｓｅｃｏｎｄａｒｙｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓｏｆＥｕｃｏｍｍｉａｕｌｍｏｉｄｅｓ［Ｊ］．ＡｃｔａＢｏｔＢｏｒｅａｌｉＯｃｃｉｄｅｎｔａｌｉａＳｉｎ，２００４，２４（１０）：１９１２－１９１６．ＤＯＩ：１０．３３２１／ｊ．ｉｓｓｎ：１０００－４０２５．２００４．１０．０２５．［９］郭艳，杨海玲．植物组织培养中的褐化现象及解决途径［Ｊ］．山西农业科学，２００９，３７（７）：１４－１６，３１．ＧＵＯＹ，ＹＡＮＧＨＬ．Ａｄ⁃ｖａｎｃｅｓｉｎｓｔｕｄｉｅｓｏｎｂｒｏｗｎｉｎｇｉｎｐｌａｎｔｔｉｓｓｕｅｃｕｌｔｕｒｅ［Ｊ］．ＪＳｈａｎｘｉＡｇｒｉｃＳｃｉ，２００９，３７（７）：１４－１６，３１．ＤＯＩ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００２－２４８１．２００９．０７．００４．［１０］谢寅峰，张志敏，张颖颖，等．３种抗氧化剂对青钱柳愈伤组织褐化的影响［Ｊ］．安徽农业大学学报，２０１５，４２（４）：４９３－４９８．ＸＩＥＹＦ，ＺＨＡＮＧＺＭ，ＺＨＡＮＧＹＹ，ｅｔａｌ．ＥｆｆｅｃｔｓｏｆｔｈｒｅｅａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓｏｎｃａｌｌｕｓｂｒｏｗｎｉｎｇｏｆＣｙｃｌｏｃａｒｙａｐａｌｉｕｒｕｓ［Ｊ］．ＪＡｎｈｕｉＡｇｒｉｃＵｎｉｖ，２０１５，４２（４）：４９３－４９８．ＤＯＩ：１０．１３６１０／ｊ．ｃｎｋｉ．１６７２－３５２ｘ．２０１５０６２６．０１０．［１１］吴群英，徐庆，李丽亚，等．青钱柳不同外植体组织培养及褐变防止的研究［Ｊ］．时珍国医国药，２００８，１９（８）：１８７２－１８７４．ＷＵＱＹ，ＸＵＱ，ＬＩＬＹ，ｅｔａｌ．Ｓｔｕｄｙｏｎｔｉｓｓｕｅｃｕｌｔｕｒｅｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｅｘ⁃ｐｌａｎｔｓａｎｄｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎｏｆｂｒｏｗｎｉｎｇｏｆＣｙｃｌｏｃａｒｙａｐａｌｉｕｒｕｓ（Ｂａｔａｌ．）Ｉｊｉｎｓｋａｊａ［Ｊ］．ＬｉｓｈｉｚｈｅｎＭｅｄＭａｔｅｒＭｅｄＲｅｓ，２００８，１９（８）：１８７２－１８７４．ＤＯＩ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００８－０８０５．２００８．０８．０３４．［１２］王莹．青钱柳离体快繁及生根机理的初步研究［Ｄ］．南京：南京林业大学，２００８．ＷＡＮＧＹ．Ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙｓｔｕｄｉｅｓｏｎｒａｐｉｄｐｒｏｐａ⁃ｇａｔｉｏｎｉｎｖｉｔｒｏａｎｄｒｏｏｔｉｎｇｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆＣｙｃｌｏｃａｒｙａｐａｌｉｕｒｕｓ［Ｄ］．Ｎａｎｊｉｎｇ：ＮａｎｊｉｎｇＦｏｒｅｓｔｒｙＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，２００８．［１３］王纪，谢寅峰，方升佐．青钱柳愈伤组织诱导与增殖的初步研究［Ｊ］．安徽农业科学，２０１２，４０（３）：１３０９－１３１２．ＷＡＮＧＪ，ＸＩＥＹＦ，ＦＡＮＧＳＺ．Ａｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙｓｔｕｄｙｏｎｃａｌｌｕｓｉｎｄｕｃｔｉｏｎａｎｄｐｒｏ⁃ｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｏｆＣｙｌｏｃａｒｙａｐａｌｉｕｒｕｓ［Ｊ］．ＪＡｎｈｕｉＡｇｒｉｃＳｃｉ，２０１２，４０（３）：１３０９－１３１２．ＤＯＩ：１０．１３９８９／ｊ．ｃｎｋｉ．０５１７－６６１１．２０１２．０３．２１７．［１４］冯莹，钱莲文，林庆良．不同激素对青钱柳外植体和愈伤组织褐化的影响［Ｊ］．植物学报，２０１９，５４（５）：６３４－６４１．ＦＥＮＧＹ，ＱＩＡＮＬＷ，ＬＩＮＱＬ．ＴｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｈｏｒｍｏｎｅｓｏｎｅｘｐｌａｎｔｂｒｏｗｎｉｎｇａｎｄｃａｌｌｕｓｂｒｏｗｎｉｎｇｉｎＣｙｃｌｏｃａｒｙａｐａｌｉｕｒｕｓ［Ｊ］．ＢｕｌｌＢｏｔ，２０１９，５４（５）：６３４－６４１．ＤＯＩ：１０．１１９８３／ＣＢＢ１８１９３．［１５］ＡＬＩＨＭ，ＥＬ⁃ＧＩＺＡＷＹＡＭ，ＥＬ⁃ＢＡＳＳＩＯＵＮＹＲＥＩ，ｅｔａｌ．Ｂｒｏｗｎｉｎｇｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｂｙｃｙｓｔｅｉｎｅ，ａｓｃｏｒｂｉｃａｃｉｄａｎｄｃｉｔｒｉｃａｃｉｄ，ａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇＰＰＯ⁃ｃａｔｅｃｈｏｌ⁃ｃｙｓｔｅｉｎｅｒｅａｃｔｉｏｎｐｒｏｄｕｃｔｓ［Ｊ］．ＪＦｏｏｄＳｃｉＴｅｃｈｎｏｌ，２０１５，５２（６）：３６５１－３６５９．ＤＯＩ：１０．１００７／ｓ１３１９７－０１４－１４３７－０．［１６］ＹＡＲＩＫＡ，ＮＡＤＥＲＩ⁃ＭＡＮＥＳＨＨ，ＴＯＦＴＳＨ．ＥｆｆｅｃｔｏｆａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓａｎｄｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓｉｎｃａｌｌｕｓｃｕｌｔｕｒｅｓｏｆＴａｘｕｓｂｒｅｖｉｆｏ⁃ｌｉａ：ｅｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆｂｒｏｗｎｉｎｇ，ｃａｌｌｕｓｇｒｏｗｔｈ，ｔｏｔａｌｐｈｅｎｏｌｉｃｓａｎｄｐａ⁃ｃｌｉｔａｘｅｌｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｂｉｏｉｍｐａｃｔｓ，２０１１，１（１）：３７－４５．ＤＯＩ：１０．５６８１／ｂｉ．２０１１．００６．［１７］侯健华，李正红，马宏，等．地涌金莲组织培养中的褐化抑制［Ｊ］．林业科学研究，２０１５，２８（２）：２１７－２２１．ＨＯＵＪＨ，ＬＩＺＨ，ＭＡＨ，ｅｔａｌ．Ｓｔｕｄｉｅｓｏｎａｎｔｉ⁃ｂｒｏｗｎｉｎｇｄｕｒｉｎｇｔｉｓｓｕｅｃｕｌｔｕｒｅｏｆＭｕｓｅｌｌａｌａｓｉｏｃａｒｐａ［Ｊ］．ＦｏｒＲｅｓ，２０１５，２８（２）：２１７－２２１．ＤＯＩ：１０．１３２７５／ｊ．ｃｎｋｉ．ｌｙｋｘｙｊ．２０１５．０２．０１２．［１８］王倩颖，唐佳妮，刘志高，等．景宁木兰组织培养外植体选择与抗褐化研究［Ｊ］．广西植物，２０１７，３７（９）：１０８８－１０９５．ＷＡＮＧＱＹ，ＴＡＮＧＪＮ，ＬＩＵＺＧ，ｅｔａｌ．Ｅｘｐｌａｎｔｓｅｌｅｃｔｉｎｇａｎｄａｎｔｉ⁃ｂｒｏｗｎｉｎｇｏｆＭａｇｎｏｌｉａｓｉｎｏｓｔｅｌｌａｔａｉｎｔｉｓｓｕｅｃｕｌｔｕｒｅ［Ｊ］．Ｇｕｉｈａｉａ，２０１７，３７（９）：１０８８－１０９５．ＤＯＩ：１０．１１９３１／ｇｕｉｈａｉａ．ｇｘｚｗ２０１６１００１５．［１９］李合生．植物生理生化实验原理和技术［Ｍ］．北京：高等教育出版社，２０００．ＬＩＨＳ．Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓａｎｄｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓｏｆｐｌａｎｔｐｈｙｓｉｏ⁃ｌｏｇｉｃａｌｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ［Ｍ］．Ｂｅｉｊｉｎｇ：ＨｉｇｈｅｒＥｄｕｃａｔｉｏｎＰｒｅｓｓ，２０００．［２０］ＷＡＮＧＪＢ，ＬＩＵＢＨ，ＸＩＡＯＱ，ｅｔａｌ．Ｃｌｏｎｉｎｇａｎｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓｏｆｌｉｔｃｈｉ（ＬｉｔｃｈｉｃｈｉｎｅｎｓｉｓＳｏｎｎ．）ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌｏｘｉｄａｓｅｇｅｎｅａｎｄｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｗｉｔｈｐｏｓｔｈａｒｖｅｓｔｐｅｒｉｃａｒｐｂｒｏｗｎｉｎｇ［Ｊ］．ＰＬｏＳＯｎｅ，２０１４，９（４）：９３９８２．ＤＯＩ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００９３９８２．［２１］ＬＩＵＨ，ＳＯＮＧＬＬ，ＪＩＡＮＧＹＭ，ｅｔａｌ．Ｓｈｏｒｔ⁃ｔｅｒｍａｎｏｘｉａｔｒｅａｔｍｅｎｔｍａｉｎｔａｉｎｓｔｉｓｓｕｅｅｎｅｒｇｙｌｅｖｅｌｓａｎｄｍｅｍｂｒａｎｅｉｎｔｅｇｒｉｔｙａｎｄｉｎｈｉｂｉｔｓｂｒｏｗｎｉｎｇｏｆｈａｒｖｅｓｔｅｄｌｉｔｃｈｉｆｒｕｉｔ［Ｊ］．ＪＳｃｉＦｏｏｄＡｇｒｉｃ，２００７，８７（９）：１７６７－１７７１．ＤＯＩ：１０．１００２／ｊｓｆａ．２９２０．［２２］ＱＩＮＪ，ＹＵＥＸＬ，ＬＩＮＧＹ，ｅｔａｌ．ＮｉｔｒｏｇｅｎｆｏｒｍａｎｄｒａｔｉｏｉｍｐａｃｔｐｈｅｎｏｌｉｃａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎａｎｄｒｅｌａｔｉｖｅｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎＣｙｃｌｏｃａｒｙａｐａｌｉｕｒｕｓ［Ｊ］．Ｔｒｅｅｓ，２０２１，３５（２）：６８５－６９６．ＤＯＩ：１０．１００７／ｓ００４６８－０２０－０２０６８－６．［２３］肖小君，罗潼，王芳．木本植物组织培养过程中褐变现象及控制措施的研究进展［Ｊ］．江苏农业科学，２０１７，４５（１６）：２０－２４．ＸＩＡＯＸＪ，ＬＵＯＴ，ＷＡＮＧＦ．Ｒｅｓｅａｒｃｈｐｒｏｇｒｅｓｓｏｎｂｒｏｗｎｉｎｇｐｈｅ⁃ｎｏｍｅｎｏｎａｎｄｃｏｎｔｒｏｌｍｅａｓｕｒｅｓｉｎｗｏｏｄｙｐｌａｎｔｔｉｓｓｕｅｃｕｌｔｕｒｅ［Ｊ］．ＪｉａｎｇｓｕＡｇｒｉｃＳｃｉ，２０１７，４５（１６）：２０－２４．ＤＯＩ：１０．１５８８９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００２－１３０２．２０１７．１６．００４．［２４］岑忠用，苏江，邓晰朝，等．总酚含量及多酚氧化酶活性与岩黄连愈伤组织褐化的相关性研究［Ｊ］．作物杂志，２０１６（１）：１４９－１５３．ＣＥＮＺＹ，ＳＵＪ，ＤＥＮＧＸＣ，ｅｔａｌ．ＳｔｕｄｙｏｎｔｏｔａｌｐｈｅｎｏｌｉｃｃｏｎｔｅｎｔａｎｄｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎＰＰＯａｃｔｉｖｉｔｙａｎｄｂｒｏｗｎｉｎｇｏｆＣｏ⁃ｒｙｄａｌｉｓｓａｘｉｃｏｌａｂｕｎｔｉｎｇｃａｌｌｕｓ［Ｊ］．Ｃｒｏｐｓ，２０１６（１）：１４９－１５３．ＤＯＩ：１０．１６０３５／ｊ．ｉｓｓｎ．１００１－７２８３．２０１６．０１．０２８．［２５］张健，李敏，李玉娟，等．不同抗氧化剂对耐盐柳树愈伤组织褐化抑制研究［Ｊ］．扬州大学学报（农业与生命科学版），２０１５，３６（３）：９５－９９．ＺＨＡＮＧＪ，ＬＩＭ，ＬＩＹＪ，ｅｔａｌ．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｉｎｈｉ⁃ｂｉｔｉｏｎｅｆｆｅｃｔｓａｍｏｎｇｔｈｒｅｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓｏｎｃａｌｌｕｓｂｒｏｗｎｉｎｇｏｆｓａｌｔｔｏｌｅｒａｎｔＳａｌｉｘ［Ｊ］．ＪＹａｎｇｚｈｏｕＵｎｉｖ（ＡｇｒｉｃＬｉｆｅＳｃｉＥｄ），２０１５，３６（３）：９５－９９．ＤＯＩ：１０．１６８７２／ｊ．ｃｎｋｉ．１６７１－３７１南京林业大学学报（自然科学版）第４７卷４６５２．２０１５．０３．０１９．［２６］陈雪梅，杨龙勇，陈张婷，等．三峡库区消落带落羽杉茎段外植体扩繁的不定芽褐化抑制机理［Ｊ］．重庆师范大学学报（自然科学版），２０２１，３８（４）：４８－５６．ＣＨＥＮＸＭ，ＹＡＮＧＬＹ，ＣＨＥＮＺＴ，ｅｔａｌ．ＩｎｈｉｂｉｔｉｏｎｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆａｄｖｅｎｔｉｔｉｏｕｓｂｕｄｂｒｏｗｎｉｎｇｉｎｓｔｅｍｅｘｐｌａｎｔｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎｏｆＴａｘｏｄｉｕｍｄｉｓｔｉｃｈｕｍｉｎｗａｔｅｒｌｅｖｅｌｆｌｕｃｔｕａｔｉｎｇｚｏｎｅｏｆＴｈｒｅｅＧｏｒｇｅｓＲｅｓｅｒｖｏｉｒａｒｅａ［Ｊ］．ＪＣｈｏｎｇｑｉｎｇＮｏｒｍＵｎｉｖ（ＮａｔＳｃｉ），２０２１，３８（４）：４８－５６．［２７］高红兵，杜凤国，王欢．抗褐化剂对天女木兰芽外植体褐化与酚酸氧化的影响［Ｊ］．林业科学研究，２０１７，３０（３）：５２５－５３２．ＧＡＯＨＢ，ＤＵＦＧ，ＷＡＮＧＨ．ＥｆｆｅｃｔｓｏｆｂｒｏｗｎｉｎｇｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓｏｎｂｕｄｅｘｐｌａｎｔｓｂｒｏｗｎｉｎｇａｎｄｐｈｅｎｏｌｉｃａｃｉｄｓｏｘｉｄａｔｉｏｎｏｆＭａｇｎｏｌｉａｓｉｅｂｏｌｄｉｉＫ．Ｋｏｃｈ［Ｊ］．ＦｏｒＲｅｓ，２０１７，３０（３）：５２５－５３２．ＤＯＩ：１０．１３２７５／ｊ．ｃｎｋｉ．ｌｙｋｘｙｊ．２０１７．０３．０２３．［２８］王若馨，王华芳．褐化抑制对 凤丹 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真菌诱导子对悬浮培养南方红豆杉细胞次生代谢的影响
第53卷 第5期 化 工 学 报 Vol.53 №5 2002年5月 Journal of Chemical Industry and Engineering (China) May 2002研究论文真菌诱导子对悬浮培养南方红豆杉细胞次生代谢的影响张长平 李 春 元英进(天津大学化工学院制药工程系,天津300072)摘 要 在悬浮培养的南方红豆杉细胞体系中,细胞进入指数生长期末期时,加入真菌诱导子(即尖孢镰刀菌胞壁成分的粗提出物,其主要成分为糖类和多肽),对几个主要的细胞次生代谢指标进行了监测.实验结果表明,诱导子引起了南方红豆杉细胞次生代谢结构的变化,胞内酶蛋白的含量呈先上升后下降的趋势,而胞外酶蛋白的含量显著上升;苯丙烷类代谢途径中重要的酶PAL的活性显著升高;次生代谢产物中,酚类物质的含量增加,且于4天后急速上升,同时多酚氧化酶的活力也加强,萜类产物中紫杉烷类的生物合成均得到了加强,其中紫杉醇的含量得到了大幅度的提高,达到对照组的5倍左右.关键词 真菌诱导子 悬浮培养 紫杉醇 次生代谢 PPO PAL中图分类号 TQ46 文献标识码 A 文章编号 0438-1157(2002)05-0498-05EFFECTS OF FUNGAL E L ICITOR ON SECON DAR Y METABOL ISMOF CE LL SUSPENSION CU L TURE OF Taxus chinensis var1mai reiZHANG Changping,L I Chun and Y UAN Yingjin(Depart ment of Pharm aceutical Engineering,School of ChemicalEngineering and Technology,Tianjing U niversity,Tianjin300072,China)Abstract Several indexes of metabolism were monitored when the Fungal elicitor originated from Fusari rm oxysporum,whose main ingredients were polysaccharide and protein,was added into the cells suspension cultures system of Tax us chi nensis var.m ai rei in the later exponential growth stage of cells.The results showed that the structure of metabolism was modified,the intracellular protein increased first following a decrease in the later stage,while the extracellular protein kept increasing all the time.PAL,an important enzyme of phenylpropanoid pathway,had its activity promoted obviously,and the phenolics accumulation was strengthened and a sharp increase of it could be observed in the later stage of treatment.At the same time,the activity of PPO increased,and the production of taxol was promoted evidently.K eyw ords fungal elicitor,suspension culture,taxol,secondary metabolism,PPO,PAL引 言紫杉醇是一种植物的次生代谢产物,是一种新型的天然抗癌药物,以其高效、低毒及其独特的抗癌机制得到了人们的青睐.它主要是从红豆杉科红豆杉属的树皮中分离、纯化得到的,然而其天然资源极其有限,药源严重短缺.而细胞培养生产紫杉醇是解决供需矛盾的最佳途径[1],其工业化具有广阔的前景,因而如何提高紫杉醇的产量就成了研究的热点[2～4].目前采用较多的手段是向体系中添加诱导子.真菌诱导子是来源于真菌的一种确定的化学信号,在植物与真菌的相互作用中能引发植物快2000-10-16收到初稿,2000-12-20收到修改稿.联系人:元英进.第一作者:张长平,女,29岁,硕士,讲师.基金项目:国家自然科学基金资助项目(No129976032).R eceived d ate:2000-10-16.Corresponding author:YUAN Y ingjin.Found ation item:supported by the National Natural Science Foundation of China(No.29976032).速防御性应答反应,从而快速、高度专一和选择性地诱导植物特定基因的表达,进而活化特定的次生代谢途径,积累特定的目的产物.已经证明,生物诱导子是提高植物次生代谢产物的有效手段[5～7].本文主要研究了真菌诱导子对南方红豆杉细胞次生代谢的影响,所采用的真菌诱导子(MF)是来源于尖孢镰刀菌(Fusari um oxysporum,简记为Fo)的细胞壁粗提物,其主要成分为糖和多肽,是作者在众多诱导子中筛选出的诱导效果较好的一种.1 材料与方法111 细胞株系及其培养南方红豆杉(Tax us chi nesis var1m ai rei)悬浮培养Y-901细胞系,由中科院植物所提供, 25℃,110r・min-1黑暗振荡培养,采用改良的B5液体培养基,继代培养5代以上.112 真菌的培养尖孢镰刀菌采用液体马铃薯-葡萄糖培养基, 25℃,100～110r・min-1普通摇床振荡培养,待菌丝体充分生长后收获.113 诱导子的制备及其含量的标定收获的菌丝体经甲醇∶氯仿=1∶1(v/v)溶液、磷酸盐缓冲液分别洗涤3次,再经匀浆、抽滤、高温灭菌后即为诱导子粗提物,其浓度标定采用糖及蛋白质两种成分共同度量,采用蒽酮比色法测定糖含量,为973164μg・ml-1;采用考马斯亮蓝染色法测定蛋白质的含量,为78114μg・ml-1.114 蛋白质含量的测定取胞外培养液的低温(4℃)离心上清液为胞外待测液;取1g冷冻的细胞,加入0101g PV P、2 ml由011mol・L-1磷酸盐缓冲液配制而成的含有012mol・L-1ED TA、014mmol・L-1D TT的细胞提取液,低温(4℃)离心后取上清液为胞内待测液.采用考马斯亮蓝染色法,取1ml待测液加入3ml 考马斯亮蓝染色液,以蒸馏水为对照,600nm下测量其吸光度.以牛血清蛋白(Sigma公司产)为标准品.115 胞内总活性氧相对含量的测定参见文献[8].116 胞外总酚的测定取8ml培养基滤液,加入10ml乙酸乙酯萃取2h,倒出5ml乙酸乙酯,风干.将所得的样品加入3ml75%的乙醇溶解,在280nm下测量其吸光度,以3ml75%的乙醇对照.以水杨酸为标准品,代表酚的相对含量.117 多酚氧化酶(PPO)活性的测定在比色皿中加入115ml0102mol・L-1的邻苯二酚溶液和115ml0105mol・L-1p H值610的磷酸缓冲液.再加入012ml待测液,立即于398nm处每隔2min读数,以012ml0105mol・L-1p H值610的磷酸缓冲液为对照,以ΔA398(Δt)-1(A为吸光度,t为时间)表示酶活大小.118 苯丙氨酸解氨酶活性的测定取1ml胞内待测液,加入2ml0101mol・L-1 H2BO4缓冲液、1ml0102mol・L-1苯丙氨酸和1ml 蒸馏水,混匀后于30℃恒温水浴中反应60min,在290nm处测量吸光度,以0101ml蒸馏水为对照.以ΔA(60min)-1=011为一个酶活单位(U). 119 紫杉烷类化合物的提取及测定参见文献[9～13].1110 实验设计诱导子的添加量以糖来计量,经优化实验确定标准添加剂量为60μg・ml-1,在培养的第18天加入,连续取样8天.每组实验设3个平行组,对照组(C K)中加入与实验组中加入的诱导子溶液等体积的灭菌蒸馏水.2 结果与讨论211 真菌诱导子对蛋白质含量的影响由图1、图2可知,在诱导的初期,细胞受到Fo的刺激后,防卫基因包括许多次生代谢的关键基因受到诱导,使得一些调控细胞次生代谢的关键酶类相继合成,因此在诱导初期,胞内蛋白含量都呈上升趋势,且明显高于对照组.同时,诱导子的加入使细胞的生理环境发生改变,细胞把Fo视为一种外来物而产生积极的防御反应,引发了大量活性氧自由基产生,如图3所示,一方面,活性氧作为胞内信号传递激发细胞核转录表达次生代谢相关酶[8],另一方面,对细胞自身也造成了损伤,能引起膜脂过氧化而使膜的通透性增大,致使包括蛋白质在内的一些分子相对较小的物质渗透到胞外.因此,在中后期,胞内的蛋白质含量低于对照组,而胞外蛋白质含量却始终高于对照组.在诱导末期,细胞生存环境进一步恶化,相关酶得到了再次诱导,因此胞内蛋白质的合成出现了第2个峰值,但细胞的生物合成能力已经明显减弱,同时细胞逐・994・ 第53卷第5期 张长平等:真菌诱导子对悬浮培养南方红豆杉细胞次生代谢的影响 步褐化,死亡率升高,部分细胞发生自溶现象而造成胞内蛋白质的大量外泄,因此能监测到胞外蛋白质含量明显上升.Fig 11 Changes of intracellular protein contentinduced by fungalelicitorFig 12 Changes of extracellular protein contentinduced by fungalelicitorFig 13 E ffects of Fo on oxidative burst ofreaction oxygen species212 真菌诱导子对苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性的影响植物的次生代谢是植物对生态环境适应的结果,许多植物能产生并积累次生物质以抵抗外界不利因素的侵袭.参与防卫的次生代谢物质很多,如植保素,它是植物受到病原微生物侵染后产生并积累以增强自身抵抗力的小分子抗生物.很多萜类、生物碱、异黄酮成分都是植保素,而不少由真菌的培养滤液和菌丝体提取的诱导物同样能诱导植保素的形成;木质素能使受侵染部位木质化,增强细胞抗穿透的能力.对于悬浮培养南方红豆杉细胞,萜类次生代谢产物即紫杉烷类占据了次生代谢库的主要部分.一般认为,调节连接初生代谢和次生代谢及次生代谢分支途径的关键酶的活性和酶量与特定的代谢途径的活化及相关产物的积累呈正相关性.在植物的次生代谢中,苯丙烷类代谢途径是很重要的.在紫杉醇的合成过程中,苯甲异丝氨酸是紫杉醇的一个侧链,而苯甲异丝氨酸是由苯丙烷类经PAL 催化生成桂皮酸,桂皮酸再经β-氧化和氧化脱羧作用产生苯甲酸生成的.上述几种重要的次生代谢产物、酚类及紫杉醇侧链的生物合成都得通过苯丙烷类生物合成途径[14],PAL 是本途径中的关键酶,并且处于路径的最前端,也是最先受到诱导的酶.由图4可知,在诱导后的第1天,PAL 活力明显上升,这是细胞对Fo 快速应答的反应.加入诱导子后,诱导子马上能形成对相关基因的诱导,并通过基因的调控使mRNA 在大概30min 内完成转录和复制[15,16],使PAL 在相对较短的时间内活力就得到了明显的上升.在诱导的前期,实验组PAL 活性保持在较高的水平.而在后期,由于参与防卫的次生物质的前体已被相继合成,路径中后续产物的形成将由其他酶来催化,因此PAL 活性快速降低.另外,植物次生代谢物的积累并不是无限制的,过多的次生代谢产物会对细胞本身产生毒害作用,细胞通过关闭或降低相应途径中关键酶的合成来限制次生产物积累的量,这也是后期PAL 活性降低的一个原因.Fig 14 E ffects of fungal elicitor on activity of PAL213 酚类积累及多酚氧化酶(PPO)活力的变化酚类是植物细胞中很重要的一类次生代谢产物,广义的酚类包括黄酮类、简单酚类和醌类,主・005・ 化 工 学 报 2002年5月 要通过莽草酸途径合成.其中,异黄酮类和简单酚类中的许多化合物是植物植保素的重要成分,同时一些酚类通过聚合也能构成木质素,通过木质化作用为阻止病原菌的进一步侵染提供了有效的保护层.另外,一些酚类的前体及多聚作用产生的游离基对入侵真菌的酶和毒素也有钝化作用.酚类前体物的合成也受到PAL 酶催化,PAL 酶活变化也最终影响到酚的形成.加入诱导子后,由于细胞的快速应答反应,酚类迅速形成,从而在短时间内建立起一个有效的防御体系,因此,如图5所示,酚的含量在第1天就出现了一个小峰值.在后期,酚的含量出现剧增,这主要是细胞的生理环境进一步恶化,诱发了酚的大量合成,这也表明在诱导末期细胞的代谢系统、酶的催化反应、基因的表达三者的统一性受到了严重破坏.值得一提的是,酚类物质的存在对细胞既有有利的一面,也有有害的一面,过多的酚类物质会对细胞造成伤害.Fig 15 Timing of accumulationof phenolicsPPO 是线粒体外的末端氧化酶,在PPO 的催化下一些酚类物质能转化为醌类物质,而醌类物质对微生物往往有毒,能阻止微生物的进一步入侵.当细胞处于逆境时,会导致PPO 活力的上升.同时,PPO 也通过转化酚类化合物的方式来减轻或消除过多酚类对细胞自身的毒害作用.与之相对应,PPO 的活性,如图6所示,在前期受到抑制,以利于细胞内酚的积累,而快速形成细胞的防御物质.随着酚含量的增加,PPO 受到诱导,其活力逐步上升,来消除多余的酚类对细胞自身的毒害作用,实现对细胞的保护作用.而且在实验过程中也能肉眼观察到由于醌类物质逐渐积累而造成细胞培养体系的颜色逐步加深的过程,当细胞培养进入诱导末期后,细胞培养液明显褐化,这主要是酚类次生代谢物中醌类物质所致,因为大多数醌类化合物都具有明显的颜色.Fig 16 E ffects of fungal elicitor on activity of PPO214 真菌诱导子对红豆杉细胞紫杉烷类合成的影响 由图7～图9可知,真菌诱导子加强了紫杉烷类的生物合成,几种紫杉烷类的产量均得到了提高.这表明,Fo 的加入加强了紫杉烷类次生代谢相关基因的表达,一些重要酶类的活力提高,紫杉烷类细胞次生代谢产物的积累得到了加强.但在诱导的后期,紫杉烷类含量都出现了降低的现象.这一方面是由紫杉烷本身易分解的特性所决定的.另一方面,紫杉烷是一种二萜类细胞次生代谢产物,过多的次生代谢产物积累会对细胞产生毒害作用,因此紫杉烷含量的降低也是植物细胞本身的生存机制和代谢调节机制所决定的.可以说,紫杉烷产量增加的同时,也对分解它本身的相关酶形成了诱导,最终又导致了紫杉烷产量的下降.因此,植物细胞生产紫杉醇时,对紫杉醇的收获要适时.另外,由图还可观察到,诱导组中10-DAB 合成的峰值出现在诱导后的第3天,紫杉醇的合成峰值出现在诱导后的第4天,Bacctin -Ⅲ的合成峰值出现在诱导后的第3天,而对照组中各种紫杉烷类的积累时间要迟于诱导组,而且积累量也明显较低.可见,真菌诱导子不仅加强了紫杉烷类的合成,而且提前了紫杉烷类的合成时间.在各种紫杉烷类化合物中最受关注的是紫杉Fig 17 E ffects of fungal elicitor on production of taxol・105・ 第53卷第5期 张长平等:真菌诱导子对悬浮培养南方红豆杉细胞次生代谢的影响 Fig 18 E ffects of fungal elicitor on production of 10-DABFig 19 E ffects of fungal elicitor on production ofBacctin -Ⅲ醇,真菌诱导子Fo 对紫杉醇合成的诱导非常显著,紫杉醇产量得到了大幅度提高,达到了67mg ・L -1,为对照组的5倍左右.3 结 论南方红豆杉细胞悬浮培养过程中,在细胞指数生长末期加入真菌诱导子Fo ,能够调控细胞的次生代谢.这种调控是建立在细胞防御性应答反应的基础上.细胞能感受到真菌诱导子的加入,并积极响应产生酚类等次生代谢产物,建立起有效的细胞防御体系,同时为了免受过多的次生代谢产物的伤害,一些分解次生代谢产物的酶也被激活.真菌诱导子的加入刺激并加强了细胞特定基因的表达,使次生代谢途径中一些重要的酶被合成或其活力得到提高,一些特定的次生代谢途径如苯丙烷类代谢途径和萜类的代谢途径得到活化,并最终导致目的产物紫杉醇的产量明显提高,达到67mg ・L -1,为对照组的5倍左右.可见,真菌诱导是提高紫杉醇产量的一种新奇而有效的方法.R eferences1Xing Jianmin (邢建民),Zha Lihang (查丽杭),Li Zuohu (李佐虎),Liu Dalu (刘大陆),Y e Hechun (叶和春),Li Guofeng (李国凤).Chi nese B ulleti n of Botany (植物学通报),1997,14(3):22—292Thomas J Hirasuna ,Luis J Pestchanker ,Venkatesh Srinivasan ,Michael L Shuler.Plant Cell ,Tissue and Organ Cult ure ,1996,44:95—1023Luis J Pestchanker ,Suxan C Roberts ,Michael L Shuler.Enzy meand Microbial Technology ,1996,19:256—2604Chen Y ongqin (陈永勤),Zhu Weihua (朱蔚华),Wu Yunqi (吴蕴祺),Hu Qiu (胡秋).Chi nese Journal of Biotechnology (生物工程学报),1999,15(4):522—5245Chappel J ,Hahlbrock K ,Boller T.Planta ,1984,161:475—4806Bostock R M ,Laine R A ,Kuc J.Plant Physiology ,1982,70:1417—14247Cramer C L ,Bell J N ,Ryder T B ,Bell J N ,Lamb C J.Science ,1985,227:1240—12438Li Chun (李春),Y an Qiong (晏琼),Yuan Y ingjin (元英进),Hu Z ongding (胡宗定).In :Proceeding of the Ninth NationalConference on Biochemical Engineering (第九届全国生物化工学术论文集).Beijing :Chemical Industry Press ,20009Yuan Y ingjin (元英进),Hu Guowu 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布范围内,产地生态环境条件不同,当归的遗传背景又存在不同程度的差异。这为我们从分子生物学角度研究当归药材道地性提供了新的启示。可以说,药材的道地性不仅仅是一个地理意义上的概念,同时具有广泛的生物学内涵,更具有丰富的遗传特质。而作为现代分子生物学的重要手段,RAPD分子标记技术对揭示道地药材与非道地药材之间的地理—生态—遗传的差异将是一种十分有效的手段。
参考文献:[1] 陈永久,王 文,杨跃雄,等.冬虫夏草(Cordycepssinensis)的随机扩增多态DNA及其遗传分化[J].遗传学报,1997,24(5):410-413.[2] 肖小河,刘峰群,史成和,等.中药分子鉴定学概念[J].中药材,2000,23(2):107-109.[3] 肖小河.国产姜黄属药用植物RAPD分析与分类鉴定[J].中草药,2000,31(3):209-212.[4] ScottOR.ExtractionofDNAfromPlantTissue[J].PlantMolBiolManual,1988,A6:1-6.[5] 奥斯伯F,布伦特R,金斯顿RE,等(颜子颖,王海林译).精编分子生物学实验指南[M].北京:科学出版社,1998.
pH对红豆杉愈伤组织生长、PAL活性和紫杉醇含量的影响盛长忠,王淑芳,王 勇,王宁宁(南开大学生物化学与分子生物学系,天津 300071)
摘 要:目的 研究不同pH值对东北红豆杉和南方红豆杉愈伤组织生长和紫杉醇含量的影响。方法 采用不同pH值的B5培养基培养两种红豆杉愈伤组织,测定生长率、PAL活性和紫杉醇含量。结果 不同红豆杉愈伤组织所需最适pH值不同,而有利于愈伤组织生长的pH值均不利于PAL活性的提高和紫杉醇的积累。即:愈伤组织生长快时,PAL活性将下降,紫杉醇含量也减少。结论 pH值明显影响红豆杉愈伤组织的生长及次级代谢水平,从而影响了紫杉醇的合成与积累。关键词:红豆杉;愈伤组织;PAL;紫杉醇中图分类号:R282.13 文献标识码:B 文章编号:02532670(2001)10092903
EffectofpHoncallusgrowth,PALactivityandpaclitaxelcontentofplantsofTaxusL.SHENGChang-zhong,WANGShu-fang,WANGYong,WANGNing-ning
(DepartmentofBiochemistryandMolecularBiology,NankaiUniversity,Tianjin300071,China)
Abstract:Object TostudytheeffectofpHoncallustissuegrowthandpaclitaxelcontentofTaxuscuspidataSieb.etZucc.andTaxuschinensisvar.mairei(LemeeetLe ′vl.)ChengetL.K.Fu.Methods
ThecallustissueswereculturedonB5mediumwithdefferentpHvalues,andthegrowthrate,PALactivi-tyandpaclitaxelcontentweredetermined.Results Differentcallustissuesoftaxusneeddifferentopti-mumpHvalues.ThepHvalues,whichcouldpromotecallusgrowthsignificantly,wereallinhabitorytoPALactivityandaccumulationofpaxlitaxel.Conclusion pHhadgreatinfluencesonthegrowthofthecallusandthelevelofsecondarymetabolism,therebythesynthesisandaccumulationofpaclitaxelwereaf-fected.Keywords:TaxusL.;callustissue;phenylalanineammonialyase(PAL);paclitaxel
红豆杉植物中有多种紫杉烷类似物,其中10余种具有抗肿瘤活性,尤其是紫杉醇(Paclitaxel)活性最高。紫杉醇主要存在于植物树皮中,来源有限,因此药源十分紧张。近年来,对红豆杉细胞大规模培养这一有希望长期供应紫杉醇来源技术的研究引起国内外高度重视。与之有关的研究也有很多报道。pH值是影响植物组织生理代谢的重要理化因素之一。Fett-Neto[1]指出培养基pH值在4.8～7.8范围内东北红豆杉愈伤组织生长无明显差别,而在我们所进行的红豆杉愈伤组织培养中发现,愈伤组织对pH值非常敏感。为此,本文以东北和南方红豆杉愈伤组织为材料,研究了pH值对其生长、PAL(苯丙氨酸转氨酶,为催化苯丙氨酸形成肉桂酸反应的酶,经一些实验证明在紫杉醇合成过程中,肉桂酸可能参与了紫杉醇前体物质wintersein的形成)活性及紫杉醇含量的影响,以期为细胞大规模培养生产紫杉醇提供理论和实验依据。1 材料与方法
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2001年第32卷第10期
⒇收稿日期:2001-01-161.1 愈伤组织的培养:东北红豆杉和南方红豆杉愈伤组织由叶诱导而来,采用B5培养基进行培养,内含1mg/LKT、2mg/L2,4-D、0.5mg/LAG3。用1mol/LNaOH调pH。1.2 组织培养生长的指标:接种鲜重(克/瓶)=接种后瓶重-接种前瓶重收获鲜重(克/瓶)=收获前瓶重-收获后瓶重鲜重生长率(鲜重增长倍数)=收获鲜重/接种鲜重1.3 紫杉醇提取与检测:紫杉醇提取方法同文献[2]:将样品用1mL色谱纯甲醇溶解,在C18反相硅胶柱进行恒速洗脱,流动相为甲醇-水(65∶35),流速为1mL/min,在227nm下用紫外检测器检测。紫杉醇定量采用外标法。1.4 PAL活性测定:参阅文献[3]有改动。取愈伤组织2g,加4mL含5mmol/L巯基乙醇的硼酸缓冲液、0.1gPVP于冰浴中研磨,10000g离心15min,取上清液。酶液适当稀释。1mL酶液加1mL0.02mmol/L苯丙氨酸、2mL蒸馏水。对照不加底物,多加1mL蒸馏水。30℃中保温0.5h后置于冰浴。用紫外分光光度计在290nm处进行吸收测定。以每小时在290nm处吸收变化0.01所需酶量为一单位(相当于每毫升反应混合物形成1μg肉桂酸)。蛋白浓度测定按Bradford(1976)方法进行。3 结果与讨论2.1 愈伤组织的生长进程及PAL酶活性的变化:将愈伤组织接种于培养基上,定期收获,得到其生长曲线,如图1所示。同许多报道一样,东北红豆杉愈伤组织的生长较为缓慢,接种后有较长的一段迟滞期,鲜重倍增时间为18d,40d时愈伤组织生长进入平稳期,愈伤组织的生长率为5.2。大约保持10d左右,细胞开始黑褐死亡,重量下降。愈伤组织的生长周期为40d。A-PAL活性 B-生长率图1 东北红豆杉愈伤组织生长曲线及PAL活性的变化从图1中可以看出,在东北红豆杉接种后的前一段时间,PAL活性急剧上升,10d时出现一个高峰,之后又降低,约30d时酶活性最低。酶活性在40d时出现第二个高峰,50d时又下降。已知植物感染病原体或受伤害后,PAL活性升高,促进了黄酮类和木质素等次生代谢物质的合成,产生并积累小分子抗生物质用以增强自身的抵抗力。愈伤组织转接过程中,细胞受伤害较严重,刺激了PAL的活性,加速了苯丙氨酸的代谢。大约20d后,愈伤组织适应了新的培养环境,开始迅速生长,进入对数期,次级代谢活动降低,PAL活性也维持在一个较低水平。愈伤组织到达生长高峰(40d)时,PAL活性又迅速回升,次级代谢旺盛,细胞生长受到抑制,并开始变褐、衰老甚至死亡。2.2 pH值对东北红豆杉愈伤组织生长、紫杉醇含量及PAL酶活性的影响:配制B5培养基,分成5组,用NaOH调节pH分别为5.5,6.0,6.5,7.0,7.5,用于愈伤组织培养。每组至少有5瓶,3次重复,40d时收获。记录愈伤组织生长率,测定PAL活性,提取紫杉醇并检测其含量,结果见图2,3。
A-生长率 B-紫杉醇含量图2 pH值对东北红豆杉愈伤组织生长及
紫杉醇含量的影响
图3 不同pH值对东北红豆杉愈伤组织PAL活性的影响从图2中可以看出,东北红豆杉愈伤组织生长状况受pH值影响显著。较高pH值对生长有利,pH7.0时愈伤组织生长状态最好,组织块白色,培养基红褐轻。在pH6.5的培养基中,愈伤组织颜色较暗,生长较差,生物产量仅为pH7.0中愈伤组织生物产量的一半,并且培养基中红褐严重。Fett-Ne-
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2001年第32卷第10期to[1]和Wickremesinhe[4]指出,培养基中pH值在较大范围内对东北红豆杉和杂种红豆杉愈伤组织生长没有明显影响,即愈伤组织对pH值有较强的耐受性。但本实验经过多次重复证明,我们诱导的东北红豆杉愈伤组织对pH值非常敏感。提取不同pH值下生长的东北红豆杉愈伤组织中的紫杉醇并测定其含量,结果如图2所示。pH6.0下培养基中生长的愈伤组织紫杉醇含量最高,达0.0068%,pH6.5中愈伤组织的紫杉醇含量最少,仅为0.0014%,二者相差近4倍之多。从图中看到,除pH6.5中的愈伤组织外,愈伤组织生长越好,紫杉醇含量越低,生长状态较差的,紫杉醇含量却增高了。如pH7.0时愈伤组织生长率为5.20,生物产量明显高于pH6.0(生长率为3.80),但其紫杉醇含量(0.033%)仅为后者(0.068%)的一半,这表明细胞的生长速率与紫杉醇含量呈负相关。这与Fett-Ne-to[5]的报道基本一致。pH6.5既不适合东北红豆杉愈伤组织的生长,也不利于产生紫杉醇。通过对不同pH值培养基中生长的东北红豆杉愈伤组织紫杉醇含量和PAL活性的比较(图2,3)可以看出,二者存在着一定相关性。比如:愈伤组织在pH5.5,6.0时PAL活性高,其紫杉醇含量也很高。可见,PAL活性的大小在一定程度上反映了紫杉醇含量高低。2.3 pH值对南方红豆杉愈伤组织生长和紫杉醇含量及PAL活性的影响:在不同pH的B5培养基上培养南方红豆杉愈伤组织,30d收获,测鲜重和紫杉醇含量(图4)并且测定了PAL活性(图5)。A-生长率 B-紫杉醇含量图4 不同pH对南方红豆杉愈伤组织生长及紫杉醇含量的影响南方红豆杉愈伤组织的生长受pH影响明显,pH5.5对于愈伤组织生长最为有利,达接种量的3.84倍,但紫杉醇的含量较低,仅占干重的0.0012%。随着pH的提高,愈伤组织的生长越来越差。pH7.0时仅为接种量的2.80倍,而紫杉醇的含量却显著提高,占干重的0.0030%,是pH5.5的2倍多。同时也说明南方红豆杉愈伤组织的生长与紫杉醇的合成呈负相关。