PMA_qPCR定量检测畜禽肉类中沙门菌活菌的研究_於颖

引物与探针序列 3' ） 序列（ 5'产物长度（ bp） 284［6］ 144［7］
GTGAAATTATCGCCACGTTCGGGCAA TCATCGCACCGTCAAAGGAACC CGTTCTACATTGACAGAAT CGAACGTGGCGATAATTTC FAMCAACGTTTCCTGCGGTACTGTTAAT- TAMＲA CGGCAATAGCGTCACCTT AGTGCTCGTTTACGACCTG
。面对不断出现的食品安全问题， 对食
品中特别是畜禽肉类中的沙门菌进行准确 、 有效 地检测， 是控制这类食源性疾病发生并进行有效 预防和监测的重要条件。 目前， 许多分子检测技术如实时荧光定量聚
基金项目： 上海市卫生系统优秀学科带头人计划 （ 新百人计划） 资助项目（ XBＲ2011051 ） 作者简介： 於 1983 年生， 颖， 女， 硕士， 主管技师， 主要从事食品微生物与分子生物学检测， 现工作单位为上海市疾病预防控制中心。 627587101336 。 通讯作者： 王文静， 联系电话： 021-
考察该方法的灵敏性、 特异性， 并将该方法用于定量检测未经增菌培养的畜禽肉类样品中的沙门菌。结果 曲线， 在 PMA 浓度为 15 μg / mL、 曝光 5 min 的条件下可完全抑制样品中死菌 DNA 的扩增。建立的定量标准曲线循环阈
2 最低可检出 10 拷贝 / 反应体系。所建立的 PMA值（ Ct 值） 与质粒标准品模板的拷贝数呈良好线性关系（ r = 0． 997 9） ， 3 qPCＲ 方法最低可检出 21 拷贝 / μL 沙门菌。 采用 PMAqPCＲ 检测人工染菌鸡肉样品 ， 最低可检出 10 CFU / mL
表2 用途 PCＲ 引物与探针 IM832F IM832Ｒ qPCＲ invAF invAＲ invAP 质粒 invAS invAAS
［4 ］
PCＲ 仪（ 美国 Life Technologies 公司） 、 650 W 卤素 NanoDrop2000 核酸蛋白 灯 （ 德国 OSＲAM 公司 ） 、 。 仪［ 赛默飞世尔科技（ 上海） 有限公司］
二、 菌液制备 1． 沙门菌培养
95 ħ ， 10 min ） 致死， 冷却到室温， 制成死细胞菌 液； 取 1 mL 热处理后的菌液涂布在营养琼脂平皿 37 ħ 培养 24 h， 营养琼脂平皿上无菌生长。 三、 引物设计和探针制备 以沙门菌 invA 基因 （ GenBank： M90846． 1 ） 为 特异性基因， 由生工生物工程 （ 上海） 有限公司合 成引物和探针， 所采用的引物及探针序列见表 2。
检验医学 2015 年 5 月第 30 卷第 5 期
Laboratory Medicine，May 2015 ，Vol 30． No 5．
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且对 mＲNA 提取技术的要求非常高， 阻碍了在食 品样品检测中的应用。 因此， 在实际工作中仍依 赖传统培养法进行检测。 此外， 另一类处于活的 culturable，VBNC ） 状态 非可培养 （ viable but non的细菌 与普通细菌一样具有毒性和致病性， 使 因而对食品安 用传统的分离培养方法容易漏检， 全构成的威胁也不容忽视， 亟需改进检测方法， 对 其进行有效的检测。 PMA ） 叠 氮 溴 化 丙 锭 （ propidium monoazide， 是一种与核酸具有亲和性的光敏性染料 。它可穿 过死 亡 细 胞 的 破 损 细 胞 膜， 在强光的诱导下与 DNA 形成牢固的共价结合， 从而抑制 DNA 扩增； 同时， 游离的 PMA 可在强光作用下与溶液中的水 ［5 ］ PMA 分交联失活 。 活细胞具有完整的细胞膜， 不能透过细胞膜与 DNA 反应。我们利用 PMA 对 活 / 死细胞具有选择性的特性， 将 PMA 与 qPCＲ 相结合检测沙门菌， 对 PMA 作用于沙门菌的最佳 并应用于畜禽 曝光时间以及作用浓度进行摸索， 肉类样品。通过建立针对样品中活的沙门菌检测 规避原先检测方法中出现假阳性和漏检的 方法， 情况， 开发快速、 准确的活菌定量检测技术。 材料和方法 一、 材料和试剂 1． 试验菌 株 本 研 究 使 用 的 菌 株 见 表 1 。 ATCC 菌株购自美国标准生物品收藏中心， 其余 菌株为本实验室收集、 鉴定、 编号并保存的菌株。 2． 主要试剂和仪器 LB 培养液 （ 上海市疾 PMA （ 美国 病预防控制中心试剂供应研究中心 ） 、 Biotium 公司） 、 TaqMan Environmental Master Mix 2． 0 （ 美 国 Life Technologies 公 司 ） ； mericon DNA Bacteria Kit（ Qiagen 公司） 、 PCＲ Premix Taq TM 试剂 （ 日本 TaKaＲa 公司 ） 、 pMD TM 18T Vector Cloning Kit（ 日本 TaKaＲa 公司 ） 、 ABI 7900HT 荧 光 定 量
沙门菌。结论
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
qPCＲ 方法可实现定量检测畜禽肉类样品中活的沙门菌 ， 用 PMA从而达到快速检测的目的 。
关键词： 沙门菌； 活菌； 叠氮溴化丙啶； 荧光定量聚合酶链反应 ； 畜禽肉类 Ｒesearch on a quantitative method to detect viable Salmonella by PMAqPCＲ in livestock and poultry meat YU Ying1 ，WANG Wenjing2 ，LU Ye2 . Abstract： Objective Methods （ 1 ． College of Chemistry and Biochemistry，Donghua University，Shanghai 201620 ，China； 2 ． Shanghai Municipal Center for Disease Control and Prevention，Shanghai 200336 ，China） To enumerate Salmonella in meat of livestock and poultry rapidly and accurately by using propidium monoazide （ PMA ） combined with realtime fluorescence quantitation polymerase chain reaction （ qPCＲ ） ． The light exposure time and the concentration of PMA were optimized to establish PMAqPCＲ． The standard The amplification of DNA derived curve was established by standard plasmid． The sensitivity and specificity were investigated． This method was used for the quantitation determination of Salmonella in livestock and poultry meat． Ｒesults from Salmonella dead cells could be inhibited without affecting the viable cells when PMA was at a dose of 15 μg / mL and exposed for 5 min． The cycle threshold values （ Ct ） and standard plasmid model cell copy number presented the satisfactory linear，and the correlation coefficient r2 approached 0． 997 9． This method could detect as low as 10 copies / qPCＲ． In artificial chicken samples，PMAqPCＲ reaction． The minimum detection level was 21 copies / μL by PMAcould detect as low as 10 3 CFU / mL． Conclusions It was possible to quantify viable Salmonella in meat of livestock and poultry by PMAqPCＲ． Key words： Salmonella； Viable bacterium； Propidium monoazide； Ｒealtime fluorescence quantitation polymerase chain reaction； Livestock and poultry meat
取鼠伤寒沙门菌标准菌株 ATCC 14028 接种 LB 培养液， 置 37 ħ 培养至对数 生长期， 稀释后用营养琼脂平皿培养计数 ， 得到终
8 浓度为 6． 8 ˑ 10 CFU / mL 的纯菌液。 2． 死细胞菌液 将已调整浓度的纯菌液 （ 菌 8 液浓度为 6． 8 ˑ 10 CFU / mL ） 进行热处理 （ 水浴
PMAqPCＲ 定量检测畜禽肉类中沙门菌活菌的研究
1 2 2 颖 ， 王文静 ， 陆 晔 （ 1． 东华大学化学化工与生物工程学院 ， 上海 201620 ； 2． 上海市疾病预防控制中心， 上海 200336 ）
於
摘要： 目的 沙门菌。方法
将叠氮溴化丙锭（ PMA） 与实时荧光定量聚合酶链反应（ qPCＲ） 相结合定量检测畜禽肉类中活的 PMA 浓度等 PMA 作用条件， qPCＲ 方法， 通过优化光反应时间、 建立 PMA构建重组质粒建立标准
表1 类别 沙门菌 实验菌株 来源 ATCC 14028 ATCC 49214 ATCC 51329 ATCC 25922 ATCC 27853 ATCC 17802 ATCC 6538 ATCC 11060 Y1 88 总 6886 总 7585 总 18-