染色体畸变实验
食管鳞癌染色体及基因组DNA 畸变研究进展
食管鳞癌染色体及基因组DNA 畸变研究进展蒋焱熠;王明荣【摘要】Esophageal squamous cell carcinoma (ESCC) is one of the most common malignancies with poor prognosis in China. Patients with ESCC may present with vague symptoms in early stage and most of the cases are diagnosed at advanced stage, without the chance of optimal therapy. In the development and progression of ESCC, cytogenetic and molecular aberrations are frequently observed. This review is to summarize the advances in the chromosomal and genomic alterations of ESCC reported recently.%食管鳞癌是我国常见的消化道恶性肿瘤,进展快且预后差.由于早期一般无明显症状,临床确诊的食管鳞癌大多已发展到了中晚期,治愈难度较大.越来越多的证据表明,在食管鳞癌发生发展过程中,染色体及基因组DNA 畸变均是最常见的遗传学改变.文章就食管鳞癌染色体及基因组水平异常的研究进展作一综述.【期刊名称】《遗传》【年(卷),期】2012(034)005【总页数】7页(P519-525)【关键词】食管鳞癌;染色体;基因组DNA;畸变【作者】蒋焱熠;王明荣【作者单位】中国医学科学院北京协和医学院肿瘤医院肿瘤研究所,分子肿瘤学国家重点实验室,北京100021;中国医学科学院北京协和医学院肿瘤医院肿瘤研究所,分子肿瘤学国家重点实验室,北京100021【正文语种】中文食管癌是威胁人类健康的十大恶性肿瘤之一,我国食管癌绝大多数为鳞状细胞癌(简称鳞癌)。
实验四人类染色体的识别与核型分析 (1)
实验四人类染色体的识别与核型分析一、实验目的1.学习染色体核型的分析方法；2.了解人类染色体的特征。
二、实验原理1．染色体组型(核型)是指生物体细胞所有可测定的染色体表型特征的总称。
包括：染色体的总数，染色体组的数目，组内染色体基数，每条染色体的形态、长度、着丝粒的位置，随体或次缢痕等。
染色体组型是物种特有的染色体信息之一，具有很高的稳定性和再现性。
组型分析能进行染色体分组外，还能对染色体的各种特征做出定量和定性的描述，是研究染色体的基本手段之一。
利用这一方法可以鉴别染色体结构变异、染色体数目变异，同时也是研究物种的起源、遗传与进化，细胞遗传学，现代分类学的重要手段。
2．人类的单倍体染色体组(n=23)上约有30000-40000个结构基因。
平均每条染色体上有上千个基因。
各染色体上的基因都有严格的排列顺序，各基因间的毗邻关系也是较为恒定的。
人类的24种染色体形成了24个基因连锁群，所以，染色体上发生任何数目异常、甚至是微小的结构变异，都必将导致许多获某些基因的增加或减少，从而产生临床效应。
染色体异常常表现为具有多种畸形的综合征，称为染色体综合征，其症状表现为多发畸形、智力低下和生长发育异常，此外还可看到一些特征性皮肤纹理改变。
染色体畸变还将导致胎儿死产或流产。
染色体病已成为临床上较常见的危害较为严重的病种之一，染色体病的检查、诊断已经成为临床实验室检查的重要内容。
1960年，在美国Denver市召开了第一届国际遗传学会议，讨论并确定正常人核型(karyotype)的基本特点即Denver体制，并成为识别人类各种染色体病的基础。
按照Denver体制，将待测细胞的染色体进行分析和确定是否正常，以及异常特点即为核型分析。
人类染色体分组及形态特征见表1。
表1 人类染色体分组及形态特征（非显带标本）组别染色体序号形态大小着丝粒位置次缢痕随体I号染色体常见A 1-3 最大M(1、3）SM（2）B 4-5 次大SM中等SM 9号染色体常见C 6-12,X（介于7-8之间）D 13-15 中等ST 有E 16-18 小M（16）16号染色体常见SMF 19-20 次小MG 21-22,Y 最小ST 有（22、21）A组：1-3号，可以区分。
遗传实验报告3_巴氏小体
性染色质：人体X染色质观察实验日期：2013年3月28日一、实验目的通过实验掌握鉴定人类X染色质的方法，在显微镜下正确识别Barr小体的特征及其所在的位置。
了解X染色体失活的有关理论假说以及失活染色体上的基因所控制的遗传性状的特点。
二、实验原理Barr等人在1949年首先发现在雌性猫的神经细胞核内有一个浓缩的深染小体，但是在雄性猫中几乎检测不到。
以后通过研究发现，在有袋类、偶蹄类、翼手类、食肉类和灵长类动物的多种组织的细胞中都存在这种二态性特点。
雌性个体的细胞中2条X染色体中，有一条在间期是处在不活动的异固缩状态，从而形成了X染色质又称Barr小体。
这种情况在哺乳类动物的雌性个体都存在，即雌性哺乳类动物细胞内的X染色体在间期内仅有一条呈松散状态，参加细胞生理活动，另一条则保持异固缩状态。
Barr小体出现在哺乳动物雌性个体细胞的细胞核边缘，这主要是因为这条染色体处在失活状态所致。
Morishima等利用放射性标记的方法证实了失活状态的性染色体与其他异染色质一样，在DNA复制时总落后于其他常染色质，且大多出现在核膜边缘。
性染色体在人类中，正常男性个体不可能出现Barr小体，正常女性的细胞只可能出现一个Barr小体。
对于具有性染色体畸变的个体来说，Barr小体出现的数目等于细胞内X染色体的数目减1。
表1为性染色体组成与X小体数目的关系。
表1 性染色体组成与X小体数目的关系XO 女0XX 女 1XXY 男 1XXX 女 2XXXX 女 3剂量补偿效应是指XY型性别决定的生物，由X性染色体上的基因决定的性状在两性的表现几乎相同。
也就是说X染色体上的基因的表达产物在雌雄细胞中是等量的。
这种剂量补偿效应可以通过两种途径实现：一是X染色体的转录速率的差异，即雌性细胞中的两条X 染色体的转录速率低于雄性细胞中单条X染色体的转录速率，因而造成雌性和雄性细胞的总体表达水平接近；二是雌性细胞中有一条X染色体在功能上是失活的。
致突变作用实验方法
v 5. 标本制作时间: 分别在药物与细胞接触后 24和48小时收获细胞制作标本，代谢活化组在 24小时收获细胞制作标本。 v 6. 对照: 设空白对照、溶剂对照、阳性对照 和S9对照。 v 7. 镜检: 每种浓度至少观察100个中期分裂相 细胞的染色体结构，在油镜下分别记录结构畸 变及多倍体的出现率。
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七. SOS显色试验(SOS chromotest)
由法国巴斯德研究所 Quillardet 等于1982 年首先提出的一种遗传毒性检测方法, 通过直 接监测细胞 DNA 受损后的 SOS 修复反应来检 测化合物的生物遗传毒性。 DNA 分子在受到 外因引起大范围损伤、其复制又受到抑制的 情 况 下 ， 会 导 致 一 种 容 易 发 生 错 误 的 修 复。 所有这些在遗传毒物处理后大肠杆菌中出现 的一系列反应统称为SOS应答。
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v 早期死亡的胚胎逐步吸收，既看不到胎鼠外 观，也分不清胚胎和胎盘，仅在子宫内膜上 隆起如一小瘤，故有人称它为胎膜瘤；如已 完全被吸收，则可称为吸收点，即为最早的 早期死胎。 （3）晚期死亡胚胎：胚胎完整成形，并有明 显胎盘，但色泽灰暗，无光泽，无自然运动， 机械刺激后亦无运动反应。
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v 结果观察: 以给药组雄鼠为单位，交配后 1~8周分别统计下列指标。 （1）平均受孕数（％）＝受孕母鼠总数/同 笼母鼠总数×100％ （2）平均着床数＝总着床数（早死、迟死、 活胎数）/ 受孕母鼠总数 （3）平均活胎数＝活胎总数/受孕母鼠总数 （4）平均死胎数＝死胎总数/受孕母鼠总数
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v 结果判定
（1）受试物所诱发的染色体畸变数的增加与剂量相 关，CHL系统判定如下： 畸变率<5％ 阴性（－） 畸变率>5％ 可疑（±） 畸变率>10％ 阳性（＋） 畸变率>20％ 阳性（＋＋） 畸变率>50％ 阳性（＋＋＋） （2）某一测试点呈现可重复的并有统计学意义地增 加：符合上述一条即可判为阳性。
什么是染色体畸变综合征
什么是染色体畸变综合征染色体畸变综合征染色体病(chromosomal disease)或染色体畸变综合征(chromosome aberration syndrome )是一大类严重的遗传病，通常伴有发育畸形和智力低下，同时也是导致流产与不育的重要原因。
一般估计染色体畸变见于0.5%-0.7%的活产婴儿，7.5%的胎儿，自发流产儿约1/2有染色体异常。
现今已知的染色体病超过100种，已报告的染色体数目和结构异常在500种以上。
随着高分辩显带及其它细胞遗传学新技术的应用，今后还会发现更多的染色体病和异常。
一、染色体畸变综合征的概念。
染色体畸变综合征是指由于染色体异常而引起的疾病。
由于它有多种临床表现，故称为综合征。
通常如果没有染色体物质明显增多或减少。
如一些染色体重排(平衡易位、倒位)就不一定引起表型异常。
染色体的多态或异态性(polymorphism或heteromorphism)通常不伴有异常表型，故不称为染色体畸变综合征。
二、染色体异常发生的频率综合许多国家的资料，大约有15%的妊娠发生流产，而其中一半为染色体异常所致，即约为5%-8%的胚胎有染色体异常。
不过在出生前，90%以上已有自然流产或死产。
流产愈早，有染色体异常的频率愈高。
新生儿染色体异常调查结果见表2-3。
不同地区染色体异常发生的频度相关不大，波动于0.47-0.84%之间，用表2-3中的发病率对我国新生儿中染色体异常发病率作了外推估算(表2-4)。
普通成人染色体调查的资料很少。
1986-1987年，我国四川省曾进行过大规模的遗传病流行病学抽样调查，其染色体病患者的患病率如表2-5。
全屏显示表格病名患病率21-三体性 0.14其它常染色体病 0.02先天性卵巢发育不全 0.07先天性睾丸发育不全 0.07其它染色体异常 0.015总计 0.315*先天性睾丸发育不全，可能因为筛查困难而数值偏低三、常染色体异常综合证(一)三体综合征1.先天愚型先天愚型是最重要的染色体疾病。
染色体分析相关的实验
染色体分析相关的实验第三章染色体分析相关的实验目前染色体的研究几乎深入到每个学科的每一个领域，因为染色体是把细胞与分子联系起来的重要桥梁，故在遗传学研究中或者在医学研究中被广泛重视及应用。
近几年相继出现了脆性位点、热点、重排与癌基因激活及抑癌基因丢失，癌基因定位、抑癌基因定位及杂合位点缺失等与染色体相关的理论；另一方面与染色体畸变有关的各类遗传病的研究也使临床上染色体的分析上了一个新的台阶。
染色体分析相对较简单，细胞通常采用循环血中的淋巴细胞，胎儿采用羊膜液中的羊膜细胞或胎盘绒毛膜细胞。
细胞经过培养，再用植物凝集素（PHA）刺激细胞分化。
当每个染色体都复制成两个染色体单体时，随后加入秋水仙素，在分裂中期阻止细胞有丝分裂。
位于载玻片上的细胞随后被染色，在显微镜下拍照或用计算机进行图像分析。
根据染色体形态大小,剪下照片上的染色体，按序分类排贴在纸上,进行核型分析。
染色体显带通常通过G显带或Q（荧光）显带染色技术进行，增加其他染色方法可提高细胞遗传学诊断的准确性。
新的分子生物学技术使用DNA探针(含有荧光标记)来定位染色体上特定基因和DNA序列，荧光素标记的原位杂交技术可用于鉴别基因结构和寻找染色体缺失，重排及复制。
实验3-1 人类染色体标本的制备一、实验目的掌握人类外周血细胞培养方法及染色体标本的制备方法。
观察人类染色体的形态和数目。
二、实验原理血液中的T淋巴细胞在体外培养中经一定剂量的植物血凝素（PHA）刺激，可以返幼进行细胞分裂，用秋水仙素积累分裂相，用0.075 mol/L-1KCI进行低渗后，经固定、染色，可见到分散的染色体。
三、实验准备超净工作台、酒精灯、无菌注射器（1ml、2ml、5m1）、针头、培养瓶、橡皮塞、75％酒精棉球、离心机、定时钟、试管架、量筒、刻度离心管、冰凉玻片，毛细滴管、恒温水浴锅、RPMI1640、小牛血清、肝素、秋水仙素、植物血凝素（PHA）、固定液（甲醇：冰乙酸为3∶1，现用现配）、0.075mol。
遗传学实验
实验一细胞减数分裂观察实验原理减数分裂是有性繁殖生物形成配子时的一种特殊的细胞分裂方式，减数分裂和受精作用成为多细胞生物世代间传递的中间环节，这种分裂方式保证了生物在世代传递过程中体细胞染色体数目的恒定不变，即都含有两个基本染色体组（二倍体生物），又可以实现物种内个体间遗传上的多样性。
减数分裂包括两次细胞分裂阶段，第一次是细胞染色体数目减半的分裂，第二次分裂是细胞染色体数目等数的分裂。
３．试剂：卡诺氏固定液（乙醇: 冰乙酸= 3 : 1）；醋酸洋红染色液（45%乙酸100mL+洋红1g 加热煮沸不超过30秒，冷却，加一枚生锈的铁钉，静置片刻过滤）。
1. 玉米花药压片（2n = 20）⑴取材：玉米抽穗前的大喇叭口期，取出花序分枝备用；⑵固定：雄花序在卡诺氏固定液中固定12～24小时后，可用于制片。
⑶染色和压片；取一枚花蕾，去除颖片，取出花药，置于干净的载玻片上，吸去多余的固定液，滴加一滴醋酸洋红染色液，用解剖针将花药切断成碎段并压出花粉母细胞。
静置15～20分钟。
加盖玻片，再在上面覆盖吸水纸，用大拇指压片（切勿使盖玻片滑动），也可以用解剖针柄轻敲盖玻片以使细胞和染色体分开。
⑷镜检：低倍镜下寻找花粉母细胞，再用高倍镜观察减数分裂各个时期染色体的形态和运动特征。
蝗虫精巢压片（2n = 24）⑴取材并固定：从野外捕获的雄性蝗虫经卡诺氏固定液固定，即可用于制作减数分裂标本片。
⑵剖解精巢：实验前将蝗虫置于培养皿中，剖取蝗虫的精巢。
剔除精巢周围的其他组织后，就可以进行染色处理。
⑶染色和压片；挑取一小段精巢置于干净的载玻片上，滴加一滴醋酸洋红染色液，用解剖针反复将精巢切断成碎段（尽可能碎），挑出肉眼可见的组织碎块，静置15～20分钟。
再加盖玻片并在上面覆盖吸水纸，用大拇指压片（切勿使盖玻片滑动），也可以用铅笔头等轻敲盖玻片以使细胞和染色体分开。
⑷镜检：低倍镜下寻找具有清晰分裂相的细胞，再用高倍镜观察减数分裂各个时期染色体的形态和运动特征。
染色体畸变的遗传学效应
染色体畸变的遗传学效应
染色体畸变是指发生在染色体层级的结构性异常。
它可能涉及染色体的自由端或起始/终止点的变化，以及其整体编码和组成的变化。
染色体畸变是一种不可逆
的学习障碍，其表现为原始染色体结构的任何变化，包括染色体组分数量中的增减和结构形态的变化，比如染色体的螺旋，支状枝和圆柱形。
这种畸变往往伴随着基因突变（包括缺陷蛋白质的氨基酸序列的变异），如果没有管理好，这种基因变异可能会损害正常蛋白质运作而导致器官组织异常以及严重缺陷。
因此，染色体畸变具有潜在的遗传学效应。
它可以作为研究同作者口中的“易
质性遗传病”有关因素的实验方法，从而发现染色体畸变可能是导致相关疾病发病
的主要致病原因，以及在肿瘤学领域会改变染色体结构和影响基因表达的相关情况。
此外，染色体畸变也可能引起行为异常和智力损害。
研究发现，有染色体畸变的患者（一般是婴儿或小孩）的表现往往偏离正常：对新环境的适应能力较差、注意力不易集中、情绪不稳定。
这些畸变也会对儿童的教育和发展产生长期影响，从而影响他们未来的成长道路。
因此，染色体畸变不仅影响遗传学而且具有较强的社会效应。
它不仅会限制我们对疾病发生机制的理解，而且可能影响一个人未来生活方式、职业规划以及身心发展。
研究人员应严格认真地开展研究，以深入揭示染色体畸变的遗传学效应，以期及早研制出有效的诊疗系统，减少婴幼儿因此而受到的损害。
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实验十 染色体畸变试验
可用末梢血淋巴细胞，或人和哺乳动物体细胞系作为材料，常用的体细胞系有中国地鼠
卵巢细胞（CHO），中国地鼠肺成纤维细胞（V79和CHL），人胚肺2倍体成纤维细胞等。这
里介绍外周血淋巴细胞为对象的染色体畸变的试验方法。
1．实验原理
外周血中小淋巴细胞几乎都处在细胞增殖周期的G1期或G0期（不同于体外培养的体细
胞），一般条件下是不会再分裂的。当在培养物中加入适量的PHA，在37℃下，经52～72h
的培养，淋巴细胞开始转化，进入细胞增殖周期，此时可获得大量的有丝分裂的细胞。再经
过秋水仙素处理，低渗、固定，即可在显微镜下观察到良好的中期染色体分裂相。电离辐射，
化学有害物质作用于机体或体外细胞，均可引起细胞染色体的损伤，且与剂量（浓度）呈良
好的线性关系。因此，染色体畸变已用于电力辐射事故的生物计量估算。
2．方法与步骤
（1）试剂
①RPMI-1640培养液，含20%小牛血清。
②肝素：每支含肝素12500U，使用时用生理盐水配成500U/ml，4℃冰箱内保存备用。
③秋水仙素：配成40ug/ml浓度。称取秋水仙素4mg，溶解于100ml 0.85%Nacl 溶液中，
经6号细菌漏斗过滤，4℃冰箱内保存。使用时吸取0.05或0.1ml加入到5ml细胞培养物中，
其终浓度为0.4～0.8ug/ml。
④双抗：青霉素100U/ml，链霉素100ug/ml。
⑤PHA:PHA为冰干注射剂（广州生产）每支10mg，使用时用2ml生理盐水溶解。
⑥KCl低渗液：KCl 1.88g，双蒸水1000ml使之溶解，其浓度为0.025M.
⑦冰醋酸甲醇固定液：冰醋酸1份，甲醇3份，混合而成。
（2）细胞培养
常规细胞培养。
（3）受试物的处理
实验分组：至少设立五个组，即阳性对照、阴性（溶剂）对照及三个剂量组。最高剂量
和最低剂量之间相差10倍，中间再设一个剂量，阳性对照物为已知的染色体断裂剂，如丝
裂霉素C(MMC)，剂量为0.02μg/ml；黄曲霉素毒素B1，浓度为10-6M等。每组中应设2～3
个平行样品。
（4）操作步骤
①收集细胞：经受试验处理的细胞，培养开始后52～72h收集细胞。依不同受试物而有
所差异。
②加入秋水仙素：培养终止前于培养物中加入40μg/ml秋水仙素0.05-0.1ml，终浓度
为0.4～0.8μg/ml，37℃下培养4h。
③低渗处理：小心取出细胞培养物，弃去上清液，细胞沉淀在瓶底（体细胞须经胰酶消
化），加入8ml KCl低渗液，用滴管轻轻吹打制成细胞悬液，移入10ml刻度离心管中，37℃
下处理20min。
④离心：1000转/min，离心7～10min，弃去上清液，收集细胞，加入Hanks液。
⑤固定：加入1：3冰醋酸甲醇固定液3ml预固定，用滴管轻轻吹打，立即离心，收集
细胞，再加入10ml上述固定液，处理15min，反复操作两次，每次15min。
⑥制片：弃去固定液，再加入适量新鲜固定液，混匀。取出预冷的载玻片，每片滴加1～
2滴细胞悬液，用嘴轻轻吹散，或用滴管吸取少许细胞悬液，在40～50㎝高度上对准下面
玻片滴加悬液，以冲力使细胞分散。自然干燥或用微热电吹风机吹干，也可在酒精灯火焰上
略加烘烤。此时可在显微镜下检查有无分裂相细胞。
⑦染色：用Giemsa 染液染色15min，用自来水轻轻冲洗残留染液，待干。
⑧镜检：先在低倍镜下寻找分散良好的分裂相细胞，然后用高倍镜或目镜观察，进行染
色体畸变计数，分析，分别记录染色体畸变细胞数及各种类型染色体畸变细胞数，选择良好
的典型的染色体畸变图进行显微照相。
（5）结果表示
①染色体总畸变率及畸变率：
总畸变率（%）=各种畸变类型数/分析总细胞数×100
畸变率（%）=染色体畸变数/染色体总数×100
②畸变类型分析：包括断片（F）、双着丝粒（D）、环（R）、互换（E）等，电力辐射常
见断片、双着丝粒、环等，而化学毒物常见单体断裂。
（6）注意事项
①接种的血样要新鲜，如不立即培养，应放在4～25℃温度下，于24h内作培养。
②培养箱温度以37±5℃为宜。
③培养过程中如发现血样凝集，可将培养瓶轻轻震荡，使凝块散开，然后继续培养。
④如低渗处理不当，染色体聚集一团，可将固定时间延长数小时或过夜，热低渗过度，
往往细胞全部破碎，造成染色体丢失。
⑤离心速度过快，细胞团不易打散，速度过低，则使分裂相细胞大量丢失。
⑥玻片要严格清洁，使细胞均匀铺开。
人类染色体图谱