第五章生物产品萃取技术

• 因为若再升高压力，萃取收率的提高，相对于为获得及保持 这样高的压力所增的投资和操作费用来说就不经济了。 • 温度T升高，一般情况下CO2的溶解力有所增加，且较压力 影响明显。仍以超临界CO2 萃取沙棘油为例。F＝30MPa，T ＝32℃时，沙棘油的收率为90.1%，当温度升高T＝40℃， 油的收率提高到92.1％．但温度的升高受到对所萃取物质热 敏性要求的限制。
图3-16 超临界CO2从咖啡中脱除咖啡因示意图
由于超临界流体萃取毒性小、温度低、溶解性能好，非 常适合生化产品的分离和提取，近年来在生化工程上的应用 研究愈来愈多，如超大型临界CO2萃取氨基酸，从单细胞蛋 白的游离物中提取脂类，从微生物发酵的干物质中萃取γ -亚 麻酸，用超临界CO2 萃取发酵法生产的乙醇，以及各种抗生 素的超临界流体干燥，脱除丙酮、甲醇等有机溶剂，避免产 品的药性降低等等。可以预料，在不久的将来超临界流体萃 取技术一定会取得越来越多的可喜成果。
这种溶剂溶质之间的作用力随着分子靠近而强烈的增加，分
子间作用力越大，溶质的溶解度越大。超临界流体的密度越 接近液体的密度，因此对溶质的溶解能力与液体基本相同。
压力越大，超临界流体的密度越大，对溶质的溶解度也就越
大。当改变条件，随着压力的降低，超临界流体的密度减小， 溶解度急剧减小，溶质释放出来。
由此可见，在保持温度恒定条件下，通过调节压力来控 制超临界流体的萃取能力或保持压力不变改变温度来提高其 萃取能力。
成了独特的分离工艺。
超临界C02的萃取特性(熟悉)
(1)溶解特性 超临界C02是一种非极性流体，符合相
似相溶的原理。其溶解力随物质极性的减弱而增大， 随物质分子量的增大而减弱。一般地表现为，对分子
量小，极性弱的物质易溶解，对分子量较大，极性较
强的物质难溶解，对分子量高，强极性的物质，如氨 基酸、蛋白质、糖和无机盐等则不溶解。在实际应用 中，有时根据需要向超临界C02中加入助溶剂，来调 整其溶解力。
4
Applications
1)、蛋白质、酶的纯化 2)、多肽的分离纯化 3)、核酸的分离纯化 4)、病毒、细胞、细胞器的分离
双水相系统萃取酶的一般流程图
5.2 反胶团萃取
• 反胶团萃取技术（Reversed micellar extraction）是近 年来发展起来的一种新型萃取分离技术，主要适合于蛋白 质的提取和分离。 • 反胶团体系由水、有机相及表面活性剂组成，是表面活性 剂分散于连续有机相中自发形成的一种具有微水池结构的 油包水微乳液。
5 生物产品萃取技术
生物工程下游技术
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?萃取 有机溶剂萃取
萃取：利用物质在两种互不混溶的溶剂中的分配差 异进行分离的技术。
有机溶剂萃取：以与水互不相溶的有机溶剂作萃取 剂从水相中萃取目的产物的分离技术。广泛应用 于抗生素、有机酸、维生素等发酵产品生产。
用于蛋白质、核酸、酶等生物大分子的分离很少成功。
反胶团萃取的优点
在反胶束内部包含了水溶液，蛋白质等生物分子
萃取后进入反胶团内部的“水池” 中，避免了与 有机溶剂直接接触，反胶束内的微环境与生物膜 内相似，故能很好保持其生物活性，解决了蛋白 质在有机溶剂中容易变性失活和难溶于有机溶剂 的问题，为蛋白质的提取和分离开辟了一条新的 途径。 成本低，有机溶剂可反复使用；容易放大和实现 连续操作。 反胶束萃取是一条具有工业发展前景的蛋白质分 离技术。
温度对分配系数的影响
• 通常酶的稳定性会随温度的增高而减低， 但在双水相系统中，由于所使用的聚合物 含有多羟基，对酶有保护作用，即使在室 温下，酶的失活也不明显。因此酶的双水 相萃取可以在室温下进行，这可以节省因 冷却造成的大量能量。
3.5 3 2.5 2 1.5 1 0.5 0 0 10 20 30 40 50 60 70 · û ¨È ¨ © Ï °Å ¶ £ %£
0.8 0.6 0.4 0.2 0 6 6.5 7 7.5 8 8.5 9
K
pH
pH 对磷酸化酶的分配系数的影响
相系统：7.2%PEG4000/6.7%Dex T500,200mM 缓冲液 ◆ PO4 3■ Tris
在 PEG/Dex 系统中，当使用 Tris 缓冲液时，在 pH7-8.5 范围内， 不会使缓冲离子的电荷发生改变，对酶的分配系数影响不大；而在使 用磷酸盐缓冲液时，改变 pH 对缓冲离子的电荷数及其不同离子的比例 影响很大，而时酶分配系数的发生明显改变。
聚乙二醇、聚乙烯醇、葡聚 糖（Dex）、羟丙基葡聚糖
聚乙二醇（PEG） 聚乙烯醇、葡聚糖 高聚物/无机盐体系 高聚物/聚电解质体 系 聚电解质/聚电解质 体系 聚乙二醇 硫酸葡聚糖钠盐 硫酸镁、硫酸铵、硫酸钠、 磷酸钾、酒石酸钾钠 甲基纤维素
羧甲基葡聚糖钠盐 羧甲基纤维素钠盐
普通双水相系统
普通双水相萃取是指主要依靠空间位阻分配和界 面电位分配的双水相萃取，如利用聚合物/聚合物 系统和聚合物/盐系统的萃取。 为了改进萃取效率和分离效果，利用控制相系统 的pH或在相系统中加入盐或有机溶剂的方法提高 目的物的分配系数。 普通的双水相萃取系统的选择性比较低，只适用 于产物回收和初步分离。
超临界流体的应用实例
用超临界CO2从咖啡中脱除咖啡因 超临界CO2可以有选择
性地直接从原料中萃取咖啡因而不失其芳香味。具体过程为
将绿咖啡豆预先用水浸泡增湿，用70～90℃，16～22MPa的 超临界CO2（这时PCO2≈0.4～0.65g/cm3）进行萃取，咖啡因 从豆中向流体相扩散然后随CO2 一起进入水洗塔，用70～ 90℃水洗涤，约10小时后，所有的咖啡因都被水吸收；该水 经脱气后进入蒸馏器回收咖啡因。CO2 可循环使用。通过萃 取，咖啡豆中的咖啡因可以从原来的0.7%¬3%下降到0.02% 以下，具体工艺流程见图3-16。
超临界流体
• 每一种物质都有其特征的临界参数，在压力-温度相图上，称其为临界点。临界点对应的压力 称为临界压力，用PC表示，对应的温度称为临界 温度，用TC表示。不同的物质有不同的临界点。 临界点是气体和液体转化的极限，饱和液体和饱 和气体的差别消失。 当温度和压力超过临界点值时，物质处于既不 是液体也不是气体的超临界状态，称其为超临界 流体。
(3)助溶剂(夹带剂)对溶解力的影响 (P84)
向超临界CO2流体中加入一定量的水、甲醇、乙酸、醋 酸乙酯等物质或者是它们的混合物，可以增加溶解力，
从而改变对所萃取物质的选择性。如在超临界CO2流体
中加入总体积50~60％的甲醇后，即可以从浓度为1~3
％的发酵液中苹取L-脯氨酸，收率可达50％以上。
双节线上两点的直线。
系线(tie line)反映的信息
A 杠杆规则：系线上各点均分为组成相同， 而体积不同的上下相。两相体积近似服 从杠杆规则。
B 性质差异：系线的长度是衡量两相间 相对差别的尺度,系线越长,两相间的 性质差别越大；反之则越小。 C 临界点(critical point)：当系线长度 趋于零时, 两相差别消失,任何溶质在 两相中的分配系数均为1。如K点。
Questions
A、protein萃取？ B、胞内酶的萃取？
5.1 双水相萃取
1、 双水相基本原理(ATPS相图)(重点) 2、 蛋白质的分配平衡（熟悉）
3、 影响分配平衡因素（熟悉）
4、 Applications （了解）
双水相系统(aqueous two-phase systen, ATPS)
PEG = 聚已二醇(polyethylene glycol)
Kpi = 磷酸钾
DX = 葡聚糖(dextran)
1、Pro如何分布 2、影响因素 3、应用
1、 ATPS相图
双节线(bi-nodal)：
图中的曲线。 双节线以下的区域为均相区,以上的区域 为两相区，即ATPS 。
系线(tie line)：
(2)溶解力与P．T的关系 (P83) 超临界CO2的溶解力受P和T
的影响较大。压力P增加，超临界C02的密度增加，溶解力
也相应增加，其实验的结果也是如此。以超临界CO2 萃取
沙棘油为例，T＝39℃，P＝15MP时，油的收率为88.0％， 同样温度下，增加压力P＝25MPa时，油的收率增加到90.7 ％。但一般当压力在40MP时，超临界CO2 的溶解力就达到 了实际所能获得的最高限。
超临界萃取中应用 最 多 的 是 CO2。CO2 的 临 界温度31.3℃,接近于
室温，临界压力为
7. 3 8Mpa，处 于 中 等 压 力，目前工业水平易于
达到，并且无毒，无味，
性质稳定，不燃，不腐 蚀，易于精制，易于回
图3-15 临界点附近的P-T相图
收。
超临界萃取原理
溶质在一种溶剂中的溶解度取决于两种分子间的作用力，
2、 蛋白质的分配平衡
一种物质在两相系统中的分配行为可用分配系数 来描述，分配系数K为该物质在上相和下相中的浓度 之Leabharlann Baidu。
cT K cB
控制能够影响物质分配系数K的因素，包括环境 因素，相系统性质和组成就能改变物质的分配系数。
常用的双水相体系
体系类型 化合物1 化合物2
高聚物/高聚物体系
聚丙二醇
流体在临界区域附近，压力和温度的微小变化，会引起
流体密度的大幅度变化，而非挥发性溶质在超临界流体中的 溶解度大致和流体的密度成正比，保持温度恒定，增大压力，
流体密度增大，对溶质的萃取能力增强；保持压力恒定，提
高温度，流体密度相对减小，对溶质的萃取能力降低，使萃 取剂与溶质分离。超临界流体萃取正是利用了这种特性，形
思
考
1、何谓双水相萃取?常见的双水相构成体系有哪些？
2、反胶团的构成以及反胶团萃取的基本原理？
在使用助溶剂的时候，要注意助溶剂的分离和残留。
但
超临界流体的密度与液体基本相同，而其 粘度比液体小10～100倍，其自扩散系数远大于 液体的自扩散系数，可以迅速渗透到物体的内 部溶解目标物质，快速达到萃取平衡。因此在 固体内提取有效成份时，用超临界流体作为萃 取剂远优于液体。
超临界二氧化碳萃取流程图
反胶团萃取的操作
A 萃取的基本方法 B 反萃取
.
C 反萃取
5.3
超临界流体萃取
流体在超临界状态下，其密度接近液体，具有与液体溶剂 相当的萃取能力；其粘度接近于气体，传递阻力小，传质速 率大于其处于液态下的溶剂萃取速率。基于超临界流体的这 种优良特性，自20世纪70年代以来，迅速发展为一门综合了 精馏与液液萃取两个单元操作的优点的独特的分离工艺。
影响分配的因素
1.表面自由能 2.表面电荷 由于影响分配系数的因素很多，加上各 因素之间又相互影响，因此，要定量地将 蛋白质的一些分子性质与分配系数关联起 来是困难的，最佳的双水相系统的作条件 还要依靠实验来获得。
3、 影响分配平衡因素(熟悉)
• • • • • （1）成相聚合物 （2）盐的种类和浓度 （3）pH值 （4）温度 （5）细胞
细胞浓度对酶的分配系数的影响 系统：9%PEG4000/2%DexT500 ■普鲁兰酶 ◆α -葡萄糖苷酶
23 21 19 17 15 13 11 9 7 5 0 20 40 60 80 · û é ï ¨È ¨ © Ï °Æ Ë Î Å ¶ £ %£
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料液
有 机 相
反胶团萃取的原理
静电引力：主要是蛋白质的表面电荷与反胶束内 表面电荷（离子型表面活性剂）之间的静电引力 作用。 空间位阻作用：增大反胶束极性核的尺寸，以减 小大分子蛋白进入胶核的传质阻力。 凡是能够引起静电引力，能够促使反胶束尺寸增 大的因素均有利于提高分配系数。 这些因素主要是pH、离子强度、表面活性剂种类 和浓度等，通过因素优化，实现选择性地萃取和 反萃取。
细胞破碎物浓度对酶分配系数的影响 系统：PEG/(NH4)2SO4 ■PEG1000 ◆PEG1500
体 积 比 (VT/VB) 细胞破碎物浓度(%)
细胞破碎物浓度(%)
产 率 (%)
相系统中细胞破碎物浓度对分配系数和相比的影响 ○ 相比 ■ 产率
细胞破碎物在系统中的浓度不仅影响分配系数， 对上相与下相的比例 有影响。随着系统中细胞破碎物浓度的增加，上相与下相之比(VT/VB)减 小。因此，一般细胞破碎物在相系统中浓度大于 20-30%，萃取率会明显 降低。