小鼠sox2基因的克隆及其原核表达载体构建
小鼠β-actin基因的克隆表达(2)
小鼠β-actin基因的克隆表达（2）实验步骤：（1）目的基因与表达载体的连接反应：①表达载体和目的片段的酶切管号①②pGEX 4T-1 42μlPCR产物42μlBamHⅠBuffer（10×）5μl5μlBamHⅠ1μl1μlSalⅠ2μl2μl加样后混匀，置于37℃水浴中，保温3~4h。
然后将酶切产物全部经琼脂糖凝胶电泳后回收。
②表达载体与目的片段的连接取一个200µl的EP管依次加入下列试剂：2×buffer：5 μlpGEX 4T-1酶切回收产物：1 μlPfu扩增并酶切回收的片段：3μlT4连接酶：1 μl离心30Sec，使反应体系充分混合，16～22℃连接3～4h。
（2）克隆载体与目的片段的连接取一个200µl的EP管依次加入下列试剂：pMD18-T 1 μl目的片段4μllSolution Ⅰ(含连接酶和buffer) 5 μl离心30Sec，使反应体系充分混合，4℃过夜连接。
感受态细胞的制备及转化实验目的：把体外重组的DNA引入受体细胞，使受体菌具有新的遗传特性，并从中选出转化子。
实验原理：所谓感受态就是细菌吸收转化因子的生理状态。
关于感受态的本质说法很多。
目前主要有两种假说：1.局部原生质体化假说—细菌表面的细胞壁结构发生变化，即局部失去细胞壁或局部溶解细胞壁，使DNA分子能通过质膜进入细胞。
2.酶受体假说—感受态细胞的表面形成一种能接受DNA的酶位点，使DNA分子能进入细胞。
DNA分子的转化过程如下：1.吸附—完整的双链DNA分子吸附在受体菌的表面。
2.转入—双链DNA分子解链。
单链DNA进入受体菌，另一条链降解。
3.自稳—外源质粒DNA分子在细胞内又复制成双链环状DNA。
表达—供体基因随同复制子同时复制，并被转录翻译。
实验步骤：（1）感受态的制备① 从LB平板上挑取单克隆于5ml LB培养基中，37℃ 200rpm摇菌12～1 6h。
小鼠Bax的基因克隆及其原核表达
小鼠Bax的基因克隆及其原核表达唐晓莹;浦雄勇【期刊名称】《检验医学与临床》【年(卷),期】2011(8)6【摘要】目的克隆小鼠Bax基因全长编码区,并原核表达小鼠Bax基因全长序列,为从转录水平探讨Bax基因与肿瘤的关系奠定基础.方法取小鼠骨髓细胞,采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)从细胞中获得Bax基因,构建重组表达质粒pet28a/Bax;酶切鉴定挑选阳性重组质粒转化大肠埃希菌ROS,测序鉴定后经IPTG 25 ℃诱导6 h,SDS-PAGE电泳判断以包涵体形式存在的带有His标签的融合蛋白,Western blot鉴定.结果扩增获得的Bax基因CDS区全长579 bp,编码192个氨基酸残基,与GenBank中发表的序列完全一致.成功构建了原核表达载体pet28a/Bax,并在工程菌ROS中获得大量表达.结论获得了小鼠Bax基因,并成功原核表达和制备出小鼠Bax融合蛋白,为进一步研究其生物学功能奠定了基础,并为寻找多种肿瘤性疾病的有效治疗途径提供新思路.【总页数】3页(P662-663,668)【作者】唐晓莹;浦雄勇【作者单位】江苏省昆山市第三人民医院检验科,215316;江苏省昆山市第一人民医院检验科,215316【正文语种】中文【相关文献】1.人促凋亡蛋白基因bax的克隆与原核表达 [J], 孙玉科;张彦杰;李娜;董岩岩;刘钦松2.bax嵌合基因克隆及其在人舌癌细胞的表达 [J], 马英红;陈俊杰;高家让;王若菡;彭文珍;杨绍华3.小鼠ZP2肽的基因克隆和原核表达载体的构建 [J], 乜春城;禹艳红;谢妍;曹佐武4.人类扭转蛋白A的基因克隆、表达与蛋白质纯化(Ⅰ)——DYT1基因克隆与原核表达 [J], 周雪莹5.牦牛Bcl-2、Bax基因克隆及其在生殖轴上的表达分析 [J], 夏忆;王琴;何向东;陈莹;吉格莫体;字向东因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
载体构建
载体构建分为以下步骤：1.载体的选择和引物设计以扩增目标基因2.目标片段的PCR扩增3.载体和目标片段的限制性酶切4.连接转化5.挑取克隆提质粒6.单克隆的验证及送样测序。
载体的选择实验室常用的载体有pUC19（扩繁目标片段），pet28a（原核表达载体Kna+），pGEX-4T-1(原核表达载体Amp+)，pCI-NEO(真核表达载体Amp+)，pCDNA3.1(真核表达载体Amp+)，pLKO.1(shRNA构建Amp+)。
根据所要构建的质粒目的的差异以及载体和目标片段的酶切位点分析结果来选择载体。
举例如下：实验目的是将MYC基因插入到载体中，转染进细胞中表达。
应选用真核表达载体pCI-NEO 或pCDNA3.1。
引物设计引物设计的目的是将目标片段扩增出来以便与载体连接，所以在引物的两端应人为加上酶切位点，酶切位点前加上保护碱基。
在选择酶切位点是应注意，选择的应该是目的基因片段中没有而载体上有的限制性内切酶，防止目标片段被切不完整，也便于和载体连接。
载体构建之后我们的目的是要表达，所以应该加入标签以便western blot检测蛋白是否表达。
常用的标签有Flag标签、6XHis标签、HA标签和Myc标签。
Flag标签：D Y K D D D D KGAT TAC AAG GAT GAC GAC GAT AAG6XHis标签：H H H H H HCAC CAC CAC CAC CAC CACHA标签：Y P Y D V P D Y ATAC CCA TAC GAT GTT CCA GAT TAC GCTMyc标签：E Q K L I S E E D L这些标签被表达成氨基酸后，特定的氨基酸序列会与相应抗体结合，在western blot时可被检测。
因此，在设计引物时，这些核酸序列应位于起始密码子ATG之后。
翻译是从mRNA的5‘端开始，而蛋白质合成是从N端到C端，所以若要把标签加在N端，标签所对应的核苷酸序列应位于ATG之后，若是加在C端，则应该将标签所对应的核苷酸序列置于终止密码子TAA之前。
打靶载体构建
利用同源重组技术进行打靶载体的构建孔冬小鼠遗传学实验室南京大学模式动物研究所基本原理传统意义上的打靶载体的构建受基因组DNA上限制性内切酶位点的强烈局限。
考虑到后期利用Southern杂交进行阳性克隆筛选时的内切酶是否可以区分重组和野生型染色体，同时顾及同源臂两端的内切酶是否能与常用载体的多克隆位点相匹配，最后可供我们进行选择的打靶区域往往非常有限。
而近年来发展起来的基于噬菌体的大肠杆菌同源重组系统为我们摆脱这种束缚提供了一个有效的平台。
高效、省时、灵活是该系统的三大特点。
2004年底小鼠129品系BAC文库末端测序的完成更为这一技术的应用提供了巨大的便利。
大肠杆菌中同源重组的研究由来已久，其原理如图1所示。
而Neal G. Copeland, Nancy A. Jenkins 以及 Donald L. Court实验室所采用的λ噬菌体RED系统较之前代又有以下优势：高效；所需同源序列由500bp 降至45bp；低突变率。
为使此系统能便利的应用于条件性基因敲除打靶载体的构建，他们建立了两个大肠杆菌菌株EL250、EL350；三个质粒pL253、pL451、pL452（图谱见附录）。
两个菌株中的gam基因以及RED重组酶基因exo和bet均受温图1度敏感性λ抑制子cI857的严格调控。
抑制子在32℃处于活化状态，而其在42℃的短暂失活能使其控制的基因迅速表达。
此外，EL250中的Flpe及EL350中的Cre重组酶基因则受阿拉伯糖诱导的P BAD启动子的调控，在阿拉伯糖的参与下进行表达。
这两个菌株可以有效地去除loxP 或FRT重组位点间的NEO筛选框。
质粒pL253、pL451、pL452均来源于pBlue/Script 载体，分别用于打靶载体的骨架，loxP－FRT-NEO-FRT、或loxP-NEO-loxP片段的PCR扩增。
利用此系统构建条件性打靶载体的基本步骤如图2所示。
自Sanger 研究所定购的129 BAC克隆被装入DH108菌株以琼脂为载体进行邮寄。
基因敲除小鼠的构建
生物技术十一班 梅沪生
1.基因敲除简介
2.基因敲除方法及其原理
2.1基因敲除小鼠的构建
2.2其他基因敲除方法
3.基因敲除应用
基因敲除主要是应用DNA同源重 组原理，用设计的同源片段替代 靶基因片段，从而达到基因敲除 的目的。
利用同源重组构建基因敲除小鼠的基本步骤
7
把目的基因和与
细胞内靶基因特
异片段同源的DNA
分子都重组到带
有标记干细胞，最常用的是鼠，而兔，猪， 鸡等的胚胎干细胞也有使用。
将重组载体通过一定的
方式导入同源的胚胎干细 胞(ES cell)中，使外源 DNA与胚胎干细胞基因组中 相应部分发生同源重组，
将重组载体中的DNA序列整
合到内源基因组中，从而 得以表达
目前常用的方法是正负筛选法（PNS法），标记基因的特异位点表 达法以及PCR法。其中应用最多的是PNS法。
通过观察嵌和体小鼠的生物学形状的变化进而了解目的基因变化前 后对小鼠的生物学形状的改变，达到研究目的基因的目的。
由于同源重组常常发
生在一对染色体上中一条
染色体中,所以如果要得 到稳定遗传的纯合体基因
建立生物模型
提供廉价的异种移植器官
疾病的分子机理研究和疾病的基因治疗
免疫学中的应用
改造生物、培育新的生物品种
谢谢观赏
此法利用某些能随机插入基因序列的病毒，细菌或其他基因载体， 在目标细胞基因组中进行随机插入突变，建立一个携带随机插入突变 的细胞库，然后通过相应的标记进行筛选获得相应的基因敲除细胞。 是最近发展起来的利用随机插入突变进行基因敲除的 新型方法 。
比用同源重组法更加简便，周期大大缩短。 对于哺乳动物，如对于一些敲除后小鼠在胚胎时就会死亡的基 因，可以在体外培养的细胞中利用RNAi技术研究它的功能。 RNAi还被用来研究在发育过程中起作用的基因，如可用RNAi来阻断 某些基因的表达，来研究他们是否在胚胎干细胞的增殖和分化过程 中其起着关键作用。
小鼠抗人肿瘤抑制素2(ST2)单克隆抗体的制备及应用
1026细胞与分子免疫学杂志(Chin J Cell Mol Immunol)2021,37(11) .论著•文章编号:1007-8738(2021)11-1026-06小鼠抗人肿瘤抑制素2(ST2)单克隆抗体的制备及应用马菁昌J武书文S王玉玲J李娜'，周耿瑶J徐雪雪S程坤'，金伯泉'，张圆S庄然3**c空军军医大学基础医学院免疫学教研室，陕西西安710032；'西北工业大学医学研究院，陕西西安710068)［摘要］目的制备针对人肿瘤抑制素2(ST2)的小鼠源性单克隆抗体，并进行功能和应用的初步鉴定。
方法用真核表达的重组人ST2分子免疫BALB/c小鼠，利用常规B细胞杂交瘤技术制备抗ST2单克隆抗体，并鉴定其在Western blot法、免疫组织化学染色和流式细胞术中的应用价值；建立检测可溶性ST2的夹心ELISA,检测热射病患者血清ST2水平；建立ST2萤光素酶报告基因检测系统，检测特异性抗体的中和活性。
结果获得38株分泌小鼠抗人ST2单克隆抗体的杂交瘤细胞株，克隆号分别命名XA325.1~XA325.38。
初步筛选鉴定发现可以用于Western blot法、免疫组织化学染色，识别重组表达的纯化蛋白和细胞中表达的ST2；有2株可以应用于流式细胞术，识别细胞表面外源性转染表达的ST2；采用单抗XA325.16包被，搭配 XA325.5标记生物素，可以建立检测血清中可溶性ST2的ELISA试剂盒，发现热射病患者血清ST2水平显著升高；XA325.5具有中和活性，可以阻断白细胞介素33(IL-33)的生物学效应。
结论制备小鼠抗人ST2的单克隆抗体，可用于多种免疫学检测技术，XA325.5中和活性抗体具有潜在的临床应用价值。
［关键词］肿瘤抑制素2(ST2)；单克隆抗体(mAb)；中和抗体；免疫学检验方法［中图分类号］Q813.2,R392,R392.12,R446.61［文献标志码］APreparation and identiHcation of mouse-derived monoclonal antibodies to human ST2moleculeMA Jingchang1,WU Shuwen2,WANG Yuling',LI Na1,ZHOU gengyao1,XU Xuexue2,CHENG Kun1, JIN Boquan1,ZHANG Yuan2,ZHUANG Ran1'2*1Department of Immunology,School of Basic Medicine,Air Force Medical University,Xi'an710032；2Medical Research Institute of Northwestern Polytechnical University,Xi'an710068,China*Corresponding author,E-mail:fmmuzhr@［Abstract］Objective To prepare mouse-derived monoclonal antibody against human suppression of tumorigenicity2 (ST2)molecule and make initial identification.Methods BALB/c mice were immunized with the recombinant human ST2molecule, and the conventional B-cell hybridoma tech n o l ogy was used to prepare the an t i-ST2monoclonal an t ibodies(m A bs).Their application in western blotting,immunohistochemistry,and flow cytometry were evaluated.The sandwich ELISA detecting soluble ST2was established to test the serum levels of ST2in patients with heat stroke.And the ST2luciferase reporter gene detection system was established to detect their neutralization activity.Results Thirty-eight hybridoma cell lines secreting mouse anti-human ST2mAb were obtained and named from XA325.1to XA325.38.Preliminary screening and identification of them showed that they can be used to identify the purified recombinant ST2proteins and cellular expressed ST2using western blotting and immunohistochemistry.Two of them can be used for flow cytometry to identify the exogenously transfected ST2 molecule on the cell ing XA325.16mAb coating,combined with XA325.5-labeled biotin,an ELISA kit detecting soluble ST2in serum was established.It was found that the serum levels of ST2in patie n ts with heat stroke in c reased significantly.Moreover,XA325.5was found with neutralizing activity which can block the biological effect of IL-33.Conclusion A set of mouse an t i-huma n ST2mAbs was prepared,which can be used in a variety of immuno l ogical detecti o n tech n iq u es. Besides,XA325.5neutralizing antibody has a potential value in clinical application.［Key words］suppression of tumorigenicity2(ST2)；monoclonal antibody(mAb)；neutralizing antibody；immunological detection tech n ique收稿日期：2021-06-23；接受日期：2021-10-07基金项目：国家自然科学基金(81871258)；后勤保障部项目(18QNP026)作者简介：马菁昌(1996-),男，山东淄博人，硕士研究生Tel：187****6895；E-mail:********************.cn*通讯作者，庄然,E-mail:fmmuzhr@11期马菁昌，等.小鼠抗人肿瘤抑制素2(ST2)单克隆抗体的制备及应用1027肿瘤抑制素2(suppression of tumorigenicity2,ST2),是白细胞介素33(interleukin-33,IL-33)的特异性受体，主要表达于肥大细胞、活化的2型辅助T(T helper type2,Th2)细胞、巨噬细胞和心肌细胞等[1-2]o ST2具有两种亚型：一种是跨膜型ST2即ST2配体(ST2ligand,ST2L),被IL-33激活后，增强肥大细胞、Th2细胞及2型固有淋巴细胞的功能；另一种是可溶型ST2(soluble ST2,sST2),其作为“诱骗受体”，竞争性结合游离的IL-33,阻断IL-33/ST2L 信号转导3)。
慢病毒介导SiRNA沉默SGMS2基因的单克隆细胞系构建中最佳MOI值及筛选抗生素浓度
慢病毒介导SiRNA沉默SGMS2基因的单克隆细胞系构建中最佳MOI值及筛选抗生素浓度金小花;秦高【摘要】目的：探究慢病毒介导RNAi沉默SGMS2基因的单克隆细胞系构建中最佳感染复数（ multiplicity of infection，MOI）及BSD基因筛选抗生素（ blasticidin）浓度。
方法荧光标记小鼠SGMS2干扰阴性对照慢病毒并按照MOI值0、10、30、60、120（ TU number／cell）分别侵染INS-1空白细胞，培养72 h后使用荧光显微镜拍照并计算细胞的荧光比率（％）及死亡率（％），以确定最佳MOI值。
小鼠胰岛素瘤INS-1空白细胞中加入0、1、2、3μg／mL blasticidin，第7天时采用MTT法检测细胞的死亡率，以确定细胞抗生素敏感浓度。
使用SGMS2干扰阴性对照慢病毒及SGMS2干扰慢病毒（病毒滴度：1×108 TU／mL）按照最佳MOI值侵染细胞，并用blasticidin敏感浓度进行阳性细胞筛选，获得混合系细胞。
当细胞的荧光率达90％时，进行单克隆稳转细胞系的构建。
结果最佳MOI值为60，此时细胞的荧光率达100％，但细胞的死亡率＜0.5％，细胞保持原有的形态。
当blasticidin敏感浓度为2μg／mL，此时空白细胞失去原有的贴壁性，全部死亡。
INS-1-SEMS2细胞第2次检测的Ct值28.21大于第1次检测的Ct值27.58，且siRNA的干扰效率为77.78％，siRNA 成功表达，混合稳转细胞系构建成功。
成功构建小鼠胰岛素瘤INS-1-SEMS2单克隆细胞系。
结论慢病毒介导RNAi沉默基因SGMS2的单克隆细胞系构建成功。
%Objective To optimize multiplicity of infection ( MOI) and antibiotics ( blasticidin) concentration selecting BSD gene in construction of monoclonal stable cell line by lentivirus vector-mediated RNA interence silenced gene SGMS2.Methods The INS-1 cells were transfected byfluorescence labeled negative control SGMS2-siRNA lentivirus at MOI of 0, 10, 30, 60 and 120 TU number/cell.The cells were photographed under fluorescent microscopy after 72 h cultivation, then fluorescence ratio and apoptosis rate were calculated to determine optimal MOI.The INS-1 cells were treated by blasticidin with different concentrations of 0, 1, 2, and 3 μg/mL, and the apoptosis rate was observed to acquire optimal concentration of antibiotics.The INS-1 cells were transfected by negative control SGMS2-siRNA lentivirus and SGMS2-siRNA lentivirus (virus titer:1 ×108TU/mL) at optimal MOI and positive-transfected cells were selected by blasticidin at optimal concentration, then mixed cell lines were acquired.The monoclonal cell line was constructed at fluorescence ratio of 90%.Results The optimal MOI was 60 with 100% fluorescence ratio, less than 0.5% apoptosis rate and keep original cellular morphology.The optimal concentration of blasticidin was 2 μg/mL with cell adherence disappear and all cells apoptosis.The Ct value of INS-1-SEMS2 cells detected at the second time was 28.21, which was greater than 27.58 at the first time.The interfering efficiency of siRNA was 77.78% which indicated a successful expression of siRNA and construction of monoclonal stable cell line ( INS-1-SEMS2 ).Conclusion The monoclonal stable cell line was successfully constructed by lentivirus vector-mediated RNA interence silenced gene SGMS2.【期刊名称】《中国生化药物杂志》【年(卷),期】2015(000)009【总页数】4页(P51-53,56)【关键词】小鼠胰岛素瘤INS-1细胞;感染复数;BSD基因筛选抗生素;细胞稳转株【作者】金小花;秦高【作者单位】苏州农业职业技术学院食品科学系化学与生物技术教研室，苏州215008;上海诺百生物科技有限公司，上海 200233【正文语种】中文【中图分类】Q78在动物细胞学和分子学试验中，将外源目的基因通过病毒介质转入动物细胞中，是一个非常重要的试验步骤[1]。
制备转基因小鼠的原理
制备转基因小鼠的原理
制备转基因小鼠的原理是通过基因工程技术将外源基因导入小鼠的基因组中。
具体步骤如下：
1. 选择目标基因：根据研究需求选择要导入小鼠基因组的外源基因。
这个外源基因可以来自其他物种，也可以是已存在于小鼠中但表达量较低的基因。
2. 构建质粒：将选择的目标基因与载体DNA（如质粒）连接。
质粒通常含有特定的启动子、终止子和选择性标记基因（如抗生素抗性基因），以便检测和筛选成功导入外源基因的小鼠。
3. 体外培养：将构建好的质粒导入细胞培养物中，利用细胞的自身复制和修复机制，使质粒与小鼠细胞的染色体发生重组，将外源基因导入到小鼠的基因组内。
4. 选择性筛选：为了筛选成功导入外源基因的细胞，可以添加抗生素等选择性标记物质，只有带有外源基因的细胞能够存活下来。
5. 胚胎干细胞注射：将筛选出的带有外源基因的细胞注射到小鼠的早期胚胎中。
这些细胞会参与胚胎发育，在小鼠的成体组织中形成细胞系，继续表达外源基因。
6. 交配和繁殖：将带有外源基因的小鼠进行交配和繁殖，使外源基因在小鼠种群中得以传递和稳定遗传。
通过以上步骤，外源基因成功导入小鼠基因组，并表达在小鼠的细胞和组织中，从而达到制备转基因小鼠的目的。
转基因小鼠制备流程及步骤
转基因小鼠制备流程及步骤遗传的基本物质是DNA，基因是位于染色体上有遗传效应的DNA片段，对于储存在生物全套染色体中的全部遗传信息，可称其为基因组。
不同种类、不同个体的生物基因组成是不同的，对动物个体来说，非自身的基因成分属于外源基因，如果把外源基因整合或导入动物染色体基因中，这个外源基因就被称为转基因(transgene)(即转移来的基因)，这种动物就是转基因动物。
下面介绍常用的受精卵原核注射法制备转基因小鼠方法。
1、选取7~8周龄雌性小鼠，阴道口封闭，作为供体，下午3:00左右，每只小鼠腹腔注射PMSG（10IU）。
2、47~48小时后，每只小鼠腹腔注射HCG（0.8 IU），并与正常雄鼠合笼；另取数只适龄雌鼠（2月龄以上）作为受体，阴道口潮红，与结扎公鼠合笼。
3、第二天上午9:00前观察供体、受体，有精栓者拿出备用。
受体笼拿出作好隔离措施。
4、10:30左右，断颈处死供体，手术取出整个输卵管，放入透明质酸酶~0.3mg/M2液中。
显微镜下，用镊子撕开输卵管壶腹部，受精卵随同颗粒细胞即一同流出。
5、仔细观察放在透明质酸酶M2液中的受精卵，当受精卵周围的颗粒细胞脱离时，将受精卵吸出，放入M2液中洗涤，最后放在M16液中放入5% CO2，37C0培养箱培养。
6、在显微镜下观察，挑选细胞饱满，透明带清晰，雄原核清晰可见的受精卵待用。
7、安装持卵针和注射针，使其末端平行于载物台，在凹玻片的中央滴入一滴M2液，覆盖石蜡油，移入待注射的受精卵。
DNA在注射针中的气泡应在先前全部弹走。
8、在高倍镜下，将注射针轻触持卵管，使DNA缓慢流出并控制其流量；反复吹吸受精卵，使其处于最佳位置，将注射针刺入受精卵的雄原核，直至看到原核膨大即退出。
将注射过的和未注射过的受精卵上下分开放置，不致于混搅，注射完毕后，放入5% CO2，37C0培养箱培养。
9、将受体麻醉，注射计量为1%戊巴比妥钠0.01ml/g，腹腔注射。
手术取出卵巢连接输卵管，用脂肪镊固定，在显微镜下找到输卵管开口。
基因表达载体的构建
基因枪法 花粉管通道法
.
1）土壤农杆菌法
.
2）基因枪法
.
3）花粉管通道法
.
2、受体细胞是动物细胞
显微注射法 注入动物受精卵
.
1982年，世界上第一例体型比普通 小鼠大1.8倍的转基因超级小鼠诞生物的好处是什么？ 繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少 要想使重组DNA顺利进入细菌细胞内，最
二、基因表达载体的构建（核心步 骤）
.
先用同一种限制 酶分别切割目的 基因和质粒，再 用DNA连接酶将 二者连接，形成 重组DNA分子。
.
三、将目的基因导入受体细胞（转化）
常用的受体细胞： 有大肠杆菌、枯草杆菌、酵母菌和动植物
细胞等。
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1、受体细胞是植物细胞
农杆菌转化法：主要侵染双子叶植物（伤
.
2、检测mRNA
分子杂交技术
.
4、检测性状
.
大的难题是什么？ 一般用CaCl2处理，改变细胞膜的通透性，
使得重组DNA能够进入细胞。
.
四、目的基因的检测与鉴定
分子 水平
检测转基因生物的DNA是否插入目的基因 检测目的基因是否转录出了mRNA 检测目的基因是否翻译成蛋白质
个体水平 检测性状
.
1、检测目的基因
DNA分子杂交技术 提取转基因生物的DNA 制作分子探针（目的基因的一段单链序列） 进行分子杂交
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小 鼠 ｓｘ ｏ 因 的 克 隆 及 其 原 核 表 达 载 体 构 建 ２基
王 春 红 ，周 秀 梅 ，刘 辉， 黎 江 ， 其 军 钱
（ 江理工大学生命科 学院， 州 ３０ １） 浙 杭 １ ０ ８ 摘 要 ： ＡＴ 穿膜 肽 能 携 带 大分 子 物 质 进 入 细 胞 。 Ｎ 定 位 信 号 肽 是 能 帮 助 亲核 蛋 白进 入 细 胞 核 的 短 肽 。 Ｔ Ｉ Ｓ核 Ｓ ｘ １家族 的 Ｓ ２是 维持 Ｅ ｏＢ ＯＸ Ｓ细胞 全 能 性 的 重 要 转 录 因 子 。 通 过 Ｒｒ Ｐ Ｒ 方 法 从 小 鼠 胚 胎 干 细 胞 中 克 隆 得 到 小 ｒ Ｃ ＿
到桑椹 胚期 ， ＯＸ Ｓ ２蛋 白的表达 都 主要 在 核 中 ， 细胞 质 中也 有 。到 了囊 胚期 ， 滋 养 外胚 层 细 胞 中， Ｏ 但 在 Ｓ Ｘ２ 蛋 白主要 存在 于细 胞质 中 ， 而在 内细 胞 团 细胞 中 ， ＯＸ Ｓ ２蛋 白主要 位 于细 胞 核 中 ， 说 明母 体 Ｓ ） ２蛋 白的 这 （Ｘ 表达 一直 持续 了整个 着 床 前 的发 育 阶段 ｎ］ 。在体 外 ， ＯＸ Ｓ ２在 未 分化 的 Ｅ Ｓ细胞 、 胚胎 癌 细胞 （ Ｃ 细胞 ） Ｅ 中
Ｂ ｍＨ 工、 ａ 购 自 ＮＥ ａ Ｓｌ Ｉ Ｂ公 司 ， ． ｏｉＤ ａ购 自 Ａ Ｃ， 体 ｐ Ｔ ２ 表 达 菌株 Ｂ ２ （ ３ 、 Ｔｒｐ Ｅ ｃｌ Ｈ５ ＴＣ 载 Ｅ ３ Ａ、 Ｌ １ ＤＥ ） Ｈｉ ａ Ｃ ｅ ｔ ｇＨＰ亲合层析 柱购 自 ＧＥ公 司 ， ｈｌｉ ａｎ 表达 载体 ｐ Ｔ３ Ａ一 ｔｘ 由本 实 验室 改 造保存 。咪唑 、 素购 自 Ｅ ２ △ ｒＡ 尿
浙 江理 工大 学学报 ， ２ 卷 ， ２期 ，０ ０年 ３月 第 ７ 第 ２１
Ｊ ｕ ｎ ｌ ｆＺｈ ｊａ ｇ Ｓ ｉ ｃ ｉｅ ｓｔ ｏ ｒ ａ ｅｉｎ ｃ— ｈ Ｕｎ ｖ ｒ ｉ ｏ Ｔｅ ｙ
Ｖ０ ． Ｉ ２７，Ｎｏ． ２，Ｍ ａ ．２０ ０ ｒ ｌ
文章 编 号 ：１７ —８ １（０ ０ ２ ０ ９ —６ ６ ３３ ５ ２ １ ）０ —２ ７ ０
通 讯 作 者 钱其 军， 电了信箱 ：ｑａ ｑ＠１ ３ Ｃｒ ＪｎＪ ６ ．Ｏ ｎ
浙
江
理
工
大
学
学
报
２１ ００年
第 ２ 卷 ７
１ 材 料 与方 法
１ １ 材 料 ．
Ｔｒ ｏ试 剂购 自 ＧＩＣ 公 司 ， ＭＬ Ｒ ｖｒｅ逆 转 录 试 剂 盒 购 自 Ｉｖｔｏ ｅ ｉｌ ｚ Ｂ Ｏ Ｍ— Ｖ ｅｅｓ ｎ ｉ ｇｎ公 司 ， ｒ 限制 性 内切 酶
表达 ， 随着其 分化 表 达下 调 】 而 。
ＴＡＴ蛋 白是 人类 免疫 缺 陷病毒 ｌ型 （ Ｖ－ ） ＨＩ １ 的反 式 激 活 因子 （ｒｎ —ｃｉａｏ ） ｔａ ｓａｔ ｔｒ 。它是 一 种 正性 调 控 蛋 ｖ 白， 节 ＨＩ 一 的 基 因转 录 和复制 。完整 的 Ｔ 调 Ｖ１ ＡＴ 蛋 白由 ８ 个 氨基 酸残 基组 成 ， ２ 外显 子 。ＨＩ ＿ ＡＴ ６ 含 个 ＶＴ 中有一 个 富含碱 性氨 基 酸 、 正 电荷 的多肽 片段 ， 片段 与蛋 白转 导功 能相关 ， 带 此 ＴＡＴ穿膜 肽是 ＨＩ Ｔ Ｖ— ＡＴ 细 胞 穿 膜肽 中的 核心 区域 ， 由 １ 它 １个 氨基酸 残基 （ ＹＧＲ ＫＫＲ ＲＱ Ｒ） ＲＲ 组成 ， 是应 用最 为普 遍 的细胞 穿膜肽 。
关 键 词 ：穿膜 肽 ； 定 位 信 图分 类 号 ：Ｑ２ ９ ７ 文献标识码 ： Ａ
０ 引 言
Ｓ ｘ 家族 的 Ｓ ２是维 持胚 胎 干 细 胞 （ Ｓ细 胞 ） 能性 的重 要 转 录 因子 。在胚 胎 发 育 过 程 中 ，ｏ ２ ｏ Ｂ１ ＯＸ Ｅ 全 ｓｘ
核 定位信号 肽 （ｕｌ ｒｏａｚｔ ｎｓ ｎｌＮＩ 可位 于多肽序 列的任何部分 ， ｎ ｃ ａ ｃｌａｉ ｇ ａ， ５） ｅ ｌ ｉ ｏ ｉ 一般含有 ４ 个氨基 酸 ， 没 ４８ 且
有 专一性 ， 作用是 帮助亲 核 蛋 白进入 细胞 核 。第一 个 被确 定 的 Ｎ Ｓ序列 的蛋 白质是 Ｓ ０的 Ｔ抗 原 （ Ｌ Ｖ４ Ｍｗ一
鼠 ｓｌ 基 因， ｏ２ 将其 与穿膜 肽基 因 ｔｔ ａ 和核 定位信号基 因ｎｓ融合 ， ｌ 利用原核表达载体进行 融合 蛋 白表 达， 并将表 达的
蛋 白纯 化 、 性得 到 复 性 蛋 白 ， 复 为今 后 对 ｓ Ｘ２ 白 的 功 能 及 生 物 学 活 性 展 开 研 究奠 定 了基 础 。 ０ 蛋
Ｓ ２蛋 白的功能 及生 物学 活性 展开 研究 奠定 基础 。 ＯＸ
０ ８— ０ — ６ 收稿 日期 ２ ０ — ３— ２
基 金 项 目 国家 高 技 术 研 究 发 展 计 划 “ ６ ” 点 资 助 项 目 （０ ７ ８３重 ２ ０ ＡＡ０ １０ ） ２ １８
作 者 简 介 王 春 红 （９ ８ ）女 ， 北 保 定 人 ， 士 研 究 生 ， 究 方 向是 胚 胎 干 细 胞 。 １７ 一 ， 河 硕 研
９ｋ ａ ， ２ Ｄ ） 它在细胞质 中合成后 很快积 累在细胞核 中 ， 是病 毒 Ｄ Ａ 在核 内复制所 必需 的蛋 白质 。其 野 生型 的氨 Ｎ 基 酸序列为 Ｐ ＫＫＲ Ｋ ＫＶ， 它是 一段保 守序列 ， 即使单 个氨基 酸突变也 能阻止这种蛋 白进入细胞核 。 本 文通 过 Ｒ － Ｃ 方 法克 隆得 Ｎｄ 鼠 ｓｏ ＴＰ Ｒ ， ｏ ２基 因 ， 用 Ｐ Ｒ 的 方法 将其 与 核定 位 信 号肽 基 因 ｎｓ ｔ 采 Ｃ ｌ 与穿 膜 肽基 因 ｔｔ ａ 融合 ， 融合 后 的基 因成 功构 建 入 原 核表 达 载 体 ， 达并 纯 化 得 到 了纯 品融 合 蛋 白 ， 将 表 为今 后 对