细菌总数测定
细菌总数的测定
细菌总数的测定一、准备工作1.准备好培养基（一般为普通营养琼脂培养基），称取28克培养基粉末，放入1000ml锥形瓶中，量取800ml蒸馏水倒入，放入搅拌子在搅拌器上，将溶液搅拌均匀后，再取出搅拌子（用铁棒吸出），然后用报纸包扎锥形瓶口，待灭菌。
2.取洗净干燥的培养皿，根据水样准备培养皿数，一般原水样稀释三个倍数，处理后水样稀释两个倍数，每个做两个平行样。
每十个培养皿一组，用报纸包扎好待灭菌。
3.移液枪头的灭菌：洗干净后放入盒中排列整齐，盖上盒盖，在盒子外面包一层报纸，再用橡皮筋扎紧，待灭菌。
4.小试管：每次用完都要将小试管刷洗干净，洗净后倒放在试管架上备用，如当天需要做细菌实验则将所需数量的每根试管内各加入9ml蒸馏水，赛上橡皮塞，7支一捆用报纸将试管口扎好，待灭菌。
5.250ml采样瓶及锥形瓶（加有适量玻璃珠）需提前灭菌，方便采样人员随时取用，灭菌好的采样瓶可保存一周，灭菌时每个瓶口都要用报纸包扎好。
6.标签纸准备：事先将所需的数量准备好，写上编号，以备操作时取用。
二、灭菌1.高压蒸汽锅的使用：灭菌前应先检查国锅内水位，应保持在水位标示处，过多过少都不好，放入准备步骤中待灭菌的物品，盖上小盖，然后再盖外盖，对正后对角旋好各个旋钮，使其受力均匀不至于在灭菌的过程中跑气（压力上不去即为跑气），然后关上安全阀打开放气阀，打开高压蒸汽锅开关，调好灭菌时间（一般灭菌30min），待放气阀放气声很大后关上放气阀，蒸气锅即开始依据设计的时间灭菌，此时压力表指针在1.5左右，灭菌完毕后，关上开关，待压力表指针在0处，打开安全阀放气后，才能开盖。
蒸气锅底部水若变脏则需清洗并换水。
2.细菌实验所需玻璃器皿一般需要灭菌30min。
3.净化工作台的使用：先用75%酒精灯擦拭台面，紫外灯和照明灯隔一段时间擦拭一下，并用软布擦拭干净，然后关上门，打开紫外灯按钮，照明消毒30min后再打开送风按钮，一直到实验前才关闭紫外灯，打开照明灯。
紫外分光测细菌总数的原理
紫外分光测细菌总数的原理紫外分光测细菌总数是一种常用的快速测定细菌数量的方法，主要基于细菌在紫外光波长下的吸光度与细菌数量之间的关系。
在水质监测、食品卫生和环境卫生等领域中，细菌总数的快速测定对于评价样品的卫生状况具有重要意义。
传统的测定方法包括平皿计数法和薄膜法，这些方法虽然准确但耗时繁琐。
而紫外分光测细菌总数的方法，不仅快速而且简便，因此被广泛应用。
紫外分光法的基本原理是利用细菌在特定波长下对紫外光的吸收进行测量，从而推算细菌总数。
常用的测定细菌总数的波长一般为254 nm，对于大多数细菌来说，该波长下的紫外光较容易被吸收。
具体测定细菌总数的步骤一般如下：首先，准备样品。
样品可以是水样、食品样品或表面拭子样品等。
样品通常需要经过一系列的前处理，如过滤、平衡和稀释等，以达到测定的要求。
然后，将样品分配到适当的光学比色皿中，并利用分光器将波长调整为254 nm。
调整好波长后，将空白皿放入光路中，记录下空白值。
接下来，依次将样品皿放入光路中，记录吸光度值。
由于细菌浓度较高时会引起光路中的吸光度线性饱和，因此需要根据不同细菌浓度来选择合适的稀释倍数。
最后，根据吸光度和浓度的关系，可以推算出细菌总数。
对于水样和食品样品，可以通过参照标准曲线和标准细菌悬液进行定量，或者通过CFU法进行计数。
紫外分光测细菌总数的原理是基于高浓度的细菌悬浮液对紫外光的吸收能力，通过测定单位体积细菌悬浮液的吸光度，进而推算细菌总数。
吸光度与细菌浓度之间的关系可以通过实验测定建立标准曲线，以后续的吸光度读数推算细菌总数。
与传统的测定方法相比，紫外分光测细菌总数具有速度快、操作简便、结果稳定等优点。
然而，该方法也存在一些局限性，比如不能区分不同种类的细菌，对于一些特殊菌株的测定结果可能不准确，需要结合其他方法进行综合判断。
总之，紫外分光测细菌总数是一种常用的快速测定细菌数量的方法，通过测定细菌在紫外光波长下的吸光度与细菌数量之间的关系，可以推算出细菌总数。
细菌总数测定操作规程
细菌总数检测操作规程1 原理试样经过处理，稀释至适当浓度，在一定条件（如使用特定的培养基，在温度30℃±1℃培养72h±3h等）下培养后，所得1g（mL）试样中所含细菌总数。
2 试剂与仪器2.1 所用器具三角烧瓶、玻璃珠、具塞试管、培养皿、1000μL枪头、5mL枪头、称量勺、接种环、接种针、移液器2.2 仪器：分析天平、恒温培养箱、微型振荡器、超净工作台、高压灭菌锅2.3 所用试剂和培养基营养琼脂取营养琼脂32.0g，加入蒸馏水1L，搅拌加热至完全溶解，分装三角瓶，121℃高压灭菌15min，备用。
3、操作步骤3.1配制0.85%生理盐水。
称取氯化钠8.5g溶于1000mL蒸馏水中。
3.2三角烧瓶加入生理盐水90mL和玻璃珠，试管中加入生理盐水9mL，121℃灭菌30min。
（三角烧瓶个数与样品数量一致，试管数量与稀释次数相关）3.3将1000μL枪头、培养皿、5mL枪头、称量勺，121℃灭菌30min。
（注意计算数量）3.4将枪头、培养皿置于烘箱103℃烘干。
（1-3步需提前一天完成）3.5对称量房间进行紫外灭菌30分钟，关灯静置60 min。
以无菌操作取样品10g于含90mL 生理盐水三角烧瓶中，于振荡器上振荡30min，制成1:10的均匀稀释液。
3.6用1000μL枪头吸取1:10稀释液1mL，沿管壁慢慢注入含有灭菌生理盐水9mL的试管中，于振荡器上混合均匀，制成1:100的均匀稀释液。
3.7另去一只1mL灭菌吸管，按照上述操作方法，作10倍递增稀释，如此每递增稀释一次，即更换一支灭菌吸头。
3.8选择2个~3个适宜稀释度，分别在作10倍递增稀释的同时，即以吸取该稀释的吸管移1mL稀释液于灭菌平皿内，每个稀释度作两个培养皿。
3.9稀释液移入培养皿后，及时将凉至46℃±1℃的培养基（可放置46℃±1℃水浴锅内保温）注入培养皿约15mL，小心转动培养皿使试样与培养基充分混匀（从稀释试样到倾注培.养时间不能超过30min）。
水环境卫生细菌学检测—细菌菌落总数的测定
2.2 平板涂布法
先制作平板；
取样品（无菌水）0பைடு நூலகம்1ml放入平板 上，涂抹棒均匀涂抹平板表面，直至 无残存样品（无菌水）；
翻转放置。
平板涂布
2. 3注意事项
保证无菌操作要求，同时注意不得影响样品中的微生物（培养基不得 太烫，取样时不要离火焰太近）；
制作平板时培养基不得沾附底面之外的侧面甚至盖上，未凝固前不得 翻转；
混匀器
四、接种培养
1.培养数量
不稀释样：样品、无菌水（无菌对照），共2 个培养，每个培养需培养3个平板（重复）；
需稀释样：最大稀释样及前两个稀释样、无 菌水，共4个培养，每个培养需培养3个平板 （重复）；
预先在培养皿底面标记清楚培养稀释度、操 作人、时间等信息。
培养皿标记
2. 接种平板
2.1 混合平板法
三、样品的稀释
主要针对样品中含较多微生物的水样（水源水、污水）；
自来水、饮用水一般不需稀释，可直接取样培养。
1. 分装无菌水 取数支无菌试管，标记10－1、10－2、……,每试管分装9ml无菌水 或无菌生理盐水。 （也可分装好后再灭菌）
稀释所需的数量级根据样品中微生物量的估计而定，一般轻度 污染水稀释到10－3，重度污染水可稀释到10－5、10－6。
对于不利于细菌生长的污染物，常需检测对应专门微生物及污染 物含量的直接检测。
二、稀释平板培养计数法
细菌的个体微小，直接观察、计数困难； 单个细菌经过培养可长成肉眼可见的菌落； 要设法避免多个细菌长成1个菌落，常需对 样品进行稀释处理。
稀释平板培养菌落
1.测定的程序：
样品稀释 接种平板 培养 菌落计数 报告
不同稀释度不得使用同一移液管，防止交叉影响及污染；
细菌总数的测定方法
细菌总数的测定方法
细菌总数的测定方法可真是太重要啦！它能让我们清楚地了解环境或样本中细菌的数量情况。
那具体是怎么操作的呢？首先要准备好培养基，比如常用的营养琼脂培养基。
然后就是采样啦，这可不能马虎，一定要保证采样的代表性和准确性。
接下来把样品进行适当稀释，这一步要细心哦，不然可就不准确啦！再把稀释后的样品接种到培养基上，要均匀分布哟！最后就是培养啦，在适宜的温度下培养一段时间。
这里要注意的是，操作过程一定要严格无菌，避免污染，不然结果就不准确咯！而且稀释度的选择也很关键呢，要根据实际情况合理选择。
在这个过程中，安全性那是相当重要的呀！毕竟是和细菌打交道嘛。
所有的操作都要在无菌环境下进行，保证操作人员不会受到细菌的侵害。
稳定性也不容忽视呢，只有保证每次操作的一致性，才能得到可靠的结果呀。
那细菌总数的测定方法都有哪些应用场景和优势呢？哇塞，那可多了去啦！在食品行业，可以检测食品的卫生状况，保障我们的食品安全，这难道不是超级重要的吗？在医疗卫生领域，可以监测环境的细菌污染情况，为疾病防控提供依据呢。
它的优势就在于简单易行、成本较低，而且能快速得到结果呀。
就拿食品生产企业来说吧，通过定期检测生产环境中的细菌总数，可以及时发现问题，采取措施改进生产工艺和卫生条件，从而避免食品安全问题的发生。
这不是实实在在的效果吗？
细菌总数的测定方法真的是非常实用且重要的呀！它能帮助我们更好地了解和控制细菌的存在，保障我们的生活和健康呢！。
细菌总数名词解释
细菌总数名词解释细菌总数，又称菌数，是指一个立方体内所含的细菌的总数。
细菌总数的计算方法为：以样本中所含菌数占总样本菌数的百分率表示，如每克干固体标本或每毫升液体标本中所含的菌数，即为细菌总数。
细菌总数常用每克（或毫升）干固体标本或每毫升（或毫升）液体标本中所含的细菌菌落数来表示，它表示某一个地区、某一环境中所有存在于固体或液体培养基上的细菌菌落总数。
同时细菌总数也可作为细菌学研究、细菌污染及医疗事业防疫措施的依据之一。
细菌总数测定仪器主要有光密度计和光计数管。
前者的读数原理为折射原理，后者的读数原理为散射原理。
在大多数情况下，当需要估计菌数总量时，可采用光密度计；如果需要测定浓度范围很宽的标本中的细菌菌数总量，则可采用光计数管。
但是在液体培养基中进行测定时，只能使用光密度计。
测定细菌总数的光密度计按结构特点又可分为自然光密度计和荧光显微镜两种。
光密度计有一套检测系统和计数系统。
它们一起保证了读数的准确性。
在使用光密度计测定细菌总数时，需对标本稀释成不同的稀释度，然后以一定的稀释度从标本中吸取适量的菌悬液，装入反应管内，加满冷凝管，使之与空气隔绝，在显微镜下进行计数。
由于菌悬液中各细菌的分布状态不一致，有些细菌密集在上层，而有些细菌则沉降到底部。
因此在使用光密度计测定总菌数时，应同时取几管混匀，以便观察。
在正常情况下，菌悬液经10— 20分钟就会被均匀分散开，这时可看到红色视野中出现许多白色小圆圈，或看到红色视野里有细小的圆形光亮区。
随着细菌总数的增加，红色视野中小圆圈的直径逐渐变小，红色视野逐渐缩小。
当菌数达到一定数量时，圆圈消失，变成无数小亮点，最后细胞集结成云雾状或团块状。
1、数值测定法用肉眼、光镜或低倍镜观察标本，计算在一定体积或重量的细菌菌体所占的百分比。
2、化学测定法用化学药品、酶制剂处理标本，通过颜色反应和显色反应来计数细菌菌体，有关细菌数量的计数单位还有个细胞，活菌数，活菌个数等。
测细菌总数方法
测细菌总数方法
1.把测量板完全浸入水样中10秒钟后拿起来，然后轻轻把测量板甩几下，不要
太用力，直到没有水滴流出，再把测量瓶内的水珠拭干（用滤纸），最后放入测量瓶中拧好，放进恒温箱内培养。
2.在恒温箱设定温度28℃时，恒温48小时（或设定温度36℃时，恒温24小时）
后拿出，通过比色图来测定细菌总数。
3.正常做细菌总数都不会出现问题，偶尔出现比色板上细菌一片或大块时，原
因可能是比色板有问题（需检查生产日期是否过期或有少量是质量不好的，多做几次找出原因）；浸入水样中的时间太长（需把水滴甩掉，表面不能有水滴流出）；测量瓶内水质没有拭干（用滤纸拭干）。
细菌总数的检验方法
细菌总数的检验方法1 试验器材: 样品、无菌水、制备好的营养琼脂培养基200 ml 装于三角瓶、装有三、四十粒玻璃珠的三角瓶一个、平板数套、1 ml 吸管、计数器、试管。
2. 试验步骤:2.1 在无菌条件下取样品10ml。
2.2 用1 ml灭菌吸管吸取1:10稀释液1ml ，置于9 ml灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内，振摇试管混匀成1:100稀释液。
2.3 另取1 ml灭菌吸管吸，按上述操作顺序作10倍递增稀释液，如此每递增稀释一次即换用1支1ml 灭菌吸管。
2.4 根据对样品的污染程度选择2到3个适宜的稀释度分别在作10倍递增稀释液的同时,即以吸取该稀释度的吸管,吸取1ml 稀释液，置于灭菌平板内，每个稀释度作2个平板。
2.5 稀释液移入平板后，立即将冷却至45°C的营养琼脂基约15 ml倾入平板中,并转动平板使混合均匀。
2.6待琼脂凝固后翻转平板,置于37°C 恒温培养箱内培养24小时或48小时，计算平板内菌落数目，将细菌菌落乘以稀释倍数，即得每毫升样品中所含菌落总数。
3 菌落计数方法:3.1 平板内菌落计数时，可用肉眼观察,必要时用放大镜。
3.2 在记下各菌落数后，求出同稀释度的各平板的平均数。
4 菌落计数的报告4.1平板菌落数的选择:选取菌落数在30到300之间的平板作为菌落数测定标准。
一个稀释度使用两个平板，应采用两个平板内的菌落平均数。
其中一个平板有较大片状菌落生长时。
不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数。
若片状菌落不到平板的一半，而其余部分又很均匀,则可计算半个平板后乘以2以代表全平板的菌落数。
4.2 稀释度的选择4.2.1 应选择平均菌落数在30到300之间的稀释度，乘以稀释倍数来报告它。
4.2.2 若有两个稀释度，其生长的菌落数均在30到300之间，应视二者之比如何来决定，若其比值小于2，应报告其平均数。
若大于2，则报告其中较小的数字。
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化妆品微生物标准检验方法细菌总数测定
执行标准：GB/T 7918--1987
细菌总数系指1g或1ml化妆品中所含的活菌数量。
测定细菌总数可用来判明化妆品被细菌污染的程度，以及生产单位所用的原料、工具设备、工艺流程、操作者的卫生状况，是对化妆品进行卫生学评价的综合依据。
细菌总数系指1g或1ml化妆品中所含的活菌数量。
测定细菌总数可用来判明化妆品被细菌污染的程度，以及生产单位所用的原料、工具设备、工艺流程、操作者的卫生状况，是对化妆品进行卫生学评价的综合依据。
本标准采用标准平板计数法。
1方法提要
化妆品中污染的细菌种类不同，每种细菌都有它一定的生理特性，培养时对营养要求，培养温度、培养时间、pH值、需氧性质等均有所不同。
在实际工作中，不可能做到满足所有菌的要求，因此所测定的结果，只包括在本方法所使用的条件下（在卵磷脂、吐温80营养琼脂上，于37℃培养48h）生长的一群嗜中温的需氧及兼性厌氧的细菌总数。
2培养基和试剂
2．1生理盐水：见GB 7918．1—87《化妆品微生物标准检验方法总则》。
2．2卵磷脂、吐温80-营养琼脂培养基
成分：蛋白胨20g
牛肉膏3g
氯化钠5g
琼脂15g
卵磷脂1g
吐温807g
蒸馏水1000ml
制法：先将卵磷脂加到少量蒸馏水中，加热溶解，加入吐温80将其它成分（除琼脂外）加到其余的蒸馏水中，溶解加入已溶解的卵磷脂、吐温80，混匀，调pH值为7．1～7．4，加入琼脂，121℃（15 lb）20min高压灭菌，储存于冷暗处备用。
3仪器
3．1锥形烧瓶。
3．2量筒。
3．3pH计或精密pH试纸。
3．4高压消毒锅。
3．5试管。
3．6灭菌平皿：直径9cm。
3．7灭菌刻度吸管：10ml、2ml、1ml。
3．8 酒精灯。
3．9恒温培养箱。
3．10放大镜。
4操作步骤
4．1用灭菌吸管吸取1∶10稀释的检样2ml，分别注入到两个灭菌平皿内，每皿1ml。
另取1ml注入到9ml灭菌生理盐水试管中（注意勿使吸管接触液面），更换一支吸管，并充分
混匀，使成1∶100稀释液。
吸取2ml，分别注入到两个灭菌平皿内，每皿1ml。
如样品含菌量高，还可再稀释成1∶1000，1∶10000，……等，每种稀释度应换1支吸管。
4．2将熔化并冷至45～50℃的卵磷脂、吐温80、营养琼脂培养基倾注平皿内，每皿约15ml，另倾注一个不加样品的灭菌空平皿，作空白对照。
随即转动平皿，使样品与培养基充分混合均匀，待琼脂凝固后，翻转平皿，置37℃培养箱内培养48h。
5菌落计数方法
先用肉眼观察，点数菌落数，然后再用放大5～10倍的放大镜检查，以防遗漏。
记下各平皿的菌落数后。
求出同一稀释度各平皿生长的平均菌落数。
若平皿中有连成片状的菌落或花点样菌落蔓延生长时，该平皿不宜计数。
若片状菌落不到平皿中的一半，而其余一半中菌落数分布又很均匀，则可将此半个平皿菌落计数后乘2，以代表全皿菌落数。
6菌落计数及报告方法
6．1首先选取平均菌落数在30～300之间的平皿，作为菌落总数测定的范围。
当只有一个稀释度的平均菌落数符合此范围时，即以该平皿菌落数乘其稀释倍数（见表中例1）。
6．2若有两个稀释度，其平均菌落数均在30～300个之间，则应求出两者菌落总数之比值来决定。
若其比值小于或等于2，应报告其平均数，若大于2则报告其中较小的菌落数（见表中例2及例3）。
6．3若所有稀释度的平均菌落数均大于300个，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之（见表中例4）。
6．4若所有稀释度的平均菌落数均少于30个，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之（见表中例5）。
6．5若所有稀释度的平均菌落数均不在30～300个之间，其中一个稀释度大于300个，而相邻的另一稀释度小于30个时，则以接近30或300的平均菌落数乘以稀释倍数报告之（见表中例6）。
6．6若所有的稀释度均无菌生长，报告数为每克或每毫升小于10个。
6．7菌落计数的报告，菌落数在10以内时，按实有数值报告之，大于100时，采用二位有效数字，在二位有效数字后面的数值，应以四舍五入法计算。
为了缩短数字后面零的个数，可用10的指数来表示（见下表报告方式栏）。
在报告菌落数为“不可计”时，应注明样品的稀释度。
细菌计数结果及报告方法
附加说明：
本标准由中国预防医学科学院环境卫生监测所归口。
本标准由“化妆品微生物标准检验方法”起草小组起草。
本标准主要起草人周淑玉。
本标准由中国预防医学科学院环境卫生监测所负责解释。