高速逆流色谱操作
高速逆流色谱技术
l 高速逆流色谱是液相色谱的一种新技术，无需载体，从几种色谱原理方法可以清晰说明。
大约50年前，根据对两种液体进行分配的理念，产生了两种相似的方法：逆流分配技术和液-液色谱分配技术，即：逆流色谱和液相色谱。
30年前，日本Sanki Engineering Ltd.利用前一种技术开发出了高性能的逆流色谱仪（HPCPC），它结合了液相色谱中的快速、高效和先进技术。
HPCPC尤其在利用色谱技术进行半制备和全制备的应用中倍受瞩目，它和采用色谱柱技术的液相色谱在四个方面具有显著优势：● 无样品损失：因为流动相和固定相都是液体，样品可以全部回收。
● 大容量和高的分离能力：流动相和固定相的体积比明显很高，从而无需更大的理论塔板数，就可以获得更大的容量和更高的分离能力。
● 十分灵活的两相系统：（两种、三种、四种溶剂混合）为了获得一种纯的化合物，实验中需要比较灵活的更改流动相，HPCPC可以很方便地调整两相的极性。
● 溶剂消耗少：相对于色谱柱制备系统，对于同样的制备量，HPCPC的溶剂消耗量只有十分之一，使用逆流色谱在实验室完成分离后，可以直接放大到生产规模。
● 固定相价格低：另一个显著优点是逆流色谱的固定相是溶剂，相比色谱柱中的填充材料价格低很多；而且固定相可以很容易再生，一些添加的物质如手性选择剂或复杂的配位体可以无损失地回收，国际上出版的论文可以提供十分有用的信息和应用参考。
新型的高速逆流色谱仪HPCPC广泛地应用于化学领域的纯化，如抗生素、缩氨酸、丹宁酸、皂角苷、油脂、药品等，将来的发展可以预见更大规模和产量的HPCPC设备出现，在化学领域将更加广泛地应用，如手性药物分离等。
与传统制备液相的优势● 逆流色谱仪HPCPC十分快速由于固定相溶剂通过离心力保留在分配通道中，可以不用顾及分离精度的高低要求而让流动相的流速保持很高。
● 明显优于传统制备液相由于逆流色谱仪HPCPC不需要固定相，不会出现对十分昂贵的样品产生不可逆转的保留，而在传统色谱柱的液相色谱中，经常出现的变性和分解现象在逆流色谱不会产生，同时保留了原来的生物活性。
高速逆流色谱法分离望春花蕾中的木兰脂素
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高速逆流色谱法
HSCCC进样体积可达到柱体积的20%，广泛用于制备 性分离。
参数
固定相 机理
溶质与固定相作用
上样量 分离效率
操作 费用 危险性
HSCCC
色谱分离是依据被分离物在两相中分配系数的不同而 进行；
逆流色谱是利用物质在两相液体中分配系数的不同实 现分离；
分离也可以依据被分离物在一个含有沉淀剂的浓度梯 度变化的单一溶剂中的溶解度的不同而实现。
（前提：沉淀剂浓度梯度移动的速度远低于溶剂流速）
溶解度具有很小差异的物质，经过在柱中反复的沉淀 和溶解即可达到分离。
二、基本原理
现代逆流色谱仪器体系： 1. 流体静力学平衡体系
2. 流体动力学平衡体系（HSCCC体系） 仪器的两个特征：
a 有一个或多个缠绕有多层聚四氟乙烯管的线轴； b 没有旋转密封接头，有一个安装有两个旋转轴的齿轮传动装置，
能产生一个可变的离心力场。
通过公转、自转（同步 行星式运动）产生的二 维力场，保留两相中的 其中一相作为固定相；
广义定义： 1. 任何利用两相不混溶液体的色谱技术； 2. 其中一相以一种相对均匀的方式纵向分布在一根空管
或一系列的腔体中； —— 固定相 3. 同时另一相以一定的速度通过第一相并与之混合。
—— 流动相
减少了溶质分子与固体支撑体之间各种复杂的相互作 用；
不仅可以获得高纯度的分离组分；
同时具有较高的回收率和重现性。
离心沉淀色谱（centrifugal precipitation chromatography, CPC）是一种建立在类似于逆流色谱 的不用固体支撑体的开放性通道基础上的沉淀和溶 解色谱。
高速逆流色谱法提取茶多酚工艺流程
高速逆流色谱法提取茶多酚工艺流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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1. 茶叶预处理。
高速逆流色谱
1.6 葛 Pueraria lobata 葛根素（puerarin）（黄酮） 1.7 苹果 Malus pumila 原矢车菊素(procyanidin)；Procyanidin A及procyanidin
B。 1.8 牛膝 Achyranthes bidentata 牛膝多糖 (多糖) 1.9 宽叶羌活 Notopterygium forbessi notopterol、isoimperatorin。 1.10 红豆杉粗提物 10-脱乙酰浆果紫杉素（10-deacelylbaccatin），紫杉醇
流速范围:0.1-30ml/min 分离流速：2.0-4.0ml/min； 压力:0-2MPa
紫外检测器波长：使用汞灯 - 滤光片选择 254 、 280nm ( 标配 )
多种滤光片可选： 313 、 365 、 405 、 436 、 546nm( 选购 )
温控模块（接循环水浴）：温度调控范围 15 ～ 40 ℃，精度 0.5 ℃ ，
轻的为上相，重的为下相），一相为固定相，另一相 为流动相。 b) 被分离物质的分配系数（K）范围在0.5-2。K=Cu/CL， Cu是上相中溶质浓度，CL是下相中溶质浓度。K＜＜ 0.5 会导致峰分离度的下降，而K＞＞2，会使保留时 间太长，样品峰过宽。
表 1 中列举了常用的溶剂系统。查找溶剂系统可以从左边
步骤2:溶剂系统的优化
区域
化合物极性
A
强极性
B
中极性
C
非极性
溶剂系统 正己烷/正丁醇/甲醇/水 正己烷/乙酸乙酯/甲醇/水
正己烷/乙腈
步骤3:溶剂比例的优化
一次只改变一种溶剂的量 取少量样品在试管中进行分配系数实验 TLC或HPLC测定实验结果
高速逆流色谱法分离纯化长春花中长春新碱
采 用 高速 逆流 色谱 仪 ， 氯仿一 醇一． ｏ ・ ＨＣ（ ３： ） 甲 ０ ３ｍ ｌ Ｌ １ ４： ２溶剂 体 系， 上相 为 固定相 ， 相 为流 动 相 ， 下 流动 相 流 速 为 ２０ｍ ． Ｌ・ ｎ ， ｍｉ ～ 紫 外检 测 波 长 为 ２ ０ｎ 主机 转速 为 ８ ０ｒ ８ ｍ， ０ ・ｍｉ＿ ， 温循 环 温 度 为 ２ ｎ 。恒 ８℃ 。 结果 业 生产 高 纯 度 产 品 。 关键词 ： 高速 逆 流 色谱 ； 春 花 ； 长 长春 新碱
ｓ ｅ ｄｃ ｕ ｔ ｒ ｕ ｒｎ ｈ ｏ ｔｇ ａ ｈ ｓｕ ｅ ｉ ｈｏ ｏ ｏ ｍ ｍｅｈ ｎ ｌ ． ｏ ． ＨＣ ４：３： ）ａ ｈ ｏｖ ｎ ｙ ｔｍ． ｐ ｅ ｏ ｎ ｅ－ ｒｅ ｔ ｒ ｍａｏ ｒｐ ｙｗａ ｓ ｄ ｗ ｔ ｃ ｌｒ ｆｒ — ｔａ ｏ－ ３ ｍ １ Ｌ ｃ ｃ ｈ ０ ｌ（ ２ ｓｔ ｅｓ ｌｅ ｔ ｓｅ ｓ
西 北 药 学杂 志
２１ ０ １年 １ 第 ２ ２月 ６卷
第 ６ 期
３５ ９
高速 逆 流 色 谱 法分 离 纯化 长 春 花 中长春 新 碱
韩 艳 ， 张 琰 ， 新友 ， 刘 覃 华 ， 小燕（ 杜 第四军医大学唐都医院药剂科， 陕西 西安 ７０ ３） １０８
高速逆流色谱原理及应用
高速逆流色谱的仪器设备
高速逆流色谱系统由高压泵、进样器、色谱柱、检测器和数据处理系统等组 成，其中色谱柱是核心部件。
高速逆流色谱的应用领域
高速逆流色谱在药物分析、天然产物研究、环境监测和食品安全等领域具有广泛的应用。
高速逆流色谱与传统色谱快、样品损失少等优点，适用于复杂样品的分析。
高速逆流色谱的优势和局限性
高速逆流色谱具有高灵敏度、高分辨率和多样性等优势，但对样品前处理要求严格，并且柱寿命较短。
总结与展望
高速逆流色谱作为一项重要的分析技术，将继续发展并在更多领域中发挥重要作用，为科学研究和工业应用提 供支持。
高速逆流色谱原理及应用
高速逆流色谱（HPLC）是一种高效、准确的分析技术，广泛应用于生物医药、 食品安全和环境监测等领域。
高速逆流色谱的介绍
高速逆流色谱是一种液相色谱技术，利用高压泵将样品溶液通过色谱柱，以不同的化学性质分离样品中的化合 物。
高速逆流色谱的原理
高速逆流色谱基于溶质的分配与吸附过程，通过调节移动相和静态相的性质，实现对样品中化合物的分离和分 析。
高速逆流色谱
400
流速: 2.0 ml 转速：800 rpm 样品量：150 mg 粗提物 机型：TBE-300A 固定相保留： 60% Ⅰ：花椒毒素 95.0％ 7.6 mg Ⅱ: 异茴芹素 99.6％ 7.6 mg Ⅲ: 佛手苷内酯 99.7％ 9.7 mg Ⅳ: 欧前胡素 100％ 60.5 mg Ⅴ: 蛇床子素 100％ 50.6 mg Ⅵ:未知化合物 98.1％ 10.2 mg min-1
实例3 白花败酱异戊烯基黄酮的分离
溶剂系统: 正己烷-乙酸乙酯－甲醇-水 (5:6:6:6) 流动相：下相 流速: 1.0-2.0 ml min-1 转速：850 rpm 样品量：400 mg 粗提物 固定相保留： 65% 分离温度: 25°C 机型：TBE-300A Ⅰ: orotinin （牡荆苷）99.2％ 38.2 mg Ⅱ: orotinin-5-methyl ether 98.5％ 19.8 mg Ⅲ: licoagroachalcone B 97.6％ 21.5 mg Journal of Chromatography A,1102(2006)44-50
两相溶剂体积选择
• 色谱理论,样品分离的必要条件是合适的分配系数。溶剂 体系的选择对于HSCCC十分关键,通常来说,两相溶剂体系 应满足以下要求: • (1)为保证固定相保留值合适(不低于50% ) ,溶剂体系的分 层时间要小于30 s。 • (2)目标样品的分配系数K接近于1,容量因子应大于1. 5。 • (3)上下两相的体积大致相等,以免浪费溶剂。 • (4)尽量采用挥发性溶剂,以方便后续处理,易于物质纯化。 • Ito博士根据在螺旋管中行星运动的溶剂流体力学特性将溶 剂分为疏水性、中等疏水性和亲水性体系 。
Absorbance(mAU)
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高速逆流色谱操作步骤和要点操作步骤：1配液。
超声脱气约20min，脱气后静置冷却至室温后泵液。
2打开恒温水浴，将温度升至设定温度。
3泵固定相。
以10-20mL/min流速泵入固定相，检测器出口端流出固定相约20-50mL后停泵。
4平衡。
打开紫外检测器开始预热，正转转动主机至900rpm（FWD为正转，REV 为反转），同时以3mL/min流速泵入流动相，至出口端流出流动相且此时紫外信号稳定，体系基本己平衡。
5进样。
以体系的上、下相溶解一定量的样品，超声溶解均匀后，在装样注射器中倒入样品溶液，将进样六通问切换至load，推排气泡后吸液至样品全进入进样圈中，将load切换至inject，检测器、工作站调零开始记录。
6接收流分。
工作站记录，设备运行时间为如5min，保存后采集数据，保存。
7清洗。
断开泵与主机的连接，将主机进口与气管出口连接，吹气；将主机中溶剂吹出后，泵入约50mL清洗液，吹气，重复此过程2~3次；最后一次长时间（1小时左右直至吹干）吹气时将主机内液体吹尽。
8关机。
操作要点：本仪器适用于有机溶剂，316L不锈钢及PTFE材料可耐受的酸碱溶液。
1本设备可承受的压力限制为2MPa，请勿泵入不可溶解的固体颗粒。
2设备运行前先检查连接管路是否正确，是否紧密；检测器波长是否正确。
3配液时溶剂应混合均匀，自然分层澄清后可超声脱气，脱气时间不宜过长，脱气后如溶剂有温热则最好冷却静置至室温后使用。
4样品溶解可为体系上相或下相，或同时两相溶解；不可以单一的溶剂来溶解进样，以免破坏主机内的体系平衡。
5每次做完实验请及时清洗设备，一般清洗液为甲醇、乙醇等，如体系内含有酸、碱、盐等溶剂，建议先以纯净水清洗l~2次后，再以清洗液清洗。
6日常清洗完设备后；如需继续进行实验，请设备放置2小时后重新平衡。
7操作中如有气泡、流失或其他异常现象，可致电上海同田生物技术有限公司技术支持部2附件1：仪器性能检验苯酚、间苯二酚的分离体系：正已烷：乙酸乙酯：乙醇：水=1：1：1.2：0.8把溶剂按比例配制好，混合均匀后分相，上相用作固定相，下相用作流动相，分别超声脱气约20min。
样品为苯酚、间苯二酚，各30mg溶于5mL上下混合溶剂中1、主机分离管路体积的测定用量筒取500毫升上相，用泵泵入主机管路内，当上相从管路的出柱口流出后，继续泵至上相流出30毫升，停泵，记录下量筒内剩下的上相体积，及收集到的流出上相的体积；总体积的计算：V总=500-V剩余-V流出 (1)式中：V总——管路测定总体积（mL）；V剩余------泵入固定相的体积后，剩余在量筒中的体积（mL）；V流出------流出固定相的体积（mL）。
2、固定相保留率的测定以900rpm的转速正向旋转已被上相充满管路的主机，同时以3.00mL/min的流速往分离管路内泵入流动相，当主机出柱口管路流出流动相后，量出被流动相推出的上相体积（V出）；固定相保留率的计算：保留率=×100% (2)式中：V总――管路总体积（mL）V出――流动相推出上相体积（mL）V环――进样环的体积（mL）保留率大于等于40%为合格。
3、标准峰的验证通过六通阀往上、下相已经平衡了的管路内加入溶解好的样品，用流动相以3.00mL/min流速洗脱，直至标准峰的出现，整个过程须用色谱工作站记录谱图。
TBE-300A高速逆流色谱仪说明书高速逆流色谱（high-speed countercurrent chromatography，HSCCC）是20世纪80年代发展起来的一种连续高效的液－液分配色谱分离技术。
它利用两相溶剂体系在高速旋转的螺旋管内建立的一种特殊的单向性流体动力学平衡，当其中一相作为固定相，另一相作为流动相，在连续洗脱的过程中能保留大量固定相。
由于不需要固体支撑体，物质的分离依据其在两相中分配系数的不同而实现，因而避免了因不可逆吸附而引起的样品损失、失活、变性等，目前已广泛应用于多种领域。
HSCCC的应用领域：1、天然产物有效成分的分离纯化;2、多肽，蛋白质和多糖等生物大分子分离3、抗生素的分离纯化4、化工和化学合成物质的分离纯化5、食品功能成分的分离纯化6、农药残留物质分离分析7、中药指纹图谱和质量控制研究8、海洋生物活性成分的分离纯化HSCCC的独特优势：1、高效提纯；2、大制备量；3、低使用成本；4、高科研价值；5、易工艺放大；6、高回收率。
1、系统构成：由TBE-300A型高速逆流色谱分离仪组成的分离分析系统，一般包括：泵、主机、检测仪、恒温循环器（选购件）、数据处理系统、溶剂选择系统。
如图1所示1.1TBE-300A主机主机是实现样品分离的场所，样品在主机内分离，并随着流动相按分配比的大小依次流出；主机包括：转速控制器、双六通阀、螺旋柱、恒温套等部分。
1.2恒流泵以恒定的流速向主机管路内泵入固定相和流动相；使用时，应注意泵的过滤器应浸在液面以下，以防止泵入空气，影响主机的分离效果。
（附：泵设定的保护压力应为2兆帕。
）1.3紫外检测仪检测经分离后样品中各组分的吸光度，然后将吸光度转变成电信号，并传送给色谱工作站，操作详见其说明书。
(附：紫外、ELSD等通用检测器都能连用。
)1.4恒温循环器向恒温套提供温度相对恒定的传热介质，达到稳定分离场所的温度的作用。
1.5色谱工作站将紫外检测仪传送过来的电信号，转换成数字信号，并通过相应的软件，将数字信号记录下来。
2、主机说明2.1功能键说明2.1.1变频器控制面板调节和显示仪器的转速，rpm2.1.2Power键电源开关，控制主机电源的接通与断开；仪器在不工作时，必须把电源断开，断开电源前，先要让主机完全停止转动。
往下按为接通电源，往上按为切断电源2.1.3进样口进样口为注射器的针头，可将干净的注射器插入到注射针头口上，将分离样品样品装入注射器A里；再用干净的注射器B将注射器A里的样品抽入到样品圈里。
2.1.4进样六通阀Load档为载样的状态，当进完样品后将“进样六通阀”切换到Inject档即可完成进样操作。
出厂设置在inject档。
2.1.5流路切换六通阀1.当该六通阀在In档时，HSCCC的洗脱方向是从首端尾端；2.当六通阀在Out档时，HSCCC的洗脱方向是从尾端首端。
2.1.6进柱口通过进柱口用连接管将泵的流路与分离管柱的入口端连接，工作时，流动相从进柱口进入分离管路内；在主机面板上用Pump表示。
2.1.7出柱口通过出柱口，将分离管柱的出口端与检测器连接；参与过分配的流动相从出柱口流出分离管路，进入到检测器进行检测；在主机侧面板上用Detector 表示。
2.1.8“恒温套入水口”、“恒温套出水口”：通过该接口将恒温循环器的循环流路同主机的恒温套连接起来，以达到给主机分离管柱恒温的目的。
“恒温套入水口”连接恒温循环水浴的出水口，“恒温套出水口”连接恒温循环水浴的入水口。
2.2六通阀详解本机配有两个六通阀，流路切换六通阀（1号）和进样六通阀（2号）。
*两个六通阀之间的连接及1号六通阀的工作流路情况如图所示：1、正向、反向工作示意图：2、进样工作示意图：2.3进样步骤：1、称取待分离样品2、将样品溶解完全，无明显可见颗粒（样品既可用流动相或固定相溶解，也可用两相混合溶剂溶解。
）3、把2号六通阀的手柄拨到Load档（拨手柄时，速度要快，以防管路不通或暂时压力过高胀破进样圈管路）；4、装入样品，用注射器把样品圈尾部的气泡排除干净（见气泡冒出且进样注射器内液面上升，无气泡为宜）；将注射器回抽入定量环中（2号六通阀Inject 处有一个引出的管路，由此抽入样品）；5、把2号六通阀拨到Inject档；6、清洗六通阀进样管路；清洗的详细步骤如下：⑴、用注射器将清洗液从抽入到注射器中（2号六通阀Inject处有一个引出的管路，由此抽入清洗液）；⑵、将抽入到注射器中的清洗液中倒入废液瓶中；⑶、若管路还没有清洗干净，可重复上述操作再清洗一次。
*注：进样时，先用B注射器从进样口注入一小段空气，以排除溢出口处的空气；然后，抽动注射器活塞，把样品吸入进样圈中。
2.4.1变频器功能键说明：“▲”“▼”键：调整仪器转速的设定；“▲”为增加数值，“▼”为减少数值；最小调整范围0.1rpm“◄”键：数位移动键，将数位左向移动“PROG”键：记忆键，确认已设定好的转速数值“FWD”键：转速设定好之后，按“PROG”键确定；然后按“FWD”键开始旋转仪器，“正转指示灯”变亮，显示屏数值从“0000”迅速升至设定转速（此时不可非正常停机）。
“REV”键：转速设定好之后，按“PROG”键确定；然后按“REV”键开始旋转仪器，“反转指示灯”变亮，显示屏数值从“0000”迅速升至设定转速（此时不可非正常停机）。
“转速调节旋钮”：可调整仪器转速，向右增大转速，向左减少转速“STOP”键：按下此键，显示屏数值迅速减少至“0000”，表示结束工作，此时按下主机“POWER”键为“Off”位置，结束主机电源供应（属正常关机）。
“FUNC”键：为功能键，出厂时设为默认；用户禁止更改TBE-300A高速逆流色谱分离仪工作流程如下（以液压泵为压力源）：。