链霉菌702所产生物活性物质抑菌活性的初步研究

第24卷第6期江西农业大学学报(自然科学版)Vol.24,No.6 2002年12月ActaA griculturaeUniversitatisJian gxiensis Dec.,2002文章编号:1000-2286(2002)06-0829-04链霉菌702所产生物活性物质抑菌活性的初步研究黎循航,刘姝,涂国全(江西农业大学生物工程系,江西南昌330045)摘要:用无水乙醇分别从链霉菌702摇瓶发酵液的上清液和菌丝体中提取生物活性物质,然后分别对不同细菌、酵母菌和霉菌进行抑菌活性的测定。

上清液和菌丝体的乙醇提取液对蜡质芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、啤酒酵母、木霉、毛霉、黑曲霉均有较强的抑菌活性;上清液乙醇提取液仅对大肠杆菌、棉枯萎病菌有较强的抑菌活性,而菌丝体乙醇提取液对上述两菌无抑菌活性;上清液乙醇提取液对苏云金芽孢杆菌的最低抑菌作用浓度为将其提取液稀释至625倍;上清液乙醇提取液在100℃下加热处理60min对苏云金芽孢杆菌的抑菌活性不变,证明该菌所产生物活性物质对热稳定。

关键词:链霉菌702;发酵;抑菌活性中图分类号:Q935 文献标识码:AAPreliminar yStud yontheAntibacterialActionoftheBioactiveCom poundProducedb y Stre ptomyces702LIXun-han g,LIUShu,TUGuo-quan(DepartmentoftheBioen gineerin g,JAU,Nanchan g330045,China) Abstract:Theantibio gramsofthebioactivecom poundobtainedfromthesu pernatantandm ycelialof Stre ptom yces702’sfermentedbrothweretested.Thebioactivecom poundfromthesu pernatanthasan2 tibacterialactionon Stro phlococcus aureus,Bacillus cereus,Bacillus subtilis,Bacillus thurin gensis, Saccharom yces cerevisiae,Trichoderma viride,As pergillus ni ger,Mucor sp.,Escherichia.coli and Fusarium vasin fectum;andb yex periment,theminimalinhibitor yconcentationofbioactivecom pound fromthesu pernatanton Bacillus thurin gensis isitsdilutionof625×,andthebioactivecom poundisheat-stableeventreatedb y100℃for60min.Thebioactivecom poundfromthem ycerialhasantibacterialaction on Stro phlococcus aureus,Bacillus cereus,Bacillus subtilis,Bacillus thurin gensis,Saccharom yces cere2 visiae,Trichoderma viride,As pergillus ni ger and Mucor sp..Ke ywords:Stre ptom yces702;fermentation;antibacterialaction江西农业大学生物工程系应用微生物研究室在进行农用抗生素产生菌的分离筛选研究中,以棉花枯萎病菌为靶目标作为筛选模型,从土壤中分离筛选到一株链霉菌,编号为702(简称链霉菌702),其产生物活性物质对棉花枯萎病菌有较强抑菌活性。

在进一步测定它的抗菌谱时,发现该菌所产生物活性物质不仅对霉菌、丝状真菌有较强抑菌作用,而且对酵母菌类、革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌均有不收稿日期:2002-08-05作者简介:黎循航(1978-),男,助教,从事菌种选育及发酵研究同程度的抑菌作用,并且该菌所产生物活性物质对热较稳定,在沸水中加热30min 和60min 后其抑菌活性不减,本文初步报道其研究结果。

1　材料和方法1.1　材料1.1.1　供试菌株　链霉菌702(Stre ptom yces 702):由江西农业大学应用微生物研究室分离筛选获得,甘油冻存管保存。

抗菌测定指示菌:均由江西农业大学应用微生物研究室保存提供。

(1)霉菌类:绿色木霉(Trichoderma viride )、黑曲霉(As per gillus ni ger )、毛霉(Mucor sp.)、棉花枯萎病菌(Fusarium vasin fectum )。

(2)细菌类:蜡质芽孢杆菌(Bacillus cereus )、金黄色葡萄球菌(Stro phlococcus aureus )、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis )、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thurin gensis )、大肠杆菌(Escherichia .coli )。

(3)酵母菌类:啤酒酵母(Saccharom yces cerevisiae )。

1.1.2　培养基　斜面培养基和平板培养基:牛肉膏蛋白胨培养基[1];高氏培养基[1];PDA 培养基[1]。

摇瓶发酵培养基:玉米淀粉4.0%、玉米粉0.5%、工业葡萄糖0.1%、麦芽粉2.0%、黄豆粉0.5%、工业蛋白胨0.5%、NaCl0.3%、KH 2PO 40.03%、FeSO 40.004%、CaCO 30.5%、MnCl 20.004%、豆油0.5%、自来水100mL 、消毒前pH8.0。

1.2　方法1.2.1　链霉菌702培养基和生物活性物质粗提物的制备　(1)斜面培养基:将链霉菌702的孢子接种高氏斜面和茄子瓶平板上,30℃培养7～8d 。

斜面及平板表面孢子呈淡灰色,孢子丰满,培养基内有金黄色产生。

(2)摇瓶发酵:在250mL 三角瓶中盛30mL 摇瓶培养基,接种链霉菌702茄子瓶菌块,置于30℃下200r/min 摇瓶培养120h 。

(3)生物活性物质粗提物的制备:取链霉菌702120h发酵液50mL,3500r/min 离心10min 。

上清液加等体积无水乙醇即为702生物活性物质上清液粗提物。

滤饼用蒸馏水水洗两次离心,弃去上清液,滤饼加无水乙醇至还原到发酵液体积,浸泡1h 后,3500r/min 离心10min,取上清液即702生物活性物质菌丝体粗提物。

分别取此两种粗提物用蒸馏水适当稀释进行抑菌作用的测定,同时以相同乙醇水溶液作对照。

1.2.2　指示菌的培养和含菌平板的制备　(1)细菌指示菌的培养和含菌平板的制备:将大肠杆菌、蜡质芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌分别转接到牛肉膏蛋白胨斜面培养基上,37℃培养4d 。

每支斜面培养物各用20mL 无菌水洗下菌苔倒入50mL 带玻璃珠的三角瓶中振荡20min,即成菌悬液。

取煮溶并冷至45℃左右牛肉膏蛋白胨培养基,每100mL 培养基分别加入1mL 上述不同细菌的菌悬液摇匀后,各倒入5个平板,即制成含菌平板。

(2)酵母菌指示菌的培养和含菌平板的制备:将啤酒酵母菌转接到PDA 斜面培养基,28℃培养4d 。

菌悬液和含菌平板的制备除采用PDA 培养基外,其制备方法同上。

(3)霉菌孢子的培养和含菌平板的制备:分别将木霉、黑曲霉、毛霉的孢子转接至PDA 斜面培养基上,28℃培养4d 。

待孢子长丰满后,每支斜面用20mL 无菌水洗下孢子倒入50mL 带玻璃珠的三角瓶中振荡20min,即成孢子悬液。

分别取已溶化的PDA 培养基倒成平板20mL/皿,凝固成PDA 平板,每个平板分别吸0.1mL 孢子悬液,涂布均匀,即成含孢子平板。

(4)棉花枯萎病菌的培养:取棉花枯萎病菌的菌丝转接到PDA 斜面及PDA 平板上,28℃培养至白菌丝长满斜面及平板表面,取平板边缘的白色菌丝,用无菌打孔器将菌块打成圆形菌块。

1.2.3　抑菌测定　702生物活性物质粗提液抑菌测定采用不同含菌平板上放不锈钢牛津杯,然后在牛津杯内用滴管分别加不同稀释度的702生物活性物质粗提液后在净化工作台上吹2～3h,待牛津杯内的试验液已基本吹干,盖上皿盖,按不同指示菌的培养温度分别培养1～4d,分别用游标卡尺测定其抑菌圈直径大小。

・038・　江西农业大学学报(自然科学版)第24卷表1　702生物活性物质粗提物对细菌、霉菌、酵母菌和棉枯萎病菌抑菌作用测定结果供试菌株名称抑菌圈直径/mm上清液无水乙醇浸提液菌丝体无水乙醇浸提液蜡质芽孢杆菌31.3529.68大肠杆菌17.64-金黄色葡萄球菌30.934.31枯草芽孢杆菌26.1626.38苏云金芽孢杆菌32.0329.69啤酒酵母20.7117.92木霉16.5112.96毛霉22.7918.09黑曲霉25.7619.71棉花枯萎病菌21.55-50%乙醇液对照-80%乙醇液对照-图1　黑曲霉抑菌圈　图2　毛霉抑菌圈 图3　棉花枯萎病菌抑菌圈图4　啤酒酵母抑菌圈 图5　木霉抑菌圈　图6　苏云金芽孢杆菌抑菌圈 棉枯萎病菌的抑菌测定,在PDA 平板上的牛津杯内滴加试验液后,在牛津杯周围空间放置棉枯萎病菌的菌块,28℃培养4～6d,待菌丝长成片后,测定其抑菌圈直径。

1.2.4　702生物活性物质最低抑菌浓度的测定　将702生物活性物质上清液乙醇提取液,用蒸馏水按5n (n =1、2、3、4、5)次方倍进行稀释,分别在苏云金芽孢杆菌和棉枯萎病菌的平板进行抑菌测定。

1.2.5　702生物活性物质对热稳定性抑菌测定　取链霉菌702菌摇瓶发酵上清液乙醇提取液分别置于30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃下分别维持30min 和60min 后,其不同温度不同处理时间的处理液在含苏云金芽孢杆菌的平板用牛津杯进行抑菌活性测定。

2　结果和分析2.1　702生物活性物质对细菌、霉菌和酵母菌的抑菌作用链霉菌702所产生物活性物质粗提物对细菌、霉菌、酵母菌和棉枯萎病菌抑菌作用分别见表1和图1、图2、图3、图4、图5、图6。

・138・第6期黎循航等:链霉菌702所产生物活性物质抑菌活性的初步研究表2　702生物活性物质对苏云金芽孢杆菌和 棉花枯萎病菌最低抑菌浓度测定结果稀释倍数抑菌圈直径/mm苏云金芽孢杆菌棉花枯萎病病菌032.0321.55528.04-2528.20-12515.08-62511.53-3125--表3　702生物活性物质对热稳定性测定结果处理温度/℃对苏云金芽孢杆菌的抑菌圈直径/mm 处理30min 重复一重复二平均处理60min 重复一重复二平均30(CK )22.4622.4622.4623.7023.7023.704022.3422.3422.3425.7223.2624.495023.7623.7623.7622.8023.7623.286023.3623.2223.2923.5424.1023.827024.3424.3824.3624.4424.8024.628022.5222.5222.5224.9624.3224.649024.5623.9224.2427.2024.2425.7210024.3224.3224.3222.8624.3423.60 根据表1和图1～6的测定结果表明,链霉菌702所产生物活性物质的上清液乙醇提取液和菌丝体乙醇提取液分别对供试的蜡质芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、啤酒酵母、木霉、黑曲霉、毛霉均有较强的抑菌作用,而仅有上清液乙醇提取液对大肠杆菌、棉花枯萎病菌有抑菌作用,菌丝体乙醇提取液对此二种菌无作用。