PCR技术及其应用

n 循环次数
重复30轮后 第4轮扩增 第5轮扩增 第6轮扩增 30=1,073,741,824 2 实际拷贝数=(1+x)
n X 平均效率,约为0.85 n 循环次数
Target Amplification
No. of
1 cycle = 2 Amplicon
No. Amplicon Copies of Target
End of the 1st PCR Cycle –
Results in two copies of target sequence
每完成一 个循环需 2～4分钟， 2～3小时 就能将待 扩目的基 因扩增放 大几百万 倍。
模板DNA 第1轮扩增 第2轮扩增
PCR的基本原理
理想拷贝数=2n
PCR反应条件 PCR过程 第3轮扩增 PCR的特点
三、PCR反应程序
（1）变性
使双链DNA解链为单链 95℃ 20-30秒
(2) 退火
温度由引物长度和GC含量决定。 增加温度能减少引物与模板的非特异性结合; 降低温度可增加反应的灵敏性。
（3）延伸
70-75 ℃ 延伸时间由扩增片段长度决定
（4）循环次数
主要取决于模版DNA的浓度 一般为25-35次 次数过多：扩增效率降低，错误掺入率增加
100
酶 80 活 性 60
40
(%)
20 40 50 60 70 80 90 100
温度(℃)
94℃
55℃
72℃
PCR循环
Kary B. Mullis <<The Unusual Origin of the Polymerase Chain Reaction>>
1989年美国《Science》杂志列PCR 为十余项重大科 学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年 Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。
Cycles
2 cycle = 4 Amplicon
1 2 3 4 5
2 4 8 16 32 64 1,048,576
3 cycle = 8 Amplicon
4 cycle = 16 Amplicon
5 cycle = 32 Amplicon
6 cycle = 64 Amplicon
6 20
7 cycle = 128 Amplicon
PCR反应中的注意事项
（一）防止污染
试剂小量分装 吸头及EP管一次性使用 器皿及工作区域要分开，无菌操作
（二）设立对照
阳性对照： 阴性对照： 阳性模板 阴性模板
试剂对照：
除模板外的所有组分
第八章 PCR技术及其应用
第二节 PCR产物的克隆
一、在PCR 产物两端添加限制性酶切位点
为了使 PCR 产物能够方便的装载到克隆载 体上，可在扩增的过程中在其两端添加限 制性酶切位点
④ Pwo DNA 聚合酶
Pwo DNA 聚合酶来自 Pyrococcus woesei （BM），大小为 90kDa ，由原德国宝灵曼公 司开发。 在 100℃ 的半衰期大于 2 小时，出错率低。是 使用较多的具有 3'-5' 外切活性的且具有高保真 度的 PCR 酶。
⑤ Pfu DNA 聚合酶
⑦引物的碱基顺序不能与非扩增区有同源性。
4. 模板
单、双链DNA均可。
不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑 制剂、DNA结合蛋白类。
用人类或哺乳动物基因组 DNA 进行扩增时， 一般使用 1μg DNA
以酵母菌、细菌、质粒和 M13 噬菌体噬菌斑 的 DNA 作模板时，分别需要 10ng，1ng，1pg 和 1% 噬菌斑。
PCR Cycle - Step 3 -
At 72 o C Taq DNA polymerase catalyses primer extension as complementary nucleotides are incorporated
③引物的延伸： DNA模板--引物 结合物在 TaqDNA聚合酶 的作用下，以 dNTP为反应原 料，靶序列为模 板，按碱基配对 与半保留复制原 理，合成一条新 的与模板DNA 链。
第八章 PCR技术及其应用
PCR技术的建立
① Khorana(1971)等提出在体外经 DNA变性,与适当引物杂交,再用 DNA聚合酶延伸,克隆DNA的设 想—―修复复制”
但由于测序和引物合成的困难，以 及70年代基因工程技术的发明使克 隆基因成为可能，所以，Khorana的 设想被人们遗忘了……
“我不大喜欢动手,我宁肯不动手,我不喜欢做费力的事。作为 一个发明家,重要的一点是为解决某些问题而尽力设计一个简 捷的动手方案。”这是PCR的发明者Mullis在1991年对《研究 与发展》杂志(R&D)记者说的一番话
第八章 PCR技术及其应用
第一节 PCR技术原理和 工作方式
一、PCR的基本原理
PCR Cycle - Step 1 - Denaturation Template DNA by Heat (95oC)
Target Sequence
Target Sequence
①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后， 使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成 为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；
5. DNA聚合酶
① Taq DNA 聚合酶
来自嗜热古细菌的嗜热水生菌（Thermus aquaticus）， Taq DNA 聚合酶分子量大小为 94kDa ，为单分子酶，在 75℃ 活性最强。 具有 5’-3’ 合成活性和 5’-3’ 外切活性 , 但是无 3’-5’ 外切活性。
由于没有 3'-5' 外切活性，在扩增过程中有 8.911x10 -5 的错配几率。
类似于DNA的体内复制
首先待扩增DNA• 板加热变性解链，随之将反 模 应混合物冷却至某一温度，这一温度可使引物 与它的靶序列发生退火，再将温度升高使退火 引物在DNA聚合酶作用下得以延伸 这种热变性-复性-延伸的过程就是一个PCR循 环，PCR就是在合适条件下的这种循环的不断 重复。
PCR原理示意图
有些缓冲液中还加入一些添加剂和共溶剂可降 低错配率，提高富含 G+C 模板的扩增效率。
Mg2+
Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。
Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量 下降； Mg2+过高影响反应特异性。 Mg2+可与负离子结合，所以反应体系中dNTP、 EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。 一般以 MgCl2 的形式提供，标准浓度为 1.5mM 。 Mg2+ 浓度的高低会影响扩增的特异 性和产率
②
1983年,Mullis发明了PCR技术,使Khorana的设想得到实现
Mullis的构思
引物
DNA聚合酶
DNA聚合酶
引物
特定DNA片段
94℃变性
50-65℃退火
XX℃延伸
94℃Βιβλιοθήκη 55℃37℃③1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技术
Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus)
在 95℃ 的半衰期为 40 分钟。 启动 PCR 反应的能力很强，聚合速度快，在 72℃ 的聚合速度为每秒 30-100 碱基。
② Tth DNA 聚合酶
Tth DNA 聚合酶来自嗜热热细菌（Thermus thermophilus）HB8 ，由 Promega 公司开发成商 品。 Tth DNA 聚合酶分子量为 94kDa ，在 74℃ 进 行扩增，在 95℃ 的半衰期为 20 分钟。 在 Mg2+ 存在条件下以 DNA 为模板合成 DNA ， 而在 MnCl2 存在下可以 RNA 为模板合成 cDNA 。
2. dNTP
脱氧核苷三磷酸是 DNA 合成的底物
标准的 PCR 反应体系中含有等摩尔浓度的 4 种 dNTP ，终浓度一般为 200mM（即饱和浓度） 浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则 降低反应产量
dNTP可与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度 下降，影响DNA聚合酶的活性。
3. 引物
③G/C和A/T碱基均匀分布， G+C含量在40～60% 之间，引物碱基序列尽可能选择碱基随机分布，避 免出现嘌呤或嘧啶连续排列。
④要避免两个引物间特别是3`末端碱基序列互补 以及同一引物自身3`末端碱基序列互补的，使它 们不能形成引物二聚体或发卡结构。 ⑤引物3`末端碱基一般应与模板DNA严格配对， 并且3`末端为G、C或T时引发效率较高。 ⑥引物5`末端碱基可不与模板DNA匹配，可添加 与模板无关的序列(如限制性核酸内切酶的识别序 列、ATG起始密码子或启动子序列等)，便于克隆 和表达，但其保护碱基有一定的要求。
因此可在高温下做 RT-PCR 、反转录和引物延伸 （primer extension）反应， 避免 RNA 反转录过程中 形成的二级结构。
③ Vent DNA 聚合酶
Vent DNA 聚合酶是从由火山口分离的嗜热球 菌 Thermococcus litoralis 中分离的第一个具有 3’-5’ 外切活性的高温 DNA 聚合酶，由 New England Blabs 公司开发出商品。 酶分子为 85kDa ，具有更长的半衰期，在 100℃（使用 MgSO4）时，其半衰期为 1.8 小 时。
Pfu DNA 聚合酶来自激烈热球菌 具有理想的扩增保真度，具有极高的热稳定性， 是目前使用最广泛的具有 3'-5' 外切活性的 PCR 酶。
⑥ 商用混合酶
为了提高扩增的保真度或扩增较长的 DNA 片 段，将 Taq DNA 聚合酶的强启动能力和具有 3'-5' 外切活性的高温 DNA 聚合酶的高持续活 性和校正功能结合起来，可以达到很好的效果。