全自动酶免分析系统校准技术研究

全自动酶免分析系统校准技术研究康娟;武利庆;严振宇;王军;孙京昇【摘要】A calibration technique has been established to evaluate the testing performance of fully automated ELISA analyzers.The technique tests the accuracy and precision of adding module,the temperature of incubation module,the washing residue rate and cross contamination of washing module,and the absorbance stability,accuracy,precision and channel difference of reading module separately around the constituent modules of the system.3 fully automated ELISA analyzers from different manufactures were chosen to validate the technique applicability.Results showed that the maximum adding bias and CV were-7.4％ and 8.0％respectively,the incubation temperature bias was within ± 0.5 ℃,the maximum washing residue rate was 0.8％ and maximum cross contamination was 0.1％,the maximum absorbance fluctuation was 0.003 within ten minutes,the maximum absorbance bias and CV were 0.019 and 0.2％ respectively for tested wavelengths and absorbance,the maximum channel difference was 0.005.The calibration technique was testified to be scientific and practical,and expected to be used to evaluate the fully automated ELISA analyzers effectively.%研究了一种用于评价全自动酶免分析系统测试性能的校准技术.该技术分别就加样模块的加样正确度和精密度,孵育模块的孵育温度,洗板模块的洗涤残留率和交叉污染,读板模块的吸光度示值稳定性、示值误差、重复性和通道差异进行测试和评价.选取3款不同品牌设备进行适用性验证,试验结果表明:所选系统最大加样偏差和变异系数分另为-7.4％和8.0％;孵育温度偏差在±0.5℃范围内;最大洗涤残留率和交叉污染分别为0.8％和0.1％;10 min内最大示值波动为0.003,在所测波长和吸光度下的最大示值误差为0.019,最大变异系数为0.2％,最大通道差异为0.005.【期刊名称】《计量学报》【年(卷),期】2017(038)006【总页数】4页(P799-802)【关键词】计量学;酶免分析系统;校准【作者】康娟;武利庆;严振宇;王军;孙京昇【作者单位】北京市医疗器械检验所医疗器械检验与安全性评价北京市重点实验室,北京101111;中国计量科学研究院医学生物所,北京100029;北京市医疗器械检验所医疗器械检验与安全性评价北京市重点实验室,北京101111;北京市医疗器械检验所医疗器械检验与安全性评价北京市重点实验室,北京101111;北京市医疗器械检验所医疗器械检验与安全性评价北京市重点实验室,北京101111【正文语种】中文【中图分类】TB99全自动酶免分析系统基于酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)原理，通过多任务多通道的平行过程、综合模块化设计、先进的传感监测技术等，实现操作过程的自动化和标准化，极大提高了工作效率，被广泛用于大批量血液样本的临床免疫指标检测，尤其是血站实验室对血液样本的筛查[1]。

为了保证检验结果的准确，有必要对全自动酶免分析系统的性能进行评价。

迄今为止，我国尚未出台有关全自动酶免分析系统的检定规程或者校准规范，医学检验实验室只能通过与现有系统比对或请厂家协助来开展部分性能的确认[2,3]。

为此，北京市医疗器械检验所与中国计量科学研究院医学生物所开展了全自动酶免分析系统校准技术的研究。

根据全自动酶联免疫分析仪的结构及特点，结合JJG 861—2007 酶标分析仪[4]、YY/T 0654—2008 全自动生化分析仪[5]和在洗板机测定等方面的经验[6]，分别针对加样精度、孵育温度、洗涤效果、吸光度测定等物理性能建立了具体检测方法，并选取3台不同品牌的全自动酶免系统进行验证，以评估该校准方法的科学性和可操作性。

2.1 器材试剂全自动酶免分析测试系统：EUROIMMUN公司Analyzer I-2P，德国(系统Ⅰ)；BIO-RAD公司EVOLIS，美国(系统Ⅱ)；Tecan公司Freedom EVOlyzer 150，瑞士(系统Ⅲ)。

电子天平：METTLER TOLEDO公司XS205 Dual Range，瑞士。

酶标仪温度测量仪：由中国计量科学研究院医学生物所提供。

光谱中性滤光片：吉林省计量测试研究院制造，证书编号H213Z-G2187。

洗板机测试洗涤液：分别称取NaCl 8.0 g、KCl 0.2 g、Na2HPO4 1.44 g、KH2PO4 0.24 g，加蒸馏水至1 000 mL，调节溶液pH到7.4，得到0.01 mol/L 的磷酸盐缓冲液(PBS)。

量取100 mL PBS溶液，加入300 μL Tween-20，混合均匀即得到洗板机测试洗涤液，现用现配。

洗板机测试用标准物质：牛血清白蛋白-考马斯亮蓝吸光度溶液标准物质，标准物质编号BW(SW)11(0001)，吸光度在0.1～0.6范围内，由中国计量科学研究院医学生物所提供。

超纯水：MilliQ Advantage超纯水仪,美国。

2.2 测试方法(1)加样正确度和加样精密度准备可防水分挥发的适当容器，在电子天平上调零后放到合适位置，控制样品针往该容器中加入规定体积20 μL或200 μL的超纯水，再在电子天平上称量其增加质量，以该质量除以当时温度下纯水的密度得到实际加入的体积。

每种规定加入量重复测定6次，超纯水需提前置于实验室内平衡数小时。

以加样体积的变异系数表征加样精密度,以加样体积的相对偏差表征加样正确度。

(2)孵育温度将酶标仪设定到常用孵育温度37 ℃，放置专用温度测量仪到酶标仪96孔板架上，关闭仓门，平衡30 min以上，待读数稳定后，读取酶标板B4、B8、B12、G4、G8、G12位置的实际温度，每孔分别测量3次，取其算术平均值作为实际测定温度。

(3)洗涤残留率和交叉污染测定空白酶标板A1-H7在620 nm处的吸光度值，逐列(A1-H1，A2-H2，A3-H3，A4-H4，A5-H5，A6-H6，A7-H7)取平均，作为该列的空白值(b1，b2，b3，b4，b5，b6，b7)。

移取80 μL洗板机测试用标准物质溶液至酶标板的A1-H1，A3-H3，A5-H5的每一个孔中，测定在620 nm处的吸光度值，逐列(A1-H1，A3-H3，A5-H5)取平均值，减去该列对应的空白值后得到校正后的标准溶液吸光度值(s1，s3，s5)。

设定洗涤程序为：全板洗涤，逐列清洗，每孔清洗用量300μL，共清洗3次。

采用以上洗涤程序从酶标板的第1列开始清洗。

清洗完成后，将酶标板水平自然晾干，读取酶标板A1-H7孔在620 nm处的吸光度，逐列(A1-H1，A2-H2，A3-H3，A4-H4，A5-H5，A6-H6，A7-H7)取平均，并将该值减去空白酶标板的吸光度值得到校正后的吸光度值(w1，w2，w3，w4，w5，w6，w7)。

计算洗涤残留率计算交叉污染率也可以类似评估逐行洗涤模式。

(4)示值稳定性选用492 nm波长或仪器特有的专一波长，将吸光度标称值1.0的光谱中性滤光片，平放在微孔酶标板的空板架上，以空气为参比，测量并记录仪器的初始示值A0，5 min后记录仪器示值一次，10 min后再次记录仪器示值。

求出后两次吸光度示值的最大值Amax，计算示值稳定性r=Amax-A0。

(5)吸光度示值误差依次选用405 nm、450 nm、492 nm、620 nm波长或仪器特有的专一波长，将吸光度标称值分别为0.2，0.5，1.0，1.5的4块光谱中性滤光片同时平放在微孔酶标板的空板架上，以空气为参比，连续测量3次，依次记录仪器示值。

计算吸光度示值误差其中Ai为第i次测量的吸光度值；As为吸光度标准值。

(6)吸光度重复性选用450 nm波长或仪器特有专一波长，将吸光度标称值为0.5或1.0的光谱中性滤光片平放在微孔酶标板的空板架上，以空气为参比，于固定的某一孔位重复测量6次，记录仪器示值，以实验结果的变异系数表示仪器的吸光度重复性。

(7)通道差异选用450 nm波长或仪器特有专一波长，将吸光度标称值为1.0的光谱中性滤光片平放在微孔酶标板的空板架上，先后置于多个通道的相应位置，以空气为参比，测量并记录每一通道的至少6次吸光度值，多个通道的差异结果报告用全部测量数据的极差值表示，δA=Amax-Amin。

3.1 加样正确度和加样精密度酶免试验的样本处理必须基于批量化操作——96孔酶标板，为保障板内各孔标本孵育时间最小差异，必须采用8通道或12通道快速加样。

因此全自动加样模块是提高实验精度、提高实验效率和避免人为误差的关键设备[7]。

仪器加样针测试常采用称量法或比色法，本校准方法采用了相对简便的称量法。

结果见表1，系统Ⅰ的微量加样的重复性相对欠佳，系统Ⅱ的微量加样偏差相对较大，系统Ⅲ的加样精确度较好，这可能与仪器取液的液位探测和异常监测等技术设计相关。

另外，如果仪器加样时没有使用一次性枪头，方法中还应考虑加样针携带污染的影响。

实验方案可设计如下：以显色溶液和蒸馏水作为样品，样品的加入量为仪器标称最大加样量，按照原液、原液、原液、蒸馏水、蒸馏水、蒸馏水的顺序为一组，控制仪器在相应波长下直接读取加样孔位的吸光度。