肠出血性大肠埃希氏菌的多重PCR检测方法

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大肠埃希氏菌重点

03
大肠埃希氏菌的检测与鉴定
分离培养
分离培养是大肠埃希氏菌检测的第一步，通过选择性培养基分离出大肠埃希氏菌，以便后续的鉴定。常用的选择性培养基有麦康凯琼脂、伊红美蓝琼脂等。
分离培养过程中，需要注意培养温度和培养时间，通常在37℃下培养18-24小时。
分离培养的目的是将大肠埃希氏菌从其他杂菌中分离出来，提高鉴定的准确性。
维持水电解质平衡
预防并发症
及时发现并处理可能出现的并发症，如心脏疾病、肝病等。
在治疗过程中，注意补充因腹泻等导致的水和电解质流失。
控制传播途径
隔离患者
对患者进行隔离，以防止疾病传播。
消毒
对接触过病菌的物品和环境进行消毒。
健康教育
提高公众对大肠埃希氏菌的认识，了解防治方法。
05
大肠埃希氏菌的生物安全
对食品进行彻底烹煮，以杀死大肠埃希氏菌。
环境安全
对可能存在大肠埃希氏菌的环境进行定期清洁和消毒。
在处理可能存在大肠埃希氏菌的污水和垃圾时，应采取适当的防
护措施。
在接触可能存在大肠埃希氏菌的环境后，应立即进行手部清洁和
消毒。
THANKS
THANK YOU FOR YOUR WATCHING
实验室生物安全
实验室应建立严格的微生物操作规程，确保实验人员熟悉并遵循。
实验室内应保持清洁卫生，定期进行消毒处理，防止细菌的传播。
实验室内应配备适当的个人防护装备，如实验服、口罩、手套等。
食品安全
在食品加工过程中，应严格控制卫生条件，避免食品受到大肠埃希氏菌的污染。
食品储存和运输过程中应保持适当的温度，避免食品变质和细菌繁殖。
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建立检测血液中EC、KP、SA和MRSA的多重PCR方法

作者简介:吴许文,男,技师,主要从事临床微生物分析及检测方法研究.㊀ә㊀通信作者,E Ｇm a i l :a l v i n _n g ＠１６３．c o m .本文引用格式:吴许文,温旺荣,李沛樟,等．建立检测血液中E C ㊁K P ㊁S A 和M R S A 的多重P C R 方法[J ]．国际检验医学杂志,２０１９,４０(１):１９Ｇ２４．论著基础研究建立检测血液中E C ㊁K P ㊁S A 和M R S A 的多重P C R 方法吴许文１,２,温旺荣１ә,李沛樟２,倪金良２,简仕铭２(１．暨南大学附属第一医院检验科,广东广州５１０１６３;２．镜湖医院检验科,澳门９９９０７８)㊀㊀摘㊀要:目的㊀建立快速检测血液中常见致病菌包括大肠埃希菌(E C )㊁肺炎克雷伯菌(K P )㊁金黄色葡萄球菌(S A )及耐甲氧西林S A (M R S A )的多重聚合酶链反应(P C R )方法,有利于败血症的及时治疗.方法㊀建立多重P C R 方法对E C p h o A 基因㊁K Pm d h 基因㊁S Af e m A 基因和M R S A m e c A 基因进行检测,并将１６S r D N A 作为致病菌感染对照.结果㊀采用建立的多重P C R 方法进行检测的特异性为１００％,E C 检测限为２．７５ˑ１０２C F U /m L ,K P 为２．４３ˑ１０３C F U /m L ,S A 为３．１３ˑ１０２C F U /m L ,M R S A 为３．０３ˑ１０２C F U /m L ;用多重P C R 方法和传统血培养方法对３００个血标本进行检测,传统血培养方法检测出１８７个血标本内阳性,多重P C R 方法有４个血标本为假阴性,未能被检出.结论㊀建立的多重P C R 方法可简便㊁及时地检测血流感染中的E C ㊁K P ㊁S A 和M R S A .关键词:聚合酶链反应;㊀脓毒症;㊀大肠杆菌;㊀克雷伯菌,肺炎;㊀葡萄球菌,金黄色;㊀甲氧西林抗药性D O I :１０．３９６９/j．i s s n ．１６７３Ｇ４１３０．２０１９．０１．００６中图法分类号:R ４４６．６１;R ３７８文章编号:１６７３Ｇ４１３０(２０１９)０１Ｇ００１９Ｇ０７文献标识码:AD e v e l o p m e n t o f am u l t i p l e xP C R m e t h o d f o r t h e r a pi dd e t e c t i o no fE s c h e r i c h i a c o l i ,K l e b s i e l l a p n e u m o n i a e ,S t a p h y l o c o c c u s a u r e u s a n dm e t h i c i l l i n Ｇr e s i s t a n t S t a p h yl o c o c c u s a u r e u s WU X u w e n １,２,WE N W a n g r o n g １ә,L IP e i z h a n g ２,N I J i n l i a n g ２,J I A NS h i m i n g ２(１．D e p a r t m e n t o f C l i n i c a lL a b o r a t o r y ,T h e F i r s tA f f i l i a t e d H o s p i t a l o f Ji n a n U n i v e r s i t y ,G u a n g z h o u ,G u a n g d o n g ５１０１６３,C h i n a ;２．D e p a r t m e n t o f C l i n i c a lL a b o r a t o r y ,K i a n g W uH o s pi t a l ,M a c a u ９９９０７８,C h i n a )A b s t r a c t :O b je c t i v e ㊀S e p t i c e m i a i s c a u s e db y av a r i e t y of p a t h og e n i cb a c t e r i a ,i n c l u d i n g E s ch e ri c h i ac o l i ,K l e b s i e l l a p n e u m o n i a e a n dS t a p h y l o c o c c u s a u r e u s (e s p e c i a l l y fo rm e t h i c i l l i n Ｇr e s i s t a n t S ．a u r e u s ,M R S A ),t h u s t o e s t a b l i s ham u l t i p l e xP C R m e t h o d f o r t h e r a p i dd e t e c t i o no f c o m m o n p a t h o ge n i c b a c t e r i a i n t h eb l o o d ,i s i nf a v o r o f t h e t i m e l y t r e a t m e n t o f s e p t i c e m i a ．M e t h o d s ㊀T h e t a rg e t g e n e so f thi sa s s a y we r e p h o Af o rE ．c o l i ,m d h f o rK．p n e u m o n i a e ,f e m Af o rS ．a u r e u s a n dm e c Af o rM R S A ,a n d１６Sr D N Aa s p a t h og e n i n f e c t i o nc o n Ｇt r o l ．R e s u l t s ㊀A p e r f e c t c o n c o r d a n c e (１００％)w a s o b s e r v e dwh e n t h e s p e ci f i c i t y wa s v a l i d a t e dw i t h２０s t r a i n sb e l o n g i n g t o １５s p ec i e s p a t h o g e n s c o n t a i n i n g t a r g e t s t r a i n s a n do t h e r c l i n i c a l p a t h o ge n s ．T h ed e t e c t i o n l i m i t s of t h em u l t i p l e xP C R m e t h o dw e r e２．７５ˑ１０２C F U /m Lf o rE ．c o l i ,２．４３ˑ１０３C F U /m Lf o rK．p n e u m o n i a e ,３．１３ˑ１０２C F U /m Lf o r S ．a u r e u s a n d３．０３ˑ１０２C F U /m Lf o rM R S A．M u l t i p l e xP C R m e t h o dw a s c o m pa r e d w i t h c o n v e n t i o n a lb l o o dc u l t u r em e t h od (B C M )b y a p r a c t i c a l s a m p le t e s t a s s a y w i t h ３００b l o o d s pe c i m e n s ．T h e m u l t i p l e xP C R m e t h o d p r o v i d e dn e a r l y c o n c o r d a n t r e s u l t sw i t hB C Me x c e p t af e wf a l s e Ｇn e ga t i v e r e s u l t s t h a t ４i n t o t a l １８７B C M Ｇp o s i t i v e s a m p l e s c o u l dn o tb ed e t e r m i n e db y P C R m e t h o d ．C o nc l u s i o n ㊀W e s u c c e s s f u l l y de Ｇv e l o p e d a s i m p l e ,t i m e l y m u l t i p l e xP C R m e t h o df o r d e t e c t i o n o f E ．c o l i ,K．p n e u m o n i a e ,S ．a u r e u s a n dM R S A i n b l o o d s t r e a mi n f e c t i o n ．K e y w o r d s :p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n ;㊀s e p s i s ;㊀E s c h e r i c h i ac o l i ;㊀K l e b s i e l l a p n e u m o n i a e ;㊀S t a p h y l o Ｇc o c c u s a u r e u s ;㊀m e t h i c i l l i n r e s i s t a n c e㊀㊀败血症是由致病菌引起血流感染的一种常见综合征,及时作出诊断是降低患者病死率的关键[１].主要是因消化道㊁呼吸道㊁伤口感染导致病原体进入血液循环所致[２Ｇ６].澳门镜湖医院检验科２０１０－２０１６年相关数据显示,近七年从血液中分离的主要致病菌有大肠埃希菌(E C )４０．１８％,金黄色葡萄球菌(S A )１１．８７％和肺炎克雷伯菌(K P )９．４８％,其中因滥用抗菌药物而产生的耐甲氧西林S A (M R S A )占S A 的９１国际检验医学杂志２０１９年１月第４０卷第１期㊀I n t J L a bM e d ,J a n u a r y ２０１９,V o l ．４０,N o ．１５３．１８％.致病菌在血液循环内会产生各类毒素,引起寒战㊁发热㊁休克,甚至死亡.为防止更严重的后果,及时㊁准确地诊断败血症至关重要.目前,血液细菌培养是诊断败血症的主要方法,但培养和鉴定需５~７d 才能得到结果,耗时过长影响了其应用价值,未能达到快速㊁有效治疗的目的.聚合酶链反应(P C R)技术是一种简单㊁快速㊁经济的分子诊断方法[７].通过核酸提取㊁P C R扩增和分析,一般可在数小时内得到结果,具有很大的潜在应用前景.本研究希望通过建立多重P C R方法,对E C㊁K P㊁S A和M R S A同时进行检测,并将１６Sr D N A作为阳性感染对照组,从而提高准确性㊁降低成本和缩短时间,达到一次性检出血液中的主要致病菌的目的.１㊀材料及方法１．１㊀菌株来源㊀本研究所采用菌株包括E C㊁K P㊁S A㊁M R S A㊁表皮葡萄球菌(S E)㊁路邓葡萄球菌(S L)㊁鲍曼不动杆菌(A B)㊁铜绿假单胞菌(P A)㊁普通变形杆菌(P V)㊁粪肠球菌(E F)㊁无乳链球菌(S A g)㊁创伤弧菌(V V)㊁停乳链球菌(S D y)㊁缓症链球菌(S M i)和头状葡萄球菌(S C)均为澳门镜湖医院临床分离菌株.购自美国菌种保藏中心(A T C C)的其他菌株包括E C (A T C C２５９２２)㊁K P(A T C C７００６０３)㊁S A(A T C C ２９２１３)㊁M R S A(A T C C３３５９１)和S E(A T C C１２２２８).１．２㊀培养基与试剂㊀M u e l l e rＧH i n t o n(MＧH)平板㊁血平板均购自法国生物梅里埃公司,肉汤L B培养基为自配,B A C T E C T M培养瓶购自美国B D公司.２ˑM u l t i p l e x P C R K i t购自Q I A G E N公司,D L２０００D N A标志物㊁L y s i sB u f f e r f o rM i c r o o r g a n i s mt oD iＧr e c tP C R K i t均购自T a K a R a公司,D u R e d核酸染料购自泛博生化公司.其他化学试剂均为分析纯.１．３㊀方法１．３．１㊀引物设计㊀参照文献[８Ｇ９]设计引物,包括细菌１６S r D N A基因㊁E C p h o A基因㊁K Pm d h基因㊁S A f e m A基因和M R S A m e c A基因.引物由深圳华大基因有限公司合成.引物序列和产物大小见表１.表１㊀㊀引物序列和产物大小细菌目的基因引物序列(５ᶄң３ᶄ)产物大小(b p)原核生物１６S r D N A１６SＧF５ᶄＧA G A G T T T G A T C C T G G C T G A GＧ３ᶄ１５００１６SＧR５ᶄＧG G T T A C C T T G T T A G G A C T TＧ３ᶄE C p h o A P h o AＧF５ᶄＧG T G A C A A A A G C C C G G A C A C C A T A A A T G C C TＧ３ᶄ９０３P h o AＧR５ᶄＧT A C A C T G T C A T T A C G T T G C G G A T T T G G C G TＧ３ᶄK P M d h M d hＧF５ᶄＧG C G T G G C G G T A G A T C T A A G T C A T AＧ３ᶄ３６４M d hＧR５ᶄＧT T C A G C T C C G C C A C A A A G G T AＧ３ᶄS A f e m A F e m AＧF５ᶄＧA A A A A A G C A C A T A A C A A G C GＧ３ᶄ１３２F e m AＧR５ᶄＧG A T A A A G A A G A A A C C A G C A GＧ３ᶄM R S A m e c A M e c AＧF５ᶄＧG T A G A A A T G A C T G A A C G T C C G A T A AＧ３ᶄ３１０M e c AＧR５ᶄＧC C A A T T C C A C A T T G T T T C G G T C T A AＧ３ᶄ１．３．２㊀细菌培养及基因组D N A提取㊀将分纯的标准菌株分别接种于L B肉汤,３７ħ培养过夜,取１００μL菌液１３０００ˑg离心１m i n,弃上清液后加入５０μLT a k a r aL y s i sB u f f e r f o rM i c r o o r g a n i s mt oD i r e c t P C R K i t,并按说明书操作提取D N A,直接用于P C R 反应.而血流感染的标本可置于血培养瓶３７ħ培养４h进行预增菌,然后取５００μL于离心管１３０００ˑg 离心１m i n,弃上清液后加入５０μL T a k a r a L y s i s B u f f e r f o rM i c r o o r g a n i s mt oD i r e c tP C R K i t,并按说明书操作提取D N A,直接用于P C R反应.１．３．３㊀单一基因P C R扩增㊀根据所设计的引物,在相同条件下以标准菌E C A T C C２５９２２㊁K P A T C C ７００６０３㊁S A A T C C２９２１３和M R S A A T C C３３５９１的D N A为模板,分别对其进行１６Sr D N A㊁E C p h o A㊁K Pm d h㊁S Af e m A和M R S A m e c A单一基因P C R扩增.P C R反应体系(２５μL):２ˑQ I A G E N M u l t i p l e x P C R M a s t e r M i x１２．５μL㊁０．１μm o l/L引物㊁模板(T e m p l a t e)１μL㊁双蒸馏水(d d H２O)至２５μL.经预试验获得的P C R反应程序为９５ħ预变性１５m i n,９４ħ变性３０s,５８ħ退火９０s,７２ħ延伸９０s,进行３５个循环,７２ħ延伸１０m i n,P C R产物于４ħ保存,１．５％琼脂糖凝胶电泳观察结果.１．３．４㊀多重P C R条件优化㊀为建立快速同时检测多个目标病原体的多重P C R方法,将所有引物加到同一个反应里面,P C R反应体系仍为２５μL,对E C A T C C２５９２２㊁K P A T C C７００６０３㊁S A A T C C２９２１３和M R S A A T C C３３５９１的D N A模板进行多重P C R扩增.优化反应条件及体系并进行正交试验,包括调整引物为０．０１~０．２０μm o l/L,以０．０２μm o l/L递增;根据设计的引物退火温度,以５６ħ为基础,以２ħ递加,直至６２ħ,时间９０s,进行３５个循环,７２ħ延伸１０m i n,P C R产物于４ħ保存,１．５％琼脂糖凝胶电泳０２国际检验医学杂志２０１９年１月第４０卷第１期㊀I n t J L a bM e d,J a n u a r y２０１９,V o l．４０,N o．１观察结果.１．３．５㊀多重P C R方法的特异性㊀采用T a k a r aL y s i s B u f f e r f o rM i c r o o r g a n i s mt oD i r e c tP C R K i t提取试验菌株基因组D N A,利用所建立的多重P C R方法进行扩增,验证本方法的特异性.１．３．６㊀多重P C R方法的灵敏度㊀测定E C A T C C ２５９２２㊁K PA T C C７００６０３㊁S A A T C C２９２１３和M R S A A T C C３３５９１的菌液浓度并进行１０倍梯度稀释,依次２．７５ˑ１０６至２．７５C F U/m L㊁２．４３ˑ１０６至２．４３C F U/m L㊁３．１３ˑ１０６至３．１３ˑC F U/m L和３．０３ˑ１０７至２４．３C F U/m L,各稀释度经裂解后取１μL基因组D N A,分别进行多重P C R扩增,以确定其检测限.１．３．７㊀验证试验㊀将建立的多重P C R方法与传统血培养方法对３００个血培养样本进行比较,验证本方法的可靠性.血培养方法为采集血液标本于B A CＧT E C T M全自动血培养系统配套培养瓶,放于B A C T E C９２４０血培养仪３７ħ培养直至仪器提示阳性后转种血平板过夜,后挑取单菌落到V i t e kＧ２C o mＧp a c t微生物鉴定分析仪进行药敏和鉴定试验,如仪器培养５d无提示阳性则视为阴性.１．３．８㊀预增菌试验㊀使用标准菌E CA T C C２５９２２配制为１个单位菌液[５]置于B A C T E C T M培养瓶,３７ħ培养１㊁２㊁３㊁４h进行预增菌,并按T a k a r aL y s i sB u f fＧe r f o rM i c r o o r g a n i s mt oD i r e c tP C R K i t说明书操作提取D N A,直接用于P C R反应.２㊀结㊀㊀果２．１㊀单一基因P C R检测结果㊀以E C A T C C２５９２２㊁K P A T C C７００６０３㊁S A A T C C２９２１３和M R S A A T C C３３５９１为模板,使用１６SＧF/１６SＧR引物经扩增后P C R产物在１５００b p有１６Sr D N A条带;使用P h o AＧF/P h o AＧR引物扩增E C A T C C２５９２２后P C R 产物为９０３b p;使用M d hＧF/M d hＧR引物扩增K P A T C C７００６０３３１０后P C R产物为３６４b p;使用M e c AＧF/M e c AＧR引物扩增M R S A A T C C３３５９１后P C R产物为３１０b p;使用F e m AＧF/F e m AＧR引物扩增S A A T C C２９２１３后P C R产物为１３２b p,所有目的扩增条带均清晰.在该反应体系下的P C R产物经琼脂糖凝胶电泳,结果见图１.单一基因片段大小与预期结果相符.２．２㊀多重P C R条件优化㊀在单一P C R反应体系扩增的基础上优化了多重P C R反应体系及条件,最佳反应体系(２５μL)为２ˑQ I A G E N M u l t i p l e x P C R M a s t e rM i x１２．５μL,引物终浓度:１６SＧF/１６SＧR为０．０６μm o l/L(０．１５μL)㊁P h o AＧF/P h o AＧR为０．０１μm o l/L(０．２５μL)㊁M d hＧF/M d hＧR为０．０２μm o l/L (０．５μL)㊁M e c AＧF/M e c AＧR为０．１μm o l/L(０．２５μL)和F e m AＧF/F e m AＧR为０．１２μm o l/L(０．３μL), T e m p l a t e１μL㊁d d H２O７．５μL.而在５６~６２ħ的退火温度实验试验中,６０ħ扩增效果较好,确定其为最终退火温度.反应条件为９５ħ预变性１５m i n后,按９４ħ３０s㊁６０ħ１．５m i n㊁７２ħ１．５m i n进行３５个循环,然后７２ħ延伸１０m i n,４ħ保存.E C A T C C ２５９２２的P C R产物于１５００㊁９０３b p有条带,K P A T C C７００６０３的P C R产物于１５００㊁３６４b p有条带, S A A T C C２９２１３的P C R产物于１５００㊁１３２b p有条带,M R S A A T C C３３５９１的P C R产物于１５００㊁３１０㊁１３２b p有条带.其多重P C R扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果见图２.㊀㊀注:M表示D N A M a r k e r D L２０００;N表示阴性对照;１为E C A T C C２５９２２;２为K PA T C C７００６０３;３为M R S A A T C C３３５９１;４为S A A T C C２９２１３;５为E CA T C C２５９２２;６为K P A T C C７００６０３;７为M R S A A T C C３３５９１;８为S A A T C C２９２１３图１㊀㊀E C㊁K P㊁M R S A㊁S A单一基因P C R电泳结果㊀㊀注:M表示D N A M a r k e rD L２０００;１为E C A T C C２５９２２;２为K P A T C C７００６０３;３为S A A T C C２９２１３;４为M R S A A T C C３３５９１;５为E C A T C C２５９２２㊁K P A T C C７００６０３㊁S A A T C C２９２１３和M R S A A T C C３３５９１图２㊀㊀E C㊁K P㊁S A㊁M R S A多重P C R电泳结果２．３㊀多重P C R的特异性㊀E C在１６Sr D N A和p h o A位置有阳性条带,K P在１６Sr D N A和m d h位置有阳性条带,S A在１６S r D N A和f e m A位置有阳性条带,M R S A在１６Sr D N A㊁m e c A和f e m A位置有阳性条带.其他菌株只有在１６Sr D N A位置出现阳性１２国际检验医学杂志２０１９年１月第４０卷第１期㊀I n t J L a bM e d,J a n u a r y２０１９,V o l．４０,N o．１条带.表明本研究所建立的多重P C R 方法具有高度特异性,没有发现假阳性和假阴性结果,特异度为１００％.见表２.表２㊀㊀多重P C R 的特异性菌株名称目的基因１６S r D N A P h o AM d h F e m A M e c A E CA T C C２５９２２＋＋－－－E C １＋＋－－－K PA T C C７００６０３＋－＋－－K P １＋－＋－－S A A T C C２９２１３＋－－＋－S A １＋－－＋－M R S A A T C C３３５９１＋－－＋＋M R S A R １＋－－＋＋S E A T C C１２２２８＋－－－－S ES E １＋－－－－S LS L １＋－－－－S C １＋－－－－A B １＋－－－－E F １＋－－－－P A １＋－－－－P V １＋－－－－S A g １＋－－－－S D y １＋－－－－S M i １＋－－－－V V １＋－－－－㊀㊀注:＋表示阳性;－表示阴性２．４㊀多重P C R 的灵敏度㊀E CA T C C２５９２２的p h o A基因检测限为２．７５ˑ１０２C F U /m L ,K P A T C C ７００６０３的m d h 基因检测限为２．４３ˑ１０３C F U /m L ,S A A T C C２９２１３的f e m A 基因检测限为３．１３ˑ１０２C F U /m L ,M R S A A T C C３３５９１的m e c A 基因检测限为３．０３ˑ１０２C F U /m L .而１６S rD N A 的检测限E CA T C C２５９２２为２７．５C F U /m L ㊁K P A T C C ７００６０３为２．４３ˑ１０２C F U/m L ㊁S A A T C C２９２１３为３．１３ˑ１０２C F U /m L 和M R S A A T C C３３５９１为３．０３ˑ１０３C F U /m L .见图３.２．５㊀验证试验㊀３００份血标本中传统血培养方法测定阳性标本１８７份,其中E C 为１１６份,K P 为２４份,S A (不包括M R S A )为４份,M R S A 为６份,其他血液致病菌感染为３７份.采用多重P C R 方法检出１６Sr D N A 阳性标本１８３份,在１６Sr D N A 阳性标本中ph o A 阳性１１４份,m d h 阳性２２份,f e m A 阳性１０份,m e c A 阳性６份,与传统血培养方法检测败血症感染比较,其准确率为９７．９％(１８３/１８７),虽然多重P C R 方法出现部分假阴性,但超过９５％血流感染可在约８h 检测到,是一种快速检测败血症的方法.见表３.㊀㊀注:A 表示多重P C R 对E C 和S A 的灵敏度.M 为D N A M a r k e rD L ２０００;１~７为E CA T C C ２５９２２,浓度依次为２．７５ˑ１０６㊁２．７５ˑ１０５㊁２．７５ˑ１０４㊁２．７５ˑ１０３㊁２．７５ˑ１０２㊁２７．５㊁２．７５C F U /m L ;８~１４为S A A T C C ２９２１３,浓度依次为３．１３ˑ１０６㊁３．１３ˑ１０５㊁３．１３ˑ１０４㊁３．１３ˑ１０３㊁３．１３ˑ１０２㊁３１．３㊁３．１３C F U /m L .B 表示多重P C R 对M R S A 和K P 的灵敏度.M 为D N A M a r k e r D L ２０００;１~７为M R S AA T C C ３３５９１,浓度依次为３．０３ˑ１０７㊁３．０３ˑ１０６㊁３．０３ˑ１０５㊁３．０３ˑ１０４㊁３．０３ˑ１０３㊁３．０３ˑ１０２㊁３０．３C F U /m L ;８~１４为K P A T C C ７００６０３,浓度依次为２．４３ˑ１０６㊁２．４３ˑ１０５㊁２．４３ˑ１０４㊁２．４３ˑ１０３㊁２．４３ˑ１０２㊁２４．３㊁２．４３C F U /m L图３㊀㊀多重P C R 的灵敏度表３㊀㊀多重P C R 方法与血培养方法检测结果比较(n )菌株名称血培养阳性多重P C R 阳性１６S r D N Ap h o A m d h f e m A m e c A 两种方法阳性E C１１６１１４１１４－－－１１４K P２４２２－２２－－２２S A (不包括M R S A )４４－－４－４M R S A６６－－６６６S E ７７－－－－７２２国际检验医学杂志２０１９年１月第４０卷第１期㊀I n t J L a bM e d ,J a n u a r y ２０１９,V o l ．４０,N o ．１续表３㊀㊀多重P C R 方法与血培养方法检测结果比较(n )菌株名称血培养阳性多重P C R 阳性１６S r D N Ap h o A m d h f e m A m e c A 两种方法阳性S L２２－－－－２A B６６－－－－６E F３３－－－－３P V ６６－－－－６P A４４－－－－４S A g ４４－－－－４V V ５５－－－－５合共１８７１８３１１４２２１０６１８３㊀㊀注:－表示阴性２．６㊀预增菌试验㊀１６S ＧF /１６S ＧR 引物扩增４h 的P C R 产物在１５００b p 有１６Sr D N A 清晰条带.见图４.㊀㊀注:M 表示D N A M a r k e r D L ２０００;１为１h ;２为２h ;３为３h ;４为４h图４㊀㊀预增菌试验２．７㊀多重P C R 方法和传统血培养方法检测时间比较㊀多重P C R 方法８．３h 可得到结果,而传统血培养方法则需等待血培养仪器提示阳性后再进行转种培养和生化鉴定等过程,总时间６０h 可得到阳性鉴定结果,培养阴性结果则需要５d 才可确定为阴性.见表４.表４㊀㊀多重P C R 方法和传统血培养方法检测时间比较检测步骤多重P C R 方法传统血培养方法阳性阴性预培养４h １２h ５d 培养及生化鉴定－４８h －核酸提取０．５h －－扩增及电泳３．８h －－总时间８．３h ６０h５d ㊀㊀注:－表示不需要该步骤３㊀讨㊀㊀论㊀㊀P C R 是简单㊁实用的分子生物学技术[７],通过将核酸变性㊁退火和扩增３个步骤对D N A 模板进行复制.该检测技术与常规培养分离细菌的方法比较,具有快速㊁经济等优点,在临床检验方面具有良好的应用前景,市场上已研发出许多用于检验临床致病菌的P C R 商品化试剂盒[１２Ｇ１３],如德国R o c h e 公司的L i gh t ＧC y c l e r S e pt i F a s tMG R A D E Ｇt e s t ㊁韩国S e e G e n e 公司的M a g i c p l e xS e ps i sR e a l Ｇt i m eP C R 等,均可检测败血症患者血液中的E C [２,１１]㊁K P [１２]㊁S A [１,８]㊁沙门菌和志贺菌等多种微生物,但其仪器㊁设备要求高,试剂成本昂贵.因此,希望透过建立一个可同时检测E C ㊁K P ㊁S A 和M R S A 的多重P C R 方法,缩短血流感染所需的检测时间,以达到尽快查找病因和诊治的目的,同时,通过自行研发以降低检测成本,减轻患者的医疗负担.引物是影响P C R 扩增成功的重要一环,因此,选取合适的基因或序列作为目的基因设计引物很重要,从相关文献可知,E C 的检测常会使用到b f p㊁e a e ㊁s t x ㊁A g gR ㊁E l t ㊁E s t 和i n v 目的基因来分类不同的E C 菌群[２,１１,１６],亦有研究表明,ph o A 基因可作为E C 通用的分子标记[８,１７].H A E G GMA N 等[１８]报道了K P 管家基因m d h编码苹果酸脱氢酶和g yr A 基因编码旋转酶亚单位A 用于评价该菌的遗传多样性,其后有学者使用m d h 作为目的基因对K P 进行了P C R 检测[８,１５].而对S A 的检测,常用n u c ,s o d A 和f e m A 作为种特异性目的基因设计引物[１,１４].随着临床抗菌药物的普及使用和滥用,S A 产生抗药性菌株渐多,其中产生的M R S A 除对甲氧西林耐药外,对氨基糖苷类㊁大环内酯类等常用抗生素均具有多重耐药性,可用P C R 方法检测S A的甲氧西林抗性m e c A 基因,以确定该S A 是否为M R S A [１０,１４].本研究选取了T H O N G 等[８]报道的p h o A ㊁m d h ㊁f e m A 和m e c A 为目的基因,建立了可同时检测血流感染中几种常见致病菌,包括E C ㊁K P ㊁S A 和M R S A的多重P C R 方法.另外,除上述目标菌外,在多重３２国际检验医学杂志２０１９年１月第４０卷第１期㊀I n t J L a bM e d ,J a n u a r y ２０１９,V o l ．４０,N o ．１P C R体系中同时加入了针对原核生物保守区１６S r DＧN A序列的引物８F/１４９２R[９],检测其他细菌引起的败血症,对E C㊁K P㊁S A和M R S A以外的细菌感染作出阳性提示,以避免漏检.血液具有各种复杂的成分,选取合适的D N A提取方法对血流感染标本进行D N A提取是P C R检测成功与否的另一影响因素.B A N A D A等[１]用白细胞㊁血浆和全血标本检测S A引起的败血症,结果发现,对不同组分的血液标本中细菌D N A提取的结果具有差异,其中全血标本检测阳性率最高.因此,本研究亦选择了用全血标本对血流感染中的细菌D N A进行收集提取;另外,细菌因其种类不同,提取方法的差异也会影响获得细菌D N A的量,本研究选取日本T a k a r a公司的L y s i s B u f f e r f o rM i c r o o r g a n i s mt oD i r e c tPC R K i t对血中各类细菌进行D N A提取,获得了足够P C R试验的D N A量.而根据不同程度的血流感染,其体内的细菌数量会有差异,低程度的感染其血液中的细菌浓度较低而未能被提取足够的D N A量,从而影响P C R的检测结果显示为假阴性.在验证实验方面,沈恺妮等[１９]建议,根据一系列临床及血液学指标变化以提高血培养阳性率.本研究选取了符合的血流感染样本进行试验,包括发热㊁心率加快㊁呼吸急促㊁白细胞升高㊁炎症指标上升等,以便两种方法的比较.E C在１１６份血流感染标本中有２份㊁K P在２４份血流感染标本中有２份未能被P C R方法检出,显示为假阴性结果,据文献报道,一般血流感染的成年人血液中的细菌＜１~１０CF U/m L[５],所以,笔者认为,假阴性结果与标本中细菌浓度较低有关,在采集患者标本后先进行预培养以提高细菌浓度,再进行P C R检测有利于降低假阴性发生率.本研究结果显示,９５％以上传统血培养方法阳性的标本与建立的多重P C R方法比较,可获得一致的结果,对血标本先进行４h的预培养可获得P C R方法需要的检测量,而延长预培养时间亦有利于提高准确率.４㊀结㊀㊀论㊀㊀本研究研发了一种可诊断败血症的多重P C R方法,可同时对E C㊁K P㊁S A和M R S A４种目标致病菌进行检测.与传统血培养方法比较,多重P C R方法的特异性为１００％,准确率为９７．９％(１８３/１８７),而检测所需时间,多重P C R方法为８．３h,传统血培养方法阳性为６０h,阴性为５d.与传统培养方法比较,本研究提供了一种高准确率㊁快速㊁简单的败血症检验方法.参考文献[１]B A N A D A P P,C HA K R A V O R T Y S,S HA H D,e ta l．H i g h l y s e n s i t i v ed e t e c t i o no fS t a p h y l 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b s e r v a t i o n a l s t u d y [J]．L a n c e t I n f e c tD i s,２０１４,１４(５):３９７Ｇ４０５．[５]MO H R A,P O L Z J,MA R T I NE M,e t a l．S e p s i s l e a d s t o a r e d u c e da n t i g e nＧs p e c i f i c p r i m a r y a n t i b o d y r e s p o n s e[J]．E u r J I m m u n o l,２０１２,４２(２):３４１Ｇ３５２．[６]Z R I O U I LSB,B E K K A L IM,Z E R O U A L IK．E p i d e m i o l oＧg y o f S t a p h y l o c o c c u sa u r e u s i n f e c t i o n sa n dn a s a l c a r r i a g e a t t h e I b nR o c h dU n i v e r s i t y H o s p i t a l C e n t e r,C a s a b l a n c a,M o r o c c o[J]．B r a z J I n f e c tD i s,２０１２,１６(３):２７９Ｇ２８３．[７]K R I S HN A N K,C U N N I O N K M．R o l eo fm o l e c u l a rd iＧa g n o s t i c s i nt h e m a n a g e m e n to f i n f e c t i o n sd i s e a s ee m e rＧg e n c i e s[J]．M e dC l i nN o r t hA m,２０１２,９６(６):１０６７Ｇ１０７８．[８]T H O N G KL,L A IM Y,T E H CSJ,e t a l．S i m u l t a n e o u s d e t e c t i o no f m e t h i c i l l i nＧr e s i s t a n tS t a p h y l o c o c c u sa u r e u s,A c i n e t o b a c t e r b a u m a n n i i,E s c h e r i c h i a c o l i,K l e b s i e l l a p n e u m o n i a ea n d P s e u d o m o n a s a e r u g i n o s a b y m u l t i p l e x P C R[J]．T r o pB i o m e d,２０１１,２８(１):２１Ｇ３１．[９]G A L K I E W IC ZJP,K E L L O G G C A．C r o s sＧk i n g d o ma mＧp l i f i c a t i o n u s i n g b a c t e r i aＧs p e c i f i c p r i m e r s:c o m p l i c a t i o n s f o r s t u d i e so fc o r a lm i c r o b i a le c o l o g y[J]．A p p lE n v i r o nM i c r o b i o l,２００８,７４(２４):７８２８Ｇ７８３１．[１０]L I U Y,Z HA N GJ,J IY．P C RＧb a s e da p p r o a c h e sf o rt h ed e t e c t i o no fc l i n i c a l m e t h i c i l l i nＧr e s i s t a n tS t a p h y l o c o c c u sa u r e u s[J]．O p e n M i c r ob i o l J,２０１６,１０(１):４５Ｇ５６．[１１]K AM B I R E O,A D I N G R A A A,Y A O K M,e t a l．P r e v aＧl e nc eo f v i r u l e n c e g e n e s a s s o c i a t ed w i t h d i a r r he a g e n i c p a t h o t y p e so fe s c h e r i c h i ac o l i i s o l a t e sf r o m w a t e r,s e d iＧm e n t,f i s h,a n d c r a b i nA b y L ag o o n,CÔt e dᶄI v o i r e[J]．I n t JM i c r o b i o l,２０１７,２０１７:９５３２１７０．[１２]Z I E G L E RI,F A G E R S T RÖM A,S T RÅL I N K,e ta l．EＧv a l u a t i o no f a c o m m e r c i a lm u l t i p l e xP C Ra s s a y f o r d e t e cＧt i o no f p a t h o g e nD N Ai nb l o o df r o m p a t i e n t sw i t hs u sＧp e c t e d s e p s i s[J]．P L o SO n e,２０１６,１１(１２):e０１６７８８３．[１３]T RÖG E R B,HÄR T E L C,B U E RJ,e ta l．C l i n i c a l r e l eＧv a n c e o f p a t h o g e n s d e t e c t e db y m u l t i p l e xP C R i nb l o o d o f v e r yＧl o wＧb i r t hw e i g h t i n f a n t sw i t hs u s p e c t e ds e p s i sＧm u lＧt i c e n t r e s t u d y o f t h e g e r m a nn e o n a t a l n e t w o r k[J]．P L o S O n e,２０１６,１１(７):e０１５９８２１．[１４]S TÖR E N B U R G E．R a p i dd e t e c t i o no fm e t h i c i l l i nＧr e s i s tＧa n t S t a p h y l o c o c c u s a u r e u s d i r e c t l y f r o m(下转第２８页)４２国际检验医学杂志２０１９年１月第４０卷第１期㊀I n t J L a bM e d,J a n u a r y２０１９,V o l．４０,N o．１t a n g i n d u c e sa p o p t o s i sa n di n h i b i t s m i g r a t i o no fe c t o p i c e n d o m e t r i o t i c s t r o m a l c e l l s[J]．JE t h n o p h a r m a c o l,２０１６,１９４(３):３８６Ｇ３９４．[４]李书艳,冯卫群．S u r v i v i n㊁P C N A在子宫内膜异位症组织中的表达及其意义[J]．河北医科大学学报,２０１３,３４(１):１８Ｇ２０．[５]WA N G Y,J I A N GLL,WUJF,e t a l．P r o t e c t i v e e f f e c t o f h o n o k i o l a g a i n s t e n d o m e t r i o s i s i n r a t s v i a a t t e n u a t i n g S u rＧv i v i na n d B c lＧ２:a m e c h a n i s t i cs t u d y[J]．C e l l M o lB i o l (N o i s yＧl eＧg r a n d),２０１６,６２(１):１Ｇ５．[６]A C I MO V I C M,V I D A K O V I CS,M I L I C N,e t a l．S u r v i v i n a n dV E G Fa s n o v e l b i o m a r k e r s i nd i a g n o s i s o f e n d o m e t r iＧo s i s[J]．JM e dB i o c h e m,２０１６,３５(１):６３Ｇ６８．[７]张晓玲,邱琳,于晓红,等．卵巢子宫内膜异位症患者异位和在位内膜中S u r v i v i n的表达及意义[J]．中国生育健康杂志,２０１２,２３(１):２４Ｇ２７．[８]T A G U C H IA,K O G A K,K AWA N A K,e t a l．R e s v e r a t r o l e n h a n c e s a p o p t o s i s i ne 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i v a t i n g S T A T３s i g n a l i n g[J]．B M CC a n c e r,２０１４,１４(６):７８３．(收稿日期:２０１８Ｇ０７Ｇ３０㊀修回日期:２０１８Ｇ１０Ｇ０６)(上接第２４页)㊀㊀c l i n i c a l s a m p l e s:m e t h o d s,e f f e c t i v e n e s s a n d c o s t c o n s i d e rＧa t i o n s[J]．G e rM e dS c i,２００９,７:D o c０６．[１５]S U NZ,C H E NZ,H O U X,e t a l．L o c k e dn u c l e i c a c i d p e nＧt a m e r s a su n i v e r s a lP C R p r i m e r s f o r g e n o m i cD N Aa mＧp l i f i c a t i o n[J]．P L o SO n e,２００８,３(１１):e３７０１．[１６]B O T K I N DJ,G A L L IL,S A N K A R A P A N IV,e t a l．D eＧv e l o p m e n t o f am u l t i p l e xP C Ra s s a y f o r d e t e c t i o n o f S h i g a t o x i nＧp r o d u c i n g E s c h e r i c h i a c o l i,e n t e r o h e m o r r h a g i c E．c o l i,a n de n t e r o p a t h o g e n i cE．c o l is t r a i n s[J]．F r o n tC e l l I n f e c tM i c r o b i o l,２０１２,２(１):８．[１７]D U T T A S,G U I N S,G H O S H S,e ta l．T r e n d si nt h ep r e v a l e n c e o f d i a r r h e a g e n i c e s c h e r i c h i a c o l i a 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检测大肠杆菌的方法

检测大肠杆菌的方法
检测大肠杆菌的方法包括以下几种：
1. 化学方法：使用化学试剂检测大肠杆菌的生长产物，例如检测β-半乳糖苷酶（β-galactosidase）或亚硝酸盐的产生。

2. 免疫学方法：使用抗原抗体反应来检测大肠杆菌的存在。

可以通过免疫层析试纸、酶联免疫吸附试验（ELISA）或免疫荧光染色等技术进行检测。

3. 分子生物学方法：使用DNA提取和PCR扩增技术，通过特定基因的检测来确定大肠杆菌的存在。

常用的是检测16S rRNA基因。

4. 血液培养法：将样品接种到含有适合大肠杆菌生长的培养基上，经过一段时间后观察是否有菌落形成。

5. 基于大肠杆菌特定生理和生化特征的传统方法：根据大肠杆菌在营养琼脂培养基上形成金属光泽、产生气泡、使用L-色氨酸作为唯一氮源，以及产生酸和气体等特征来进行初步检验。

这些方法可以单独或结合使用来对大肠杆菌进行检测，并能够提供快速、准确的结果。

致病性大肠埃希氏菌及其检验

致病性：（1）致病因素
LT与ST的比较
特性
分子量耐热性免疫原性 B亚单位受体
致病机理
不耐热肠毒素
耐热肠毒素
较大，73000
较小，1500-5000
不耐热
耐热
有
无
肠黏膜GM1神经节苷酯肠黏膜GM1神经节苷酯
活化细胞腺苷酸环化酶，活化细胞鸟苷酸环化酶，
细胞内cAMP含量升高，细胞内cGMP含量升高，
原理：伊红美蓝琼脂平板含伊红和美蓝染料，在此亦作为指示剂。大肠菌群发酵乳糖造成酸性环境时，故可染上酸性染料伊红，又因伊红与美兰结合（该两种染料即结合成复合物）使大肠菌群产生带核心的、有金属光泽的深紫色的（龙胆紫的紫色）阳性菌落，从菌落表面的反射光中还可看到绿色金属闪光。在伊红美兰平板上的典型菌落呈紫黑色，圆形，边缘整齐，表面光滑湿润，常有金属光泽。有的由于被检样品影响，亦呈现紫色、粉紫、中心灰紫、无黑心、湿润等，常为大肠杆菌，均应注意挑选。
革兰氏阴性杆菌
革兰氏阳性杆菌
大肠杆菌扫描电镜照片源自大肠杆菌透射电镜照片大肠杆菌革兰氏染色照片
大肠杆菌平板菌落照片
一、埃希氏菌属生物学特性
生化特性
一．可发酵葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇产酸产气，有些不典型的菌株不发酵或迟缓发酵乳糖；
二．不同菌株对蔗糖，卫矛醇、水杨苷发酵结果不一致; 三．本菌可使赖氨酸脱鞍、不能使苯丙氨酸脱羧。四．不产生H2S，不液化明胶，不分解尿素;
二、致病性大肠埃希氏菌的检验
（二）、分离培养
将乳糖胆盐发酵阳性管液与增菌液分别划线接种于麦康凯或伊红美兰琼脂平板上。 2、于36±1℃培养 18—24小时观察菌落对于污染严重的食品可直接按划线法接种，不经过增菌过程。不但要注意乳糖发酵的菌落，同时也要注意乳糖不发酵的菌落。

控制菌(大肠埃希菌)检查操作规程

控制菌（大肠埃希菌）检查操作规程1.目的建立一个控制菌大肠埃希菌控制菌大肠埃希菌检查标准工作程序，规范QC控制菌大肠埃希菌检查人员的控制菌大肠埃希菌检查的操作。

2.范围适用于本公司的口服制剂完成内包后外包前的中间体和局部给药制剂产品的内包装材料的控制菌大肠埃希菌的检测。

3.责任者QC控制菌大肠埃希菌检查人员；质量管理部4.内容4.1检测准备4.1.1 QC人员接到控制菌大肠埃希菌检查的《工作进程计划单》后，核对《取样指令》，确定控制菌大肠埃希菌检查所需容器具、试液、培养基等项目和数量，执行微生物检查准备工作操作程序和培养基配制操作规程，进行控制菌大肠埃希菌检查前的准备工作。

4.1.2 为了保证被检品在取样后规定的时间内完成检验，取样前应准备好检验需要的各种器皿（清洗→干燥→包裹）、培养基和稀释剂等（配制→分装→包裹），并灭菌备用。

4.2 供试液的制备4.2.1 供试液供试液是指按照供试品的理化特性与生物学特性，采取适宜的方法将供试品制成供试验用的均匀液体。

4.2.2 供试液的制备根据供试品的理化特性与生物需特性，采取适宜的方法制备供试液。

如果使用了乳化剂、分散剂、中和剂和灭活剂，其用量应证明是有效的，并对微生物的生长和存活无影响性。

4.2.2.1 可溶性液体供试品取供试品10ml，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，混匀，作为供试液。

可溶性液体制剂可用混合的供试品原液作为供试液。

4.2.2.2 非水溶性液体供试品油剂可先加入适量的无菌聚山梨酯80使供试品分散均匀，然后再加0.9%无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100m，混匀，作为供试液。

4.2.2.3 水溶性固体、半固体或黏稠性供试品称取供试品10g，置PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml中，用匀浆仪或其他适宜方法，混匀，作为1：10供试液。

必要时可加适量的无菌聚山梨酯80，并置水浴中适当加温使供试品分散均匀。

4.2.2.4 非水溶性供试品取供试品5g(5m1)，加入含溶化的（温度不超过45℃）5g司盘80、3g单硬脂酸甘油酯、10g聚山梨酯80无菌混合物的烧杯中，用无菌玻棒搅拌成团后，慢慢加入45℃pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，边加边搅拌，使其充分乳化，作为1:20供试液。

南京地区肠出血性大肠埃希氏菌O157：H7的监测

及它痫体的能ｊ例如，料表明臭氧存浓度ｌｇ１作Ｔ，资ｍ／，用时Ｊ５ｌｌ件下对微小隐孢子虫卯囊灭酒为９％为ｌｌ条ｌｉ０仉是氯消毒剂存常规条什下埘隐孢子虫卵囊无效多年以来农卡水厂使用的基本都是含氯制剁，要求氯寸梭
于农村水厂Ｉ于卡的设备资金投入较大，术啦题亦术解ｆ ¨ ］决，今，Ｉ术他川奉研究课题的创新点于研制出至ｆ司内
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产志贺毒素大肠埃希菌的分子生物学鉴定和耐药性分析

产志贺毒素大肠埃希菌的分子生物学鉴定和耐药性分析1李咏梅，李凡吉林大学基础医学院病原生物学教研室, 1320011E-mail：mayflower380@摘要：本文采用多重PCR（multiplex PCR, mPCR）法对产志贺毒素大肠埃希菌（Shiga toxin-producing Escherichia coli, STEC）分离株进行毒力基因的分子生物学鉴定；用WHO 推荐的K-B法对分离株进行抗生素的敏感性测定，以了解stx1、stx2、eaeA、hlyA 4种毒力基因的分布情况，以及分离株对18种抗生素的敏感性。

结果显示产志贺毒素的大肠埃希菌共有46株，其中两种毒素均产生的有22株（47.8%）；单纯产生stx1的有16株（36.9%），stx2的有8株（17.4%）；四种毒力基因均存在的有19株（41.3%），血清型为O157:H7，而非O157:H7血清型的菌株（23/46）中，4种毒力基因同时存在的仅有3株（6.6%），但有13株（56.9%）hlyA基因阳性。

全部STEC对复方新诺明耐药，对链霉素耐药率为28.3%，氨苄西林为30.4%，红霉素为69.6%，而且有5株对至少4种以上抗生素多重耐药，耐药谱为复方新诺明-链霉素-红霉素-氨苄西林。

非O157型 STEC耐药菌次为122，而O157 型为63。

实验结果证明mPCR法可以快速检测STEC特征性毒力基因，以判定其致病性能。

非O157型STEC对抗生素较易形成耐药性。

关键词：STEC；鉴定; 耐药性1．引言STEC是世界上人类食物中毒的重要致病因子，也是引起大规模食源性食物中毒的主要病原菌[1]。

STEC中有100余个血清型的致病性大肠杆菌可以致病，主要血清型是O157H7，可引起非出血性腹泻，出血性结肠炎（haemorrhagic colitis, HC），溶血性尿毒综合症(haemolytic uraemic syndrome, HUC)。

PCR技术在食品微生物检测中的应用研究

PCR技术在食品微生物检测中的应用研究作者：王迪来源：《食品安全导刊》2024年第05期摘要：PCR技术因具有高灵敏度、高特异性和快速性的特点，在食品微生物检测领域广泛使用。

本文阐述食品中常见的致病微生物、PCR技术的基本原理、食品中常见致病微生物的PCR检测方法，探讨PCR技术在食品微生物检测中的应用，并介绍PCR技术在食品微生物检测中的发展趋势。

关键词：PCR技术；食品微生物；致病微生物；实时荧光定量PCR；多重PCRStudy on the Application of PCR Technique in Food Microbiological DetectionWANG Di（Center for Disease Control and Prevention， Wujin District， Changzhou City， Jiangsu Province，Changzhou 213100， China）Abstract： PCR technology is widely used in the field of food microbiological detection because of its high sensitivity， high specificity and rapidity. This paper describes the common pathogenic microorganisms in food， the basic principle of PCR technology， the PCR detection method of common pathogenic microorganisms in food， discusses the application of PCR technology in food microbial detection， and introduces the development trend of PCR technology in food microbial detection.Keywords： PCR technology; food microorganism; pathogenic microorganism; real-time fluorescence quantitative PCR; multiplex PCR隨着食品工业的快速发展和人们生活水平的不断提高，食品安全问题日益受到政府和公众的高度关注。

粪大肠菌群检测方法

粪大肠菌群检测方法
粪大肠菌群检测是一种常用的微生物检测方法，用于评估肠道内大肠埃希杆菌等菌群的数量和组成。

以下介绍几种常见的粪大肠菌群检测方法：
1. 传统培养法：该方法通过将粪便样本接种在含有特定培养基的培养皿中，利用培养皿中的营养物质、温度等条件，使大肠菌群等菌种在培养基上生长。

然后通过观察培养皿中的菌落形态、颜色等特征，或进行进一步的生化试验，来鉴定和计数菌群。

这种方法操作简便，但需要较长时间（通常需要2-3天）。

2. PCR法：PCR（聚合酶链反应）是一种快速、高效的核酸扩增技术，可用于检测微生物的DNA或RNA。

在粪大肠菌群检测中，可以选择一种或多种特异引物，通过PCR扩增粪便样
本中的大肠菌群DNA片段。

扩增后的产物可以进行电泳分析，根据特定的条带模式来鉴定和计数菌群。

相比传统培养法，PCR法的优势在于快速、高灵敏度和特异性。

3. 16S rRNA测序法：16S rRNA是细菌基因组中高保守的区域，其序列具有物种特异性。

基于16S rRNA序列的差异，可以通
过测序技术快速准确地鉴定粪大肠菌群的组成。

该方法可通过提取粪便样本中的总DNA，进行PCR扩增和纯化后，进行高
通量测序。

测序结果可以使用相应的数据库比对，识别和计数样本中的各种大肠菌群。

总结来说，传统培养法、PCR法和16S rRNA测序法是常见的
粪大肠菌群检测方法。

其中，PCR法和16S rRNA测序法更加
快速、准确，逐渐成为主流的检测方法。

这些方法的应用有助于揭示肠道微生物群落的组成和功能，为相关疾病的诊断和治疗提供依据。

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肠出血性大肠埃希氏菌的多重PCR检测方法李怡　徐建国【摘要】　目的　开发肠出血性大肠埃希氏菌(entero2hemorrhagicE.coli,EHEC)的多重PCR

检测方法。方法　以溶血素(hemolysin,hly)基因和志贺样毒素(Shigaliketoxin,SLT)

基因为靶基

因,进行了研究。结果　发现SLT12hly组合能够检测出产生SLT1毒素的EHEC菌株,SLT22hly组合能够检测出产生SLT2的EHEC菌株,SLTs2hly组合能够检测出所有产生SLT1和SLT2的EHEC

菌株。结论　实验证明,把这3种多重PCR方法结合使用,能够快速地检测和鉴定EHEC菌株,能够比较准确地了解所检测菌株产生志贺样毒素的情况,为EHEC的检测工作提供了一种更加方便易行的技术。【主题词】　大肠杆菌溶血素类毒素类聚合酶链反应

DevelopmentofmultiplexPCRmethodsfordetectionofenter-hemorrhagicE.coli　LIYi,XU

Jianguo.PriorityLaboratoryofMolecularMedicalBacteriology,MinistryofHealth,InstituteofEpidemiologyandMicrobiology,ChineseAcademyofPreventiveMedicine,Beijing102206【Abstract】　Objective　Todevelopmultiplexpolymerasechainreaction(PCR)

methodforde2

tectionofentero2hemorrhagicE.coli(EHEC).Methods　Thevirulencegenesofhemolysin(hly)andShiga2like2toxin(SLT)werechosenasthetargetgenes.Results　WiththesePCRmethods,alloftheEHECstrainshavingSLT1andhlygenescouldbedetectedwithhly2SLT1pair,alloftheEHECstrainshavingSLT2andhlygenescouldbedetectedwithhly2SLT2pair.Withhly2SLTspair,alloftheEHECstrainshavinghlyandSLT1orSLT2genescouldbeeasilydetected.Conclu-

sions　IfthethreePCRpairsareusedconcurrently,EHECstrainscouldbeeasilydetected;thenon2EHECShiga2like2toxinproducingE.colicouldbeeasilydistinguished.And,thevirulencefactorsofthetestedstrainscouldalsobeclarified.【Subjectwords】　Escherichiacoli Hemolysin Shiga2like2toxin Polymerasechain

reaction

新发现的病原微生物和重新抬头的病原微生物是当前世界医学界面临的一个新的课题。O157󰃘H7

大肠埃希氏菌就是其中之一。它在分类学上属于肠出血性大肠埃希氏菌(entero2hemorrhagicE.coli

EHEC)。从产生志贺样毒素的角度来看,O157󰃘H7大肠埃希氏菌也属于产志贺样毒素的大肠埃希氏菌(Shiga2like2toxinproducingE.coli,SLTEC)。

HEC因为能引起出血性肠炎而得名,主要包括O157󰃘H7血清型菌株,还包括O26󰃘H11、O111等血清型的部分菌株等。近年来也有关于无动力的O157

菌株(O157󰃘NM)

引起出血性肠炎和溶血性尿毒综

合症的报道〔1〕。我国也先后分离到了O157󰃘H7大肠埃希氏菌和非O157血清型的EHEC株〔2,3〕。EHEC的主要毒力因子有溶血素(hemoly2sin,hly),

志贺样毒素(Shigaliketoxin,slt)和eae基

本课题受国家自然科学基金资助(课题编号:39625001

)

作者单位:102206北京,中国预防医学科学院流行病学微生物学研究所,卫生部分子医学细菌学重点实验室〔李怡(现通讯地址:

450003郑州,河南省人民医院省遗传研究所),徐建国〕

因〔1〕。并根据这些基因发展了DNA探针和PCR检测方法〔4,5〕。根据溶血素基因发展的EHEC特异性DNA探针和PCR检测方法能够检测O157󰃘H7和其它血清型的EHEC菌株,但不能反映产志贺样毒素的情况〔4,5〕。根据志贺样毒素发展的DNA探针和PCR方法,不能够准确地将EHEC和EPEC(致肠

道病大肠杆菌)区分开来,因为许多EPEC菌株也产生志贺样毒素〔629〕。本研究发展了检测EHEC菌株的多重PCR方法,可同时检测溶血素基因和志贺样毒素基因(Shiga2liketoxin,SLT)可以将EHEC和

EPEC区分开来。现将结果报道如下:

材料与方法11菌株:试验所用的参考菌株及特性见表1。惠赠菌株的有江苏省徐州市防疫站权太淑主任医师,

山东省防疫站菌种室和美国马利兰大学医学院MM

Levine博士〔2,4〕。

21试剂:TaqDNA聚合酶、dNTPs

、分子量标准

ΚDNA󰃗Hind󰂬、ΚDNA󰃗EcoR󰂪󰃗Hind󰂬、PCR

・18・中华微生物学和免疫学杂志1999年第19卷第1期　ChinJMicrobiolImmunol,January1999,Vol19,No.1markers、RNase等均购自华美生物工程公司。PCRDNA扩增仪为中国医学科学院遗传学研究所生产。31引物:(1)EHEC特异性PCR引物参考文献〔5〕。检测溶血素基因hlyAB,产物为338bp。(2)SLT1a5’2AGTTAATATGGTGGCGAA;SLT1b5’2GACTGCGTCAGTGAGGTT。检测志贺样毒素1,产物为447bp。(3)SLT2a5’2TTCGGTATCCTATTCCCG;SLT2b5’2TCTCTGGTCATTGTATTA。检测志贺样毒素2,产物为447bp。(4)SLTsa5’2TTTACGATAGACTTCTCGAC;SLTsb5’2CACATATAAATTATTTGCGCTC。可检测SLT1和SLT2。SLT1产物为224bp,SLT2的产物为227bp〔9〕。41模板制备:本研究采用两种方法制备模板DNA。(1)使用小量提取的染色体DNA作为模板。(2)水煮法:将细菌过夜振荡培养。取1ml细菌的过夜培养物至一离心管,12000r󰃗min离心30秒后,去上清,加入100Λl三蒸水,混匀,煮沸10分钟,12000r󰃗min离心30秒后,取上清直接用于PCR扩增。51普通PCR扩增反应:PCR反应总体积为25Λl。在015mlEppendorf管中按顺序加入三蒸水1515Λl,10×buffer(MgCl215mmol󰃗L)215Λl,dNTPs(每种dNTP溶液浓度分别为012mmol󰃗L)215Λl,引物(每条引物的浓度为015Λmol󰃗L)110Λl,模板DNA210Λl,TaqDNA聚合酶(3U󰃗Λl)015Λl。最后加入石蜡油50Λl。反应程序EHEC特异性PCR(hly基因):94℃10分钟,变性模板DNA,然后94℃1分钟,50℃1分钟,72℃1分钟,30个循环。SLT1:94℃10分钟,变性模板DNA,然后94℃1分钟,50℃1分钟,72℃1分钟,30个循环。SLT2:94℃10分钟,变性模板DNA,然后94℃1分钟,50℃1分钟,72℃1分钟,30个循环。SLT1和SLT2:94℃10分钟,变性DNA,然后94℃1分钟,50℃1分钟,72℃1分钟,30个循环。61多重PCR(MPCR):MPCR反应总体积为25Λl,在015mlEppendorf管中按顺序加入三蒸水1315Λl,10×buffer(无镁离子)215Λl,dNTPs各215Λl,每条引物110Λl,模板210Λl,TaqDNA聚合酶015Λl,石蜡油50Λl。反应程序hly2SLT1和hly2SLT2:94℃10分钟,变性DNA,然后94℃1分钟,50℃1分钟,72℃2分钟,30个循环。hly2SLTs:94℃10分钟,变性DNA,然后94℃1分钟,45℃1分钟,72℃1分钟,30个循环。71PCR产物检测:用(115～210)%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。在紫外灯下观察,使用照相系统记录试验结果。

结果PCR检测结果:使用针对hly的引物,对21株EHEC菌株(包括1株O26󰃘H11血清型的EHEC菌株)进行了检测。所有21株菌均能产生大小为338bp

的PCR产物。使用针对SLT1的引物进行PCR试验,TX1、TX2、TX4、852998、8521128、SD4、SD15和SD16菌株为阴性结果,其余菌株为阳性结果。使用针对志贺样毒素2的引物对21株E.coliO157󰃘H7和4株非O157󰃘H7菌株进行PCR扩增,结果除徐州菌株12754和来源于美国的O26󰃘H11EHEC菌株外,

其余菌株均为阳性结果。PCR检测的结果和过去使用DNA探针检测的结果一致(表1)〔4,5〕。使用可同时检测出SLT1和SLT2基因的引物SLTs对上述菌株进行了检测,结果均为阳性。PCR产物的分子量和预期的相符,说明其敏感性是比较满意的。多重PCR检测结果:鉴于针对SLT1、SLT2、SLTs和hly引物的检测结果,验证了多重PCR方法。结果发现,使用SLT12hly的4条引物进行PCR

反应时,所获得的结果和使用普通PCR的结果相同:TX1、TX2、TX4、852998、8521128、SD4、SD15和SD16不具有SLT1基因。其余菌株均为阳性结果。使用SLT22hly的4条引物同时进行多重PCR试验,所获得的结果和普通PCR试验的结果相同。徐州菌株12754和来源于美国的O26󰃘H11大肠埃希氏菌不具有SLT1基因,其余菌株均为阳性结果。使用SLTs2hly引物,所有含有SLT1或SLT2基因的EHEC菌株均呈现阳性结果(见表1和图1)。

讨论EHEC感染已经成为世界性的问题,发展特异、敏感、快速、经济的检测方法,对病原菌的检测、鉴定和流行病学调查都是十分重要〔1,4,5〕。目前世界上现有的EHEC检测方法主要是对其毒力基因和独特