姜黄素对人眼Tenon囊成纤维细胞抑制作用的研究

姜黄素对人眼Tenon囊成纤维细胞抑制作用的研究
【摘要】目的研究姜黄素对体外培养人眼Tenon囊成纤维细胞增殖的抑制作用,探索防治青光眼手术区滤过泡纤维瘢痕化的新途径。

方法用0～80 μg/ml 姜黄素作用体外培养的人眼Tenon囊成纤维细胞, 观察24～96 h后不同浓度姜黄素对人眼Tenon囊成纤维细胞的影响。

CCK-8法检测细胞生长活性。

结果在0～80 μg/ml浓度作用24～96 h范围内,姜黄素可以抑制人眼Tenon囊成纤维细胞的增长,且呈剂量和时间依赖性。

结论姜黄素可抑制体外培养人眼Tenon囊成纤维细胞增殖。

【Abstract】Objective To investigate the effect of curcumin on proliferation of human Tenon capsule fibroblast in vitro.Methods The CCK-8 method was used to assay the activity of human Tenon capsule fibroblast at 24 h, 48 h, 72 h and 96 h after treated with 10, 20, 40, 80 μg/ml curcumin in vitro.Results The activity of human Tenon capsule fibroblast at 24 h, 48 h, 72 h and 96 h after treated with 10, 20, 40, 80μg/ml curcumin was inhibited significantly compared with the control and it was dose-dependent and time-dependent.Conclusion The proliferation of human Tenon capsule fibroblast was inhibited significantly by curcumin.
【Key words】Curcumin; Glaucoma; Tenon capsule fibroblast; Cell counting Kit-8
基金项目: 广东省中医药管理局基金(项目编号:2007106)
青光眼已成为世界范围内占第二位的不可逆性致盲眼病,而滤过手术是治疗青光眼的重要手段之一,其方法是通过被切除的小梁组织形成一滤过通道,使房水外流从而达到降低眼压,保存残存视功能的目的。

但滤过手术存在10%～30%的失败率[1],其失败的直接原因主要是滤过口处成纤维细胞的增殖、迁移而导致滤过道的纤维瘢痕化,使滤过通道堵塞.这也是青光眼临床与研究中所面临的难题之一,术中应用抗增殖药物如丝裂霉素(mitomycin,MMC)经术后的临床观察可提供手术的成功率,但也存在一定的毒副作用限制其使用。

因此许多眼科工作者为防治滤过手术的失败而寻找安全、有效抑制成纤维细胞增殖的方法进行着不懈的努力。

姜黄素是一种历史悠久的传统中药,具有多种疗效:抗纤维增殖作用[2]、抑制血管生成[3]、抗肿瘤作用[4]、抗氧化作用[5]、抗炎作用等多种药理作用,且无明显毒副作用具有较好的临床应用前景。

目前其在对其他器官和组织的成纤维细胞方面的研究和应用中取得了一定的成果和进展,但在研究姜黄素对人眼Tenon囊成纤维细胞中的作用还比较少,为研究姜黄素对体外培养的人眼Tenon囊成纤维细胞的抗增殖的作用效果,从而探索防治青光眼手术区滤过泡纤维瘢痕化的新途径,提高青光眼手术成功率。

笔者设计以下实验。

1 材料和方法
1.1 材料与主要仪器设备
1.1.1 试剂CCK-8(Cell Counting Kit-8)(Dojindo公司)、姜黄素(购自SIGMA 公司)、vimentin单克隆抗体(博士德公司) 、DAB显色试剂(博士德公司)。

1.1.2 主要仪器设备CO2培养箱(德国Heraeus BB16)、手术显微镜(德国Zeiss)、光学倒置显微镜(德国Leica MPS-30)、Wellscan MK3酶标仪(美国Labsystem Dragon)、
1.2 方法
1.2.1 人眼Tenon囊成纤维细胞的培养、鉴定眼球结膜下Tenon囊组织标本为中山大学附属第二医院眼科青光眼手术切除组织,采用组织块培养法原代接,第3～6代细胞用于实验。

按常规方法培养细胞[6],并活体显微镜、组织学观察与进行细胞照相。

利用盖玻片培养法进行HE染色,并取第3代细胞按免疫细胞化学试剂盒说明书作Vimentin染色鉴定细胞。

1.2.2 CCK-8法检测姜黄素对人眼Tenon囊成纤维细胞的增殖的影响实验方法、步骤:①取处于对数生长期的Tenon囊成纤维细胞以10%胎牛血清的高糖DMEM制备为2500个/ml细胞悬液,每孔加入100 μl的细胞悬液分别接种于4块96孔培养板中培养24 h,贴壁;
②至细胞长至单层后,分别在细胞中加入终浓度为10、20、40、80 μg/ml的姜黄素,同时设不加药的阴性对照和只加培养液的空白对照,每组设4个复孔;
③再将96孔培养板分别培养24、48、72、96 h后,向每孔中加入10%胎牛血清的高糖DMEM培养基100 μl及10 μlCCK-8继续放入培养箱内培养3 h;
④酶标仪检测450 nm处各孔OD值;每组实验重复3次。

1.2.3 细胞增生抑制率的计算根据CCK-8的吸光度(A)值计算出细胞增生抑制率并绘制时间、剂量效应曲线。

增生抑制率%=(对照组A值- 实验组A值)/对照组A值×100%
1.2.4 统计学方法所有数据用SPSS 11.0软件包处理,实验结果数据计量资料用(x±s)表示,CCK-8对人眼Tenon囊成纤维细胞抑制率的浓度和时间关系采用多组定量资料的单因素方差分析进行统计分析。

2 结果
2.1 人眼Tenon囊成纤维细胞的体外培养及生物特性鉴定
2.1.1 体外培养人眼Tenon囊成纤维细胞的形态特征和生物特性倒置相差显微镜下观察细胞,可见原代培养的组织块约一周后细胞开始从组织块周边游离出来(图1A),胞体狭长,透亮,胞浆丰富,核圆形、椭圆形。

胞膜清晰,呈典型的梭形,
繁殖较快,约2～3周细胞增殖基本融合,细胞变长,靠近,呈放射状或漩涡状走行(图1B)。

图1 人眼Tenon囊成纤维细胞原代与传代培养 A.原代培养的组织块约6～7 d后细胞开始从组织块周边游离出来B.成纤维细胞胞膜清晰,呈典型的梭形,呈放射状或漩涡状走行。