食品中微生物细菌总数的测定
食品中微生物细菌总数的测定
一、实验目的
1学习并掌握细菌的分离和活菌计数的基本方法和原理；
2了解菌落总数测定在对被样品进行卫生学评价中的意义。
二、实验原理
菌落总数是指食品经过处理，在一定条件下培养后，所得1g或1ml检样中所含细菌菌落总数。
菌落总数主要作为判别食品被污染程度的标志，也可以应用这一方法观察细菌在食品中繁殖的动态，以便对被检样品进行卫生学评价时提供依据。
菌落总数并不表示样品中实际存在的所有细菌总数，菌落总数并不能区分其中细菌的种类，所以有时被称为杂菌数，需氧菌数等。
三、器材
食品检样营养琼脂培养基无菌生理盐水无菌培养皿，无菌移液管酒精灯等。
四、实验步骤
1取样、稀释和培养
1.1以无菌操作取检样25g（或ml），放于225mL灭菌生理盐水的灭菌玻璃瓶内（瓶内预置适量的玻璃珠）或灭菌乳钵内，经充分振要或研磨制成1:10的均匀稀释液。
固体检样在加入稀释液后，最好置灭菌均质器中以8000～10000r/min的速度处理1min，制成1:10的均匀稀释液。
1.2用1ml灭菌吸管吸取1:10稀释液1ml，沿管壁徐徐注入含有9ml 灭菌生理盐水的试管内，振摇试管混合均匀，制成1:100的稀释液。
1.3另取1ml灭菌吸管，按上项操作顺序，制10倍递增稀释液，如此每递增稀释一次即换用1支10ml吸管。
1.4根据标准要求或对污染情况的估计，选择2～3个适宜稀释度，分别在制作10倍递增稀释的同时，以吸取该稀释度的吸管移取1ml 稀释液于灭菌平皿中，每个稀释度做两个平皿。
1.5稀释液移入平皿后，将凉至46℃营养琼脂培养基注入平皿约
15ml，并转动平皿，混合均匀。
同时将营养琼脂培养基倾入加有1ml 稀释液（不含样品）的灭菌平皿内作空白对照。
1.6待琼脂凝固后，翻转平板，置36±1℃温箱内培养48±2h，取出计算平板内菌落数目，乘以稀释倍数，即得每克（每毫升）样品所含菌落总数。
2菌落计数方法
作平皿菌落计数时，可用肉眼观察，必要时用放大镜检查，以防遗漏。
在记下各平皿的菌落总数后，求出同稀释度的各平皿平均菌落数。
到达规定培养时间，应立即计数。
如果不能立即计数，应将平板放置于0－4℃，但不要超过24h。
3菌落计数报告方法
3.1平皿菌落数的选择
选取菌落数在30～300之间的平皿作为菌落总数测定标准。
每一个稀释度应采用两个平皿平均数，其中一个平皿有较大片状菌落生长
时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平皿作为该稀释度的菌落数，若片状菌落不到平皿的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，则可以计算半个平皿后乘以2以代表全皿菌落数。
3.2稀释度的选择
1)应选取平均菌落数在30～300之间的稀释度报告
2)若有二个稀释度均在30～300之间时，应以二者比值决定，比值≤2取平均数，比值>2则其较小数字
3)若所有稀释度均>300，则取最高稀释度的平均菌落数乘以稀释倍数报告之
4)若所有稀释度均<30，则以最低稀释度的平均菌落数乘稀释倍数报告之
5)若所有稀释度均无菌落生长，则应按<1乘以最低稀释倍数报告之
6)若所有稀释度均不在30～300之间，有的>300，有的又<30，则应以最接近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数报告之
3.4菌落计数报告方法
菌落数在1～100时，按实有数字报告，如大于100时，则报告前面两位有效数字，第三位数按四舍五入计算，为了缩短数字后面的零数，也可以10的指数表示。
五、结果记录
1将实验测出的样品数据以报表方式报告结果。
2对样品菌落总数作出是否符合卫生要求的结论。
六、思考
1食品检验为什么要测定细菌菌落总数？
2实验操作如何使数据可靠？
3食品中检出的菌落总数是否代表该食品上的所有细菌数？为什么？
4为什么营养琼脂培养基在使用前要保持在46±1℃的温度？。
实验三--食品中微生物菌落总数的测定
5、及时将已冷却到46℃的培养基倾入到平皿中，并转动
平皿使其混合均匀
6、37℃倒置培养2天
7、按照计数Biblioteka 则计数五、菌落计数方法 选取菌落数在30~300cfu之间，无蔓延生长的平板 计数 低于30的记录具体菌落数，大于300的可记录为多 不可计，每个稀释度采用2个平行的均数 有较大片状菌落生长者不宜采用， 若片状小于平板一半时且余部均 匀分布，则以半个平板菌落数2 倍报告 无明显界限链状菌落每条单链视 为一个菌落
1、计数结果的表述
若只有一个稀释度平板在30~300CFU，则计算两平行平 板的均数，再乘以稀释倍数报告之 若有连续两个稀释度符合计数要求则按下公式：
所有符合计数要求 的平板菌落数之和
菌落总数
例：10-2=232，244 10-3=33，35 N= (232+244+33+35) (2+2×0.1)×10-2 = 24727
灭菌生理盐水当中，充分振荡，混合均匀，制成
10-1稀释度样品
2、梯度稀释法依次稀释样品到10-4
菌落总数操作流程图
3、选择10-2、10-3、10-4三个稀释度的样品均液，用无菌 移液管分别吸取1mL到无菌平皿中，每个稀释度做2个 平皿；同时，吸取1mL无菌生理盐水到1个平皿中作为
空白对照
4、熔化培养基
标准平皿活菌计数法（SPC法）是最常用的活菌计
数法
将微生物细胞充分稀释到单个分散，把这些单个分
散的细胞通过混菌法或涂布法使其均匀分布在平皿
培养基上，培养后长出的菌落肉眼可见，每个菌落
都由原液中单个细胞发育而来。
反映食品被细菌污染的程度
由于倾注平板法的局限，会有一部分细菌在该实验
GB 4789.2-94 菌落总数测定
中华人民共和国国家标准食品卫生微生物学检验 GB 4789.2-94菌落总数测定代替 GB 4789.2-84Microbiological examination of food hygiene Detectionof aerobic bacterial count───────────────────────────────────────1 主题内容与适用范围本标准规定了食品中菌落总数的测定方法。
本标准适用于食品中菌落总数的测定。
2 术语菌落总数是指食品检样经过处理,在一定条件下培养后(如培基成分、培养温度和时间、pH、需氧性质等),所得1mL(g)检样中所含菌落的总数。
本方法规定的培养条件下所得结果,只包括一群在营养琼脂上生长发育的嗜中温性需氧的菌落总数。
菌落总数主要作为判定食品被污染程度的标志,也可以应用这一方法观察细菌在食品中繁殖的动态,以便对被检样品进行卫生学评价时提供依据。
3 引用标准GB 4789.28 食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂4 设备和材料4.1 温箱：36±1℃。
4.2 冰箱：0～4℃。
4.3 恒温水浴：46±1℃。
4.4 天平。
4.5 电炉。
4.6 吸管。
4.7 广口瓶或三角瓶：容量为500mL。
4.8 玻璃珠：直径约5mm。
4.9 平皿：直径为90mm。
4.10 试管。
4.11 放大镜。
4.12 菌落计数器。
4.13 酒精灯。
4.14 均质器或乳钵。
4.15 试管架。
4.16 灭菌刀或剪子。
4.17 灭菌镊子。
5 培养基和试剂5.1 营养琼脂培养基：按GB 4789.28中4.7规定。
5.2 磷酸盐缓冲稀释液：按GB 4789.28中3.22规定。
5.3 生理盐水。
5.4 75％乙醇。
6 检验程序菌落总数的检验程序如下。
┌─────┐│检样│└─────┘↓┌─────────────┐│做成几个适当倍数的稀释液│└─────────────┘↓┌──────────────┐│选择2～3个适宜稀释度││各以1mL分别加入灭菌平皿内│└──────────────┘↓┌─────────────┐│每皿内加入适量营养琼脂│└─────────────┘36±1℃↓48±2h┌─────┐│菌落计数│└─────┘↓┌──────┐│报告│└──────┘7 操作步骤7.1 检样稀释及培养7.1.1 以无菌操作,将检样25g(或mL)剪碎放于含有225mL灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内(瓶内预置适当数量的玻璃珠)或灭菌乳钵内,经充分振摇或研磨做成1∶10的均匀稀释液。
细菌总数测定方法
细菌总数测定方法细菌总数测定是一种用来确定给定样品中存在的细菌总数量的方法。
在微生物学和生化学领域中，细菌总数的准确测量对于研究微生物活动、食品安全、健康和环境健康等方面非常重要。
下面将详细介绍细菌总数测定方法的原理、步骤和常用技术。
1. 细菌总数测定的原理：细菌总数测定的原理基于细菌的生长和繁殖特性。
在适宜的培养条件下，细菌会通过二分裂等方式进行繁殖。
通过培养基的可见菌落计数或显微镜下的细胞计数，可以得出给定样品中的细菌总数。
2. 细菌总数测定的步骤：（1）制备培养基：根据需要培养的细菌类型选择适宜的培养基，如普通营养琼脂培养基（Nutrient Agar）、肉汤葡萄糖琼脂培养基（Tryptone Glucose Yeast Extract Agar）等。
制备过程中要注意无菌操作，以避免外源性细菌的污染。
（2）样品制备：将待测样品适当稀释，以使细菌总数在可计数范围内。
稀释液可以选择生理盐水、磷酸盐缓冲液等。
（3）接种培养：将稀释好的样品分别接种在含有适宜培养基的琼脂平板上。
通过平板接种法或涂布法使细菌均匀分布于琼脂表面。
（4）培养条件控制：将接种好的琼脂平板放入恒温培养箱中，在适宜的温度和湿度下培养。
常见的培养温度为37，培养时间根据细菌类型和繁殖速度确定，通常为18-24小时。
（5）细菌计数：培养一段时间后，通过可见菌落计数或显微镜下的细胞计数确定细菌总数。
对于可见菌落计数，需要计算样品中每个可区分的菌落单元数。
对于显微镜下的细胞计数，可以使用像计数室或显微镜装置来准确计数细菌。
3. 常用细菌总数测定技术：（1）可见菌落计数法（plate count method）: 将稀释好的样品通过平板接种法均匀播种在琼脂平板上，通过培养后可见菌落数来确定细菌总数。
这是一种简单、常用的方法，适用于可培养的细菌。
（2）显微镜计数法(microscopic count method)：通过显微镜下观察直接计数细菌细胞数来确定细菌浓度。
食品微生物学检验菌落总数测定
食品微生物学检验菌落总数测定一、定义菌落总数是指样品经过处理，在一定条件下培养后(如培养基成分、培养温度和时光、pH、需氧性质等)，所得1mL(g)检样中形成的微生物菌落总数。
菌落总数不等同于细菌总数，有两方面的缘由：一方面，每种细菌生长时对环境条件的要求都不太一样，如厌氧菌和嗜冷菌在菌落总数测定条件下难以生长繁殖，有特别养分要求的一些细菌也受到了限制，因此，所得的结果，只反映一群在一般养分琼脂中发育的、嗜温的、需氧和兼性厌氧的细菌菌落的总数。
另一方面，细菌细胞是以单个、成双、链状、葡萄状或成堆的形式存在，因而在平板上浮现的菌落可能来源于单个细胞，也可能来源于细胞块。
二、卫生学意义菌落总数是食品卫生指标中的重要项目，主要作为判定食品被污染程度的标记。
通常认为，食品中菌落总数越多，被致病菌污染的可能性越大。
菌落总数的多少在一定程度上标记着食品卫生质量的优劣，但不能单凭菌落总数一项指标来评定食品卫生质量的优劣，必需协作大肠菌群和致病菌项目的检验，才干做出比较全面精确的评价。
三、检验办法根据GB4789.2-2016举行，标准规定了食品中菌落总数(aerobic plate count)的测定办法。
菌落总数的检验程序见图4-4。
图4-4菌落总数的检验程序四、注重事项 (1)要有“无菌操作”的概念。
所用玻璃器皿必需是彻低灭菌的，剪刀、镊子等器具要举行消毒处理，假如样品有包装，应用70%在包装开口处擦拭后取样，全部操作应该在超净工作台或经过消毒处理的无菌室中举行。
(2)应注重取样的代表性，液体样品取样前须先振摇，固体样品取样时宜多采几个部位，不要集中于一点。
(3)稀释液可选用灭菌生理盐水、蒸馏水或蛋白胨水(1g/L)，蛋白胨水最为合适，由于蛋白胨水对细菌细胞有更好的庇护作用。
假如对含盐量较高的样品举行稀释，则宜采纳蒸馏水。
(4)在做10倍递增稀释时，吸管或吸头插入样品匀液内不能低于液面2.5cm，以防吸管或吸头从稀释液内取出时有过多的液体黏附于管外。
食品卫生微生物学检验菌落总数测定
整理课件
4.7.2 制法 将除琼脂以外的各成分溶解于蒸馏水内，加入
15 %氢氧化钠溶液约2mL，校正pH至7.2 ～7.4 。 加入琼脂，加热煮沸，使琼脂溶化。分装烧瓶， 121℃高压灭菌15 min 。 注：此培养基可供一般细菌培养之用，可倾注平板 或制成斜面。如用于菌落计数，琼脂量为 1.5 ％； 如作成平板或斜面，则应为2％。
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5.2 磷酸盐缓冲液：按GB/T 4789.28 — 2003 中 3.22 规定
磷酸二氢钾 1mol/L氢氧化钠溶液 蒸馏水 pH 7.2
34 g 175 mL 825 mL
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制法： 先将磷酸盐溶解于 500 mL蒸馏水中，用
1mol/L 氢氧化钠溶液校正pH后，再用蒸馏水稀 释至 1000 mL。 稀释液：取储存液 1.25 mL，用蒸馏水稀释至 1000 mL。分装每瓶 100 mL 或每管 10 mL， 121 ℃ 高压灭菌 15 min。 5.3 0.85 %灭菌生理盐水 5.4 75 %乙醇
固体检样在加入稀释液后，最好置均质器中 以8000～10000 r/min的速度处理 1 min，做成 1：10的均匀稀释液。
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7.1.2 用 1 mL灭菌吸管吸取 1：10稀释液 1 mL， 沿管壁徐徐注入含有 9 mL灭菌生理盐水或其 他稀释液的试管内（注意吸管尖端不要触及管 内稀释液），振摇试管，混合均匀，做成 1： 100 的稀释液。
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7.2 菌落计数方法 做平板菌落计数时，可用肉眼观察，必要
时用放大镜检查，以防遗漏。在记下各平板的 菌落数后，求出同稀释度的各平板平均菌落总 数。 注： 到达规定培养时间，应立即计数。如果不 能立即计数，应将平板放置于 0－4 ℃，但不 得超过 24 h。
菌落总数测定
（（一一））、、样样品品的稀稀释释及及做做平平板板
6、及时将15 mL～20 mL 冷却至46 ℃ 的平板计数琼脂培养基（可放置于 46 ℃±1 ℃恒温水浴箱中保温）倾 注平皿，并转动平皿使其混合均匀。
1ml 1ml 1ml
生理盐 水
1:10
1:100 1:1000 1:10000
1ml
25g/m 1ml
食品中菌落总数的测定
一、菌落总数
• 食品检样经过处理，在一定条件下 （如培养基、培养温度和培养时间等） 培养后，所得每g（mL）检样中形成的 微生物菌落总数。
二、菌落总数测定的意义
1、判定食品被细菌污染的程度及卫生质量。 2、预测食品存用的期限长短。 3、了解细菌在食品中的繁殖动态。
三、设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设 备和材料如下：
• 恒温培养箱：36 ℃±1 ℃，30 ℃±1 ℃。 • 冰箱：2 ℃～5 ℃。 • 恒温水浴箱：46 ℃±1 ℃。 • 天平：感量为0.1 g。 • 均质器。 • 振荡器。 • 无菌吸管：1 mL（具0.01 mL 刻度）、10 mL（具0.1
4、上述 操作程序，制备10 倍系列稀释样品 匀液。每递增稀释一次，换用1 次1 mL 无 菌吸管或吸头。
（（一一）、、样样品品的的稀稀释释及及做做平平板 板
5、根据对样品污染状况的估计，选择2 个～3 个适宜稀释度的样品匀液（液体样 品可包括原液），在进行10 倍递增稀释 时，吸取1 mL 样品匀液于无菌平皿内， 每个稀释度做两个平皿。同时，分别吸 取1 mL 空白稀释液加入两个无菌平皿内 作空白对照。
性选择培养温度和时间？
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(四)、检验注意事项
1、对照平板出现几个菌落时，要追加对照 平板；
菌落总数检测标准
菌落总数检测标准
菌落总数检测是一种常见的微生指标检测方法用于评估食品、饮用水、医疗器械等物品中的微生物污染情况。
检测的菌落总一般采用生物计数法，即推测细菌总数的检验方法。
不同国家和地区可能有不同的标准和规定，但通常微生物指标检测标准的结构都是相对类似的，包括菌落总数、大肠埃希氏菌、霉菌、酵母菌等项目。
这些标准涉及了食品安全、饮用水卫生、医疗器械清洁等方面。
以下是一些常见的菌落总数检测标准：
1. 食品行业：根据《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数的测定GB 4789.2-2016》，菌落总数检测的标准上限值因不同食品类别而有所不同。
2. 饮用水行业：根据《生活饮用水卫生标准GB 5749-2006》，每毫升饮用水中的菌落总数应低于100个。
3. 医疗器械清洁行业：医用器械清洁标准如ISO 15883等对菌落总数也有相关的规定。
需要注意的是，具体标准和检测方法可能因国家、行业、用途等
而异，建议根据具体情况查询相关标准以获取最准确的信息。
探究食品微生物检验中菌落总数测定的注意事项
探究食品微生物检验中菌落总数测定的注意事项1.样品密闭保存在取样过程中，要尽量避免空气等外界因素的影响，样品必须密闭保存。
一般样品应当在到达实验室后尽快进行检验，以免样品受外界影响导致结果不准确。
如果无法及时检验，则可以将样品冷藏或者冷冻，但是也需要注意将样品密封好，以避免外界细菌的污染。
2.采样量的重视采样量对于总菌落数的测定是非常重要的。
一般情况下，菌落总数的测定一般要求采样量在1-5g之间，但是如果样品比较稀疏，则需要增加采样量，以确保菌落总数的准确性。
另外，在进行样品采集的时候，需要使用无菌工具，并且避免手部与样品接触，以免造成样品的污染。
3.温度和时间的掌控细菌的生长繁殖受到温度和时间的影响，针对食品微生物检验中菌落总数测定，也需要掌控恰当的温度和时间，以获得准确可靠的结果。
通常情况下，菌落总数的测定需要在30°C ± 1°C的温度下进行，持续48个小时，如果菌落总数比较高，则可以适当延长测定时间，但是通常测定时间不应当超过48小时。
4.选择合适的培养基依据不同的食品种类和样品的特性，需要选择合适的培养基，以保证菌落总数的测定准确可靠。
在选择培养基的时候，需要考虑菌落总数测定的灵敏度和特异性，并且需要注意培养基的配制和保存条件，以避免培养基失效。
5.样品的处理和消毒在进行食品微生物检验中，样品的处理和消毒是非常重要的，以避免外界因素的干扰。
通常情况下，需要用适当的方法对样品进行消毒和处理，并确保采样和样品处理的全过程无菌操作。
如样品含有硬壳，应先将其表面用肥皂水清洗干净，并用70%的酒精或经消毒的火柴棒或火烤器在表面进行消毒。
如果样品是炊后食品，可用蒸汽或高压杀菌，使其达到消毒的效果。
如果样品含有高浓度的盐、糖或醋等食品添加剂，需要在消毒前进行浓度调整，以确保检验的准确性。
总之，食品微生物检验中菌落总数的测定需要全过程无菌操作，以确保样品不受外界因素的影响，并且需要在采样、培养基选择、样品处理和等方面注意细节，以保证检验结果的准确、可靠、科学和客观。
食品中细菌总数及大肠菌群值的检测
大肠菌群的检测方法
MPN法
通过检测食品样品中大肠菌群的代谢产物来判断是否存在大肠菌群， 该方法适用于大量样品的快速筛选。
滤膜法
将食品样品通过滤膜过滤，然后将滤膜放在选择性培养基上培养， 观察是否有大肠菌群生长，从而判断是否存在大肠菌群。
纸片法
使用含有选择性试剂的纸片与食品样品接触，如果存在大肠菌群，纸 片会变色，从而判断出大肠菌群的存在。
PART 06
结论和建议
REPORTING
WENKU DESIGN
结论总结
01
食品中细菌总数及大肠菌群值是衡量食品卫生质量的重要指标， 通过对不同食品的检测，发现部分食品中细菌总数及大肠菌群值 存在超标现象，表明部分食品卫生质量较差，可能对消费者健康 造成潜在威胁。
02
在不同种类的食品中，细菌总数和大肠菌群值的超标率存 在差异，可能与食品生产、加工、储存、运输等环节的卫 生条件和管理有关。
03
食品中细菌总数及大肠菌群值的检测结果可以为食品生产 和监管部门提供科学依据，指导其加强食品卫生管理和监 督，保障消费者健康。
对食品生产和监管的建议
食品生产企业应加强食品生产过程中的卫生管理，提高食品加工过程的清洁度和卫生水平，从源头上 减少食品中的细菌总数和大肠菌群值。
食品监管部门应加强对食品生产和销售环节的监督检查，对存在卫生质量问题的食品生产企业进行处罚 和公示，提高违规成本。
提高食品安全水平
对食品中细菌总数及大肠菌群值 的检测能够促进食品生产者加强 卫生管理，提高食品安全水平， 降低食品安全事故的发生率。
维护市场秩序
通过检测食品中的细菌总数及大 肠菌群值，可以打击劣质食品的 生产和销售，维护市场秩序，保 障消费者的合法权益。
菌落总数测定注意事项
菌落总数测定注意事项菌落总数测定是一种常用的微生物检测方法，用于评估食品、水源、环境等样品中的微生物污染程度。
在进行菌落总数测定时，需要注意以下几个方面。
1. 实验室准备在进行菌落总数测定之前，需要进行实验室的准备工作。
确保实验室环境干净整洁，并且有足够的空间来进行操作。
实验室应该配备必要的设备和试剂，如培养基、平板计数器、恒温培养箱等。
2. 样品处理样品处理是菌落总数测定的关键步骤之一。
选择合适的样品容器，并确保其干净无菌。
根据不同样品的特性选择合适的处理方法，如稀释、过滤、均匀搅拌等。
在处理样品时要注意避免污染和交叉感染。
3. 培养基选择选择合适的培养基对于菌落总数测定至关重要。
常用的培养基有营养琼脂、大肠杆菌培养基等。
根据不同的样品特性和检测目的，选择适宜的培养基。
要确保培养基质量良好，无菌且保存期限未过。
4. 接种方法接种方法是影响菌落总数测定结果准确性的重要因素之一。
常用的接种方法有涂布法、均匀涂布法和滴定法等。
在进行接种时，要注意避免气泡的产生和交叉感染，保证每个接种点数量均匀、分散。
5. 培养条件培养条件对于菌落总数测定结果的准确性和可重复性至关重要。
应根据不同微生物的生长特性和培养基要求，设置合适的温度、pH值、湿度等条件，并严格控制培养时间。
要注意防止外界污染和细菌交叉感染。
6. 菌落计数菌落计数是菌落总数测定的最后一步，也是最关键的一步。
在进行菌落计数时，应使用合适的平板计数器或显微镜，并按照指定规则进行计数。
为了提高准确性，建议对每个样品进行多次计数，并取平均值作为最终结果。
7. 数据分析在菌落总数测定完成后，需要对数据进行分析和解释。
应根据实验目的和样品特性，选择合适的统计方法和图表展示方式。
要注意对结果的合理解释，并与相关标准进行比较，评估样品的微生物污染程度。
8. 实验记录和报告在进行菌落总数测定时，要做好实验记录和报告。
记录实验过程中的操作步骤、观察结果、数据等信息，并及时整理归档。