RNA Recombination
植物基因克隆方法
Probe (oligonucleotides) Primer (degenerated primer)
(b) Oligonucleotide probes or generated primers for genes whose translation products have been characterized
（1）复制为半不连续复制，而PCR两条链的合成都是连续的 （2）复制时引物是由引发酶或引发体合成的，而PCR引物是在
反应前加到反应体系中 （3）复制需要在特定的复制原点起始，并且有终止点，而PCR
在有特异引物存在时在任何序列都可起始，并且没有终止点 （4）复制时两条模板链是在解旋酶的作用下局部打开双链，而
利用一种植物的一段DNA序列作探针，从其它 植物中克隆同源基因
注意：有的基因在不同物种间同源性很高，有的则很低。
2、利用protein信息分离基因 前提是所研究的protein可以从植物中分离纯化
Antibody production Construction of Expression Library
DNA 重组
目的DNA （target fragment）
重组DNA （recombinant DNA ）
转化
宿主（host）
筛选、扩增 克隆（clone）
用何种方法取决于基因产物（Gene products）的 丰度以及gene的相关背景知识，
如 gene or its protein 的表达模式及初级结构等
（一）已知 基因产物 的基因分离 （二）未知 基因产物 的基因分离
（一）已知 Gene products 的基库
● 同源(homologous)DNA探针
医学遗传学名词解释总结
医学遗传学medical genetics：应用遗传学的理论与方法研究遗传因素在疾病的发生、流行、诊断、预防、治疗和遗传咨询等中的作用机制及其规律的遗传学分支学科遗传病genetic disease：发生需要有一定的遗传基础，通过这种遗传基础、并按一定的方式传于后代发育形成的疾病基因组genome：单倍体细胞核、细胞器或病毒粒子所含的全部DNA分子或RNA 分子再发割裂基因split gene：真核生物的结构基因由编码序列与非编码序列两者间隔排列组成城断裂状，称割裂基因风险率recurrence risk：病人所患的遗传性疾病在家系亲属中再发生的风险率内含子intron 又称插入序，指基因中的非编码序列。
外显子exon 指结构基因基因中的编码序列基因表达gene expression：细胞在生命过程中，储存在DNA顺序中的遗传信息经过转录和翻译，转变为具有生活活性的蛋白质分子。
假基因pseudogene：一种畸变基因，核苷酸序列与有功能的正常基因有很大的同源性，但由于突变、缺失或插入以至不能表达，因而没有功能的基因基因家族gene family：真核基因组中有许多来源相同，结构相似，功能想关的基因，这组基因成为基因家族。
GT-AG rule割裂基因结构的一个重要特点，指的是在各种真核生物基因中，每个内含子的两端具有广泛的同源性和互补性，5端起始的两个基因碱基是GT，3端最后两个简直是AG。
基因突变gene mutation：基因在结构上发生碱基对组成或排列顺序的改变称为基因突变诱变剂mutagen凡是能够诱发基因突变的各种内外环境因素均被称之为诱变剂静态突变static mutation：生物世代中基因突变的发生，总是以相对稳定的一定频率发生，并且能够使得这些突变随着世代的繁衍、交替而得以传递无义突变nonsense mutation 当碱基置换或移码导致mRNA上出现终止密码，多肽链合成提前终止，产生失去活性或丧失正常功能的蛋白质。
分子生物学名词解释最全
第一章名词解释1.基因（gene）是贮存遗传信息的核酸（DNA或RNA）片段，包括编码RNA和蛋白质的结构基因以及转录调控序列两部分。
2. 结构基因（structural gene）指基因中编码RNA和蛋白质的核苷酸序列。
它们在原核生物中连续排列，在真核生物中则间断排列。
3.断裂基因（split gene真核生物的结构基因中，编码区与非编码区间隔排列。
4. 外显子（exon）指在真核生物的断裂基因及其成熟RNA中都存在的核酸序列。
5.内含子（intron）指在真核生物的断裂基因及其初级转录产物中出现，但在成熟RNA中被剪接除去的核酸序列。
6.多顺反子RNA（polycistronic/multicistronic RNA）一个RNA分子上包含几个结构基因的转录产物。
原核生物的绝大多数基因和真核生物的个别基因可转录生成多顺反子RNA。
7.单顺反子RNA（monocistronic RNA）一个RNA分子上只包含一个结构基因的转录产物。
真核生物的绝大多数基因和原核生物的个别基因可转录生成单顺反子RNA。
8. 核不均一RNA（heterogeneous nuclear RNA, hnRNA）是真核生物细胞核内的转录初始产物，含有外显子和内含子转录的序列，分子量大小不均一，经一系列转录后加工变为成熟mRNA。
9. 开放阅读框（open reading frame, ORF）mRNA分子上从起始密码子到终止密码子之间的核苷酸（碱基）序列，编码一个特定的多肽链。
10.密码子（codon） mRNA分子的开放读框内从5' 到3' 方向每3个相邻的核苷酸（碱基）为一组，编码多肽链中的20种氨基酸残基，或者代表翻译起始以及翻译终止信息。
11. 反密码子（anticodon）指tRNA分子反密码环中间3个相邻的核苷酸（碱基），它们与mRNA上的三联体密码子互补配对，确保蛋白质合成时氨基酸按照密码子对号入座。
生物化学及分子生物学名词中英文对照表
covalent modification
共价修饰
hydrolase
水解酶
inducer
诱导剂
lyase
裂解酶
corepressor
辅阻遏剂
isomerase
异构酶
lactate dehydrogenase(LDH)
乳酸脱氢酶
ligase
合成酶
creatine kinase(CK)
肌酸激酶
isoenzyme
金属激活酶
reversible inhibition
可逆性抑制
coenzyme
辅酶
competitive inhibition
竞争性抑制
prosthetic group
辅基
non-competitive inhibition
非竞争性抑制
essential group
必需基团
uncompetitive inhibition
核糖体RNA
transfer RNA(tRNA)
转运RNA
messenger RNA(mRNA)
信使RNA
3章biocatalyst
生物催化剂
proximity effect
邻近效应
enzyme
酶
orientation arrange
定向排列
substrate
底物
multielement catalysis
切除修复
recombination repairing
重组修复
reverse transcriptase
逆转录酶
integration
整合
ribozyme
核酶
DNA位点特异性重组2
Figure 12-18
Genetic organization of the three classes of transposable elements
Figure 12-19
DNA Transposition by a Cut-andPaste Mechanism
Figure 12-16
Transposition of a mobile genetic element to a new site in the host DNA
Transposable elements are present in the genomes of all life-forms
Figure 12-18b
Virus-Like Retrotransposons and Retroviruses Carry Terminal Repeat Sequences and Two Genes Important for Recombination
Virus-like retrotransposons and retroviruses also carry inverted terminal repeat sequences that are the sites of recombinase binding and action. The terminal inverted repeats are embedded within longer repeated sequences; these sequences are organized on the two ends of the element as direct repeats and are called long terminal repeats (LTRs). Virus-like retrotransposons encode two proteins needed for their mobility: integrase (the transposase) and reverse transcriptase. Reverse transcriptase (RT) is a special type of DNA polymerase that can use an RNA template to synthesize DNA.
名词释义(生物化学)
名词释义：仅限公办临床医学、眼科、口腔、麻醉、影像等专业（100学时教学平台）（参考人卫第八版：p.504-p.517）cDNA文库(cDNA library)、DNA印迹(DNA blotting)、DNA变性(DNA denature)、DNA聚合酶(DNA polymerase)、DNA损伤(DNA demage)、DNA重组(DNA recombination)、G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptor)、Klenow片段(Kleow fragment)、Km值(Km value)、P/O 比值(P/O ratio)、RNA干扰(RNA interference, iRNA)、RNA印迹(RNA blotting)、RNA剪接(RNA splicing)、SD序列(SD sequence)、SH2结合域(SH2 domain)、Warburg效应(Warburg effect)、γ-谷氨酰基循环(γ-glutamyl cycle)、癌基因(oncogene)、氨基酸代谢库(amino acid metabolic acid)、氨基酰-tRNA合成酶(aminiacyl-tRNA synthetase)、巴斯德效应(Pasteur effect)、半保留复制(semiconservative replication)、必需脂肪酸(essential fatty acid)、标志补救(marker rescue)、表型克隆(phenotype cloning)、别构调节(allosteric regulation)、不对称转录(asymmetric transcription)、层析(chromatography)、长链非编码RNA(long noncoding RNA, LncRNA)、短链非编码RNA(Small noncoding RNA, SncRNA)、超家族基因(superfamily gene)、沉默子(silencer)、初级胆汁酸(primary bile acid)、次级胆汁酸(secondary bile acid)、错配修复(mismatch repair)、代谢组学(metabonomics)、单体酶(monomeric enzyme)、单顺反子(monocistron)、胆固醇逆向转运(reverse cholesterol transport, RCT)、胆汁酸的肠肝循环(enterohepatic circulation of bile acid)、蛋白激酶(protein kinase)、蛋白质变性(protein denaturation)、蛋白质的靶向输送(protein targeting)、蛋白质的腐败作用(putrefaction)、蛋白质的互补作用(complementary action)、蛋白质的等电点(protein isoelectric point, PI)、蛋白质相互作用结构域(protein interaction domain)、蛋白质组学(proteomics)、氮平衡(nitrogen balance)、低密度脂蛋白受体(LDL receptor)、底物水平磷酸化(substrate-level phosphorylation)、第二信使(second messenger)、电泳(electrophoresis)、端粒及端粒酶(telomere and telomerase)、断裂基因(spilt gene)、多基因家族(multigene family)、多聚核糖体(polyribosome)、多顺反子(polycitron)、翻译后加工(post-translational processing)、反式作用因子(trans-acting factor)、反义RNA(antisense RNA)、泛素(ubiquitin)、非蛋白氮(non protein nitrogen)、分子伴侣(molecular chaperon)、分子病(molecular disease)、干扰小RNA(small interfering RNA, siRNA)、感受态细胞(competent cells)、冈崎片段(Okazaki fragment)、功能克隆(functional cloning)、共有序列(consensus sequence)、管家基因(house-keeping gene)、核苷酸的从头合成(de no synthesis)、核酸分子杂交(nucleic acid hybridization)、核糖体循环(ribosomal cycle)、核糖核酸酶保护实验(ribonuclease protein assay, RPA)、核小RNA(small nuclear RNA, snRNA)、基因捕获(gene trapping)、基因打靶(gene targeting)、基因定位(gene location)、基因定位的连锁分析(linkage analysis)、基因剔除(gene knock out)、基因芯片(gene chip)、基因诊断(gene diagnosis)、基因治疗(gene therapy)、基因组DNA文库(genomic DNA library)、基因组学(genome)、激素敏感性脂肪酶(hormone sensitive lipase, HSL)、剪接体(spliceosome)、碱基堆积力(base stacking interaction)、结构域(domain)结合胆红素(conjugated bilirubin)、解偶联剂(uncoupler)、聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)、开放阅读框(open reading frame, ORF)、可诱导基因(inducible gene)、空间特异性(spatial specificity)、框移突变(frame shift mutation)、磷酸戊糖途径(pentose phosphate pathway)、磷脂酶A2(phospholipase A2, PLA2)、卵磷脂：胆固醇酯酰转移酶(lecithin: cholesterol acyl trans)、酶的共价修饰(covalent modification)、酶的活性中心(active center)、酶的竞争性抑制(competitive inhibition)、酶原(zymogen)、密码子(codon)、免疫印迹(immunoblot)、模体(motif)、内含子(intron)、逆转录PCR(reverse transcription PCR, RT-PCR)、鸟苷酸结合蛋白(guanine nucleotide binding protein, G protein)、柠檬酸循环(citric acid cycle)、启动子(promoter)、切除修复(excision repair)、乳糜微粒(chylomicron, CM)、乳酸循环(Cori cycle)、乳糖操纵子(lac operon)、生物转化(biotransformation)、受体(receptor)、实时PCR(real-time PCR)、顺式作用元件(cis-acting element)、探针(probe)、糖的无氧氧化(anaerobic oxidation)、糖的有氧氧化(aerobic oxidation)、糖酵解(glycolysis)、糖生物学(glycobiology)、糖异生(gluconeogenesis)、糖原(glycogen)、同工酶(isoenzyme)、酮体(ketone body)、退火(annealing)、外显子(exon)、微RNA(microRNA, miRNA)、微量元素(microelement)、维生素(vitamin)、未结合胆红素(unconjugated bilirubin)、细胞色素(cytochrome)、细胞色素P450单加氧酶(cytochrome P450 monooxygenase)、细胞外基质(extracellular matrix)、纤连蛋白(fibronection)、限速步骤(rate-limiting step)、限制性核酸内切酶(restriction endonuclease, RE)、协调表达(coordinate expression)、锌指结构(zinc finger)、信号序列(signal sequence)、信号转导(signal transduction)、血脂(plasma lipids)、亚基(subunit)、氧化呼吸链(oxidative respiration)、氧化磷酸化(oxidative phosphorylation)、一碳单位(one carbon unit)、引发体(primosome)、营养必需氨基酸(nutritionally essential amino acid)、诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cell, iPS)、载体(vector)、载脂蛋白(apolipoprotein)、增强子(enhancer)、增色效应(hyperchromic effect)、脂蛋白(lipoprotein)、脂蛋白脂肪酶(lipoprotein lipase, LPL)、脂肪动员(fat mobilization)、脂组学(lipidomics)、肿瘤抑制基因(tumor suppressor gene)、重组DNA技术(recombinant DNA technology)、转氨基作用(transamination)、转基因动物(transgenic animal)、转基因技术(transgenic technology)、转录(transcription)、转录后加工(post-transcriptional processing)、转录泡(transcription bubble)、转录因子(transcription factor)、转录组学(transcriptomics)、组成性基因表达(constitutive gene expression)、阻遏蛋白(repressor)。
第二十三章 DNA重组和重组DNA技术【生物化学与分子生物学 9版原版】
第二节
重组DNA技术
序言：
重组DNA技术
又称： 分子克隆（molecular cloning） DNA克隆（DNA cloning） 基因工程（genetic engineering）
主要过程：
——在体外将目的DNA与能自主复制的遗传元件（载体）连接， 形成重组DNA分子 ——重组DNA分子在受体细胞中复制、扩增及克隆化，从而获得 单一DNA分子的大量拷贝
• 大多数RE的识别序列为回文结构（palindrome） • 有些RE所识别的序列虽然不完全相同，但切割DNA双链后可产
生相同的黏端，这样的酶彼此互称同尾酶（isocaudamer） • 有些RE虽然来源不同，但能识别同一序列（切割位点可相同或
不同），这样的两种酶成同裂酶（isoschizomer）
克隆载体
——是指用于外源DNA片段的克隆和在受体细胞中扩增的DNA分子。
克隆载体的基本特点：
至少有一个复制起点使载体能在宿主细胞中自主复制，并能使克隆的外源DNA片段得到 同步扩增； 至少有一个选择标志（selection marker），从而区分含有载体和不含有载体的细胞，如 抗生素抗性基因、-半乳糖苷酶基因（lacZ）、营养缺陷耐受基因等； 有适宜的RE单一切点，可供外源基因插入载体。
第一节小结
小结：
自然界DNA重组方式 主要包括： 同源重组，Holliday模式是最经典的同源重组模式 位点特异性重组 转座重组或转座，包括插入序列和转座子的重组 接合，通过细胞接触所发生的基因转移 转化，通过细胞自主摄取发生的DNA整合 转导，病毒感染介导的DNA整合 CRISPR/Cas9系统，细菌获得病毒DNA用于攻击病毒
一、同源重组
同源重组的Holliday模型
分子生物学-名词解释
名词解释：核酸结构，性质与功能分子生物学:是从分子水平研究生命现象、生命的本质、生命活动及其规律的科学。
医学分子生物学:是从分子水平研究人体在正常和疾病状态下生命活动及其规律的一门科学。
它主要研究人体生物大分子和大分子体系的结构、功能、相互作用及其同疾病发生、发展的关系。
基因：是核酸分子中贮存遗传信息的遗传单位，是指DNA特定区段，是RNA和蛋白质相关遗传信息的基本存在形式。
大部分生物中构成基因的核酸是DNA, 少数生物（如RNA病毒）是RNA。
核酸的一级结构：核酸中核苷酸的排列顺序。
组成DNA分子的脱氧核糖核苷酸(dAMP, dGMP, dTMP, dCMP)的排列顺序。
组成RNA分子的核糖核苷酸(AMP, GMP, UMP, CMP)的排列顺序。
由于核苷酸间的差异主要是碱基不同，所以也称为碱基序列。
DNA的一级结构：四种脱氧核糖核苷酸(dAMP, dGMP, dTMP, dCMP)或四种碱基的排列顺序。
DNA三级结构：DNA分子在形成双螺旋结构的基础上，进一步折叠成超螺旋结构(supercoil) (原核细胞)，或在蛋白质的参与下，进行精密的包装(真核细胞)，所形成的空间结构。
超螺旋结构(superhelix 或supercoil)：DNA双螺旋链再盘绕即形成超螺旋结构。
正超螺旋(positive supercoil)盘绕方向与DNA双螺旋方同相同；负超螺旋(negative supercoil)盘绕方向与DNA双螺旋方向相反。
结构基因：在基因片段中，贮存着一个特定的转录RNA分子的DNA序列，这段序列决定该RNA分子的一级结构，就称为结构基因。
外显子（exon):结构基因中在成熟RNA分子中保留的相对应的序列内含子(intron):是指RNA分子剪接时删除部分相对应的结构基因序列基因转录调控序列:与转录相关的、结构基因以外的序列启动子（promoter):是RNA聚合酶特异性识别和结合的DNA序列，位于结构基因转录起始点的上游，偶见位于转录起始点的下游。
CRISPR-Cas9基因靶向修饰
有一种细菌编码的酶能够利用向导RNA（guide RNA）分子对特定的DNA片段进行定向切割，科学家们利用这种特点开发出了一种能够对基因组进行特异性定点改造的工具，对细胞乃至整个生物体进行基因组改造。
目前已经利用这种技术对细菌、人体细胞以及斑马鱼进行过成功的遗传学改造工作。
日本大阪大学（Osaka University）的科研人员们曾经在1987年发表过一篇论文，不过这篇论文在当时并没有引起太多人的注意，只不过是一篇普普通通的小文章。
这帮大阪大学的科学家当时正在对一种细菌编码的碱性磷酸酶（alkaline phosphatase）基因进行研究，不过他们在工作中发现，在这个基因编码区域的附近存在一小段不同寻常的DNA片段，这些片段是由简单的重复序列组成的，而且在片段的两端还存在一段不太长的特有的序列。
关于这样一个重复序列他们当时在论文中是这样评价的——―我们目前也不太清楚这些序列的生物学意义。
‖不过这个在差不多三十年之前取得的不起眼的―小发现‖在今天却绽放出了耀眼的光芒，因为如今科学家们正是利用这个小片段找到了一种可以对多种生物的基因组进行遗传改造的工具，而且这种方法操作起来还非常地简单。
就在短短的一个月之内，在包括《科学》（Science）和《自然生物技术》（Nature Biotechnology）等杂志上就已经发表了5篇相关的论文介绍这个现在被称作CRISPR–Cas系统（CRISPR–Cas systems）、简便而又实用的基因组改造新技术。
近几十年来，随着全基因组测序技术的不断成熟，我们在各种细菌和古细菌（archaea）中也陆续发现了很多成簇的、规律间隔的短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeat sequences，即CRISPR序列，这就是二十多年前日本科学家发现的那个序列）和CRISPR相关基因（CRISPR-associated genes, Cas gene）。
RNA靶向的CRISPRCasRx系统在小鼠精原细胞系GC1-spg中的应用
基础医学与临床Basic & Clinical MedicineMay 2021Vol.41 No.52021年5月 第41卷第5期文章编号：1001-6325(2021)05-0653-08 研究论文RNA 靶向的CRISPR/CasRx 系统在小鼠精原细胞系GCl-spg 中的应用李梦真，柳 俊，邹定峰，缪时英，王琳芳，宋伟，李凯**收稿日期：2021-01-26 修回日期：2021-03-20基金项目：国家自然科学基金(31970794,32000586)* 通信作者(corresponding author) ：likai@ (中国医学科学院基础医学研究所北京协和医学院基础学院医学分子生物学国家重点实验室，北京100005) 摘要：目的探究CRISPR/CasRx 介导的RNA 水平的基因敲降在小鼠精原细胞系GCl-spg 的应用。
方法利用同源重组的方法构建 EFla core promoter. CasRx. SV40. U6. DRs 表达质粒(CasRx-gRNA)和 EFla. EGFP,EFla. mCherry 、EFla. tdToamto 3种荧光蛋白表达质粒。
在人胚肾细胞系HEK-293T 内瞬时转染3种荧光蛋白表达质粒和CasRx-gRNA 表达质粒，通过荧光强度、Western blot 检测外源基因(荧光蛋白、EGFP 和mCherry)的敲降情况。
在HEK-293T细胞内转染CasRx-gRNA,通过q-PCR 检测内源基因mRNA 和IncRNA 干扰后的表达水平。
在小鼠精原细胞系GC1 内瞬时转染外源基因eg 加、mCherry 和CasRx-gRNA 表达质粒并通过以上方法检测外源基因(荧光蛋白)沉默效率。
结 果 成功构建了 CasRx-gRNA 和3种荧光蛋白表达质粒。
在HEK-293T 细胞内CRISPR/CasRx 介导的RNA 干扰外源基因(e 曲、mCherry )和内源基因(mRNA 、lncRNA )后，表达水平均显著下调(P<0.01)o 在小鼠精原细胞系GC1内验 证CRISPR/CasRx 系统,可有效和特异敲降外源基因e 加、mCherry 。
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RNA Recombination
真核重组 DNA分子在现有转录系统中难以表达或表达效率不够
理想，然而近年来出现的重组RNA可以解决这个难题。
Concept: a widespread phenomenon that has shaped modern
viruses by rearranging viral genomes or disseminating functional
modules among different viruses .
Models:the most accepted models of RNA recombination are the
replicase-driven template switching model,the RNA
breakage-induced template switching model,and the RNA breakage
and ligation model.
1. replicase-driven template switching model:
in the replicase- driven template switching model,the RNA
templates and viral replicase(RNA-dependent RNA polymerase) are
vital components of RNA recombination .At least three RNAs are
involved in recombination events:The primary RNA template(donor
strand ),the nascent strand synthesized from primary RNA and the
acceptor strand.
2. RNA breakage and ligation model:the model suggests that chimer
ic RNAs are formed by a breakage and ligation mechanism are based
on the well-characterized DNA-based breakage and ligation
recombination.
3. RNA breakage-induced template switching model: this model
predicts that breakage of donar RNA can promote replicase-driven
template switching.It is similar to the former, with the additional
requirement for cleavage of the donor RNA.
Teconology application: 利用QβRNA的变异体作为运载工具，以
10腺苷酸作为外源基因插入序列 ,重组的RNA分子在体外Qβ
复制酶复制系统中复制 、扩增成功。
重组RNA技术的重点是把外源RNA分子与载体分子连接在一起 ,
利用Qβ复制酶在试管中进行大量复制，RNA重组技术得以实现
主要依赖于Qβ复制酶和Qβ噬菌体RNA这一系统独特的复制能
力和特性（自主复制）。
目前，重组RNA技术尚处于萌芽状态 ,但随着该技术的进一步完
善和发展 ,必将同重组DNA技术一样成为分子生物学又一新的
手段。
技术运用（实验）：将Poly(A)引入Qβ噬菌体
1.QβRNA 的制备
2.噬菌体 RNA 的感染力测定
3. 含有 Poly(A ) 的重组 RNA分子的制备
4.含有 Poly(A)的重组QβRNA粗制品 (Q-A-Q混合物)的性质及
其感染力测定
5.带有 Poly(A ) 的重组噬菌体的分离
6. 带有Poly(A )的重组噬菌体RNA的分离和鉴定