神经细胞保护作用细胞试验

神经细胞保护作用细胞试验
一、SH-SY5Y细胞（人神经母细胞瘤细胞株）
1. 细胞损伤模型的建立
缺糖缺氧损伤；氧化损伤（H2O2）；氧化因子6-羟基多巴胺（6-OHDA）；冈田酸损伤；A
β25-35损伤；谷氨酸损伤。
2. 检测指标
1） 损伤模型建立的判定指标
CCK-8法测定细胞存活率，确定时效量效曲线，判定作用的浓度、时间。
细胞形态学---显微镜观察和Giemsa染色。
IC50测定。
噻唑蓝(MTT)比色测定细胞活力。
2）保护作用的判定指标及方法
细胞存活率；细胞液LDH活力；细胞内MDA含量、SOD活力、GSH-Px活力；噻唑
蓝(MTT)比色试验；胞内Ca2+的测定；免疫组化法检测Bcl-2蛋白的表达；Hoechst 33258 染
色凋亡镜检；Annexin -V/ PI 染色凋亡检测；胞内 ROS检测；线粒体细胞膜电势(MMP)检
测；细胞内钙浓度检测；Caspase-3 活性检测；细胞总蛋白的提取，蛋白定量采用改良的
Lowry 法；Western blot；分光光度计检测 6-OHDA 自氧化。细胞增殖变化；Real-Time PCR
检测AIF、Cyt C、Bax、Bcl-2 mRNA含量；Western Blotting检测AIF、Cyt C、Bax、Bcl-2
蛋白含量；双染法检测细胞凋亡
参考文献：于颖．川射干异黄酮类化学成分的神经保护作用[D]．山东：泰山医学院，2013．
参考文献：张莲珠．卷柏总黄酮及穗花杉双黄酮对认知障碍模型的治疗及可能作用途径
[D]．吉林：吉林大学，2013．
参考文献：赵丽霞．川芎嗪烟酸酯对神经细胞的保护作用研究 [D]．山东：山东大学，2005．
参考文献：田琳琳．复方丹参方有效成分对神经细胞氧化损伤的保护作用机制[D]．吉林：
中国人民解放军军事医学科学院，2006．
参考文献：彭扬中，崔海峰，冯淑怡，等．黄连解毒汤对神经细胞保护作用活性成分的筛选
［J］．中国实验方剂学杂志，2012，18（16）：203-207．
参考文献：胡文军．复方脑康胶囊治疗Alzheimer's病的药效学研究[D]．广州：南方医科大
学，2012．
二、pc12细胞模型
1. 细胞损伤模型的建立
Aβ25-35损伤；皮质酮损伤；谷氨酸损伤；NaCN加缺糖造成PC12缺血性样损伤；鱼藤酮
损伤；二氯化钴缺氧损伤；缺糖缺氧损伤；NO损伤
2. 检测指标
1） 损伤模型建立的判定指标
观察细胞形态；MTT比色；细胞增殖率；
2）保护作用的判定指标及方法
观察细胞形态；MTT测定细胞存活率；检测细胞上清液中LDH；苏木精- 伊红染色观察细
胞形态学变化；HE染色；尼氏体染色；电镜观察PC12细胞的超微结构；DCFH-DA 染色
检测细胞内活性氧类物质( ROS) 水平；流式细胞术检测PC12细胞的凋亡；分光光度法测
定细胞过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)、总超氧化物歧化酶(T-SOD)的活
性和总抗氧化能力(T-AOC)的水平；检测细胞培养液中丙二醛(MDA)的含量；硫代巴比妥法
测定细胞丙二醛含量；琼脂糖凝胶电泳观察DNA断裂梯形图谱；Western blot 分析PC12
细胞 Bcl-2、Bax、caspase-3 P20 及caspase-9 蛋白表达的变化；RT-PCR 法检测 PC12细
胞Bcl-2、Bax 及 caspase-3 mRNA 表达的变化；细胞内游离钙离子浓度、细胞线粒体膜电
位。
参考文献：牛慧娟，戴平，杨中林．葛根素对二氯化钴造成PC12细胞缺氧损伤的保护作用
［J］．海峡药学，2011，23（3）：190-192．
参考文献：王杰，程言博，印晓星．银杏叶提取物对6-OHDA诱导PC12细胞氧化应激的影
响［J］．徐州医学院学报，2010，30（4）：215-218．
参考文献：崔群力，孙圣刚．姜黄素通过抗氧化作用拮抗鱼藤酮致PC12 细胞损伤的研究
［J］．华中科技大学学报，2010，39（1）：37-46．
参考文献：胡文军．复方脑康胶囊治疗Alzheimer's病的药效学研究[D]．广州：南方医科大
学，2012．
参考文献：纪影实．山楂叶总黄酮对脑缺血-再灌注损伤的保护作用及其机制的研究[D]．吉
林：吉林大学，2006．
参考文献：王君．远志皂昔碱水解产物的化学成分及神经细胞保护作用研究[D]．北京：北
京协和医学院，2011．
参考文献：王莹．文冠果柄昔对神经细胞损伤的保护作用研究[D]．辽宁：沈阳药科大学，
2009．
参考文献：周妍妍．地黄饮子对Aβ致PC12细胞损伤影响的实验研究[D]．黑龙江：黑龙江
中医药大学，2007．
三、小鼠神经母细胞瘤细胞(Neur0．2a)模型，
1. 细胞损伤模型的建立
缺糖缺氧损伤；H2O2氧化损伤；谷氨酸损伤
2. 检测指标
1） 损伤模型建立的判定指标
MTT细胞活力测定；倒置显微镜观察细胞形态
2）保护作用的判定指标及方法
噻唑蓝(MTT)比色试验；LDH测定；MDA、GSH一Px和SOD活力测定；胞内Ca2+的测
定；琼脂糖凝胶电泳(AGE)；免疫组化法检测Bcl- 2蛋白的表达；细胞增殖变化。
参考文献：赵丽霞．川芎嗪烟酸酯对神经细胞的保护作用研究 [D]．山东：山东大学，2005．
参考文献：彭扬中，崔海峰，冯淑怡，等．黄连解毒汤对神经细胞保护作用活性成分的筛选
［J］．中国实验方剂学杂志，2012，18（16）：203-207．
四、原代培养的大鼠乳鼠大脑神经细胞模型，
1. 细胞损伤模型的建立
D —半乳糖所致衰老神经细胞的模型
2. 检测指标
1） 损伤模型建立的判定指标
MTT细胞活力测定
2）保护作用的判定指标及方法
透射电镜、扫描电镜观察拍照；细胞化学染色：尼氏体染色、LPF--Glenner 氏联合反应法；
酶细胞化学染色：SDH（琥珀酸脱氢酶）---亚铁氰化钾法、ACPase ---Gomori 法。
参考文献：金顺女．东川芎对 D-半乳糖所致衰老神经细胞保护作用研究[D]．吉林：延边大
学医学院，2002．
五、胎鼠脑神经干细胞(neuralstemcells,NSc)模型，
1. 细胞损伤模型的建立
Aβ25-35损伤；
2. 检测指标
1） 损伤模型建立的判定指标
细胞计数；MTT细胞活力测定；倒置显微镜观察细胞形态
2）保护作用的判定指标及方法
神经干细胞形态学观察包括细胞培养后的一般形态观察和培养细胞吉姆萨(Giemsa)染色后
的形态观察；DNA琼脂糖凝胶电泳检测神经干细胞凋亡（细胞凋亡DNA Ladder提取试剂
盒说明提取DNA经1%琼脂糖凝胶，10V/cm，恒压电泳分离40min，结束后于紫外光凝胶
成像系统拍照）；RT-PCR检测凋亡相关基因Bcl-2、Bax的表达水平。
参考文献：刘本娟．葛根素对神经干细胞保护作用的研究[D]．陕西：陕西师范大学，2009．
六、原代培养的大鼠海马神经元模型，
1. 细胞损伤模型的建立
谷氨酸损伤；缺糖缺氧损伤；NO损伤；丙烯酰胺(ACR)损伤。
2. 检测指标
1） 损伤模型建立的判定指标
MTT细胞活力测定；倒置显微镜观察细胞形态
2）保护作用的判定指标及方法
细胞形态和生存率、DNA琼脂糖凝胶电泳、细胞LDH活力、细胞内游离钙离子浓度、细胞
线粒体膜电位；海马神经细胞抗氧化酶系统（细胞SOD活性、CAT活性、GSH-Px活力）
和对细胞线粒体影响（细胞线粒体活性、线粒体MDA含量和NO含量）
参考文献：王莹．文冠果柄昔对神经细胞损伤的保护作用研究[D]．辽宁：沈阳药科大学，
2009．
参考文献：祁小倩．虾青素对丙烯酰胺所致海马神经细胞损伤的保护作用研究[D]．黑龙江：
哈尔滨商业大学，2013．
七、大鼠大脑皮层神经细胞模型，
1. 细胞损伤模型的建立
缺糖缺氧损伤；复糖复氧损伤；
2. 检测指标
1） 损伤模型建立的判定指标
MTT细胞活力测定；倒置显微镜观察细胞形态
2）保护作用的判定指标及方法
神经细胞活性及存活率（MTT和酶标仪）；乳糖脱氢酶（LDH）漏出率（细胞破碎仪和试剂
盒）；线粒体膜电位（MMP）的测定（Rhodaminel23染料,，300目尼龙网和流式细胞仪）；
细胞内钙离子浓度的测定（Fluo一3/AM染料和流式细胞仪）；细胞培养液中谷氨酸含量的
测定；倒置显微镜观察细胞形态；细胞HE染色；神经细胞超微结构；细胞内活性氧（ROS)
水平的检测；电子自旋共振技术检测细胞内ROS；神经细胞内锰型超氧化物歧化酶(Mn-SOD)
活性的测定；过氧化氢酶(CAT)活性的测定；谷胧甘肚过氧化物酶(GSH一PX)活性测定；考
马斯亮兰法测定细胞匀浆的蛋白含量；Bcl-2/Bax免疫组化显色；蛋白质免疫印迹法检测线
粒体细胞色素C的释放；Hoeehst33342荧光染色观察细胞核形态。
参考文献：汪芸．缺糖缺氧/复糖复氧对神经细胞损伤及丹酚酸B干预作用机制的研究[D]．北
京：北京中医药大学，2009．