茶藨子叶状层菌固体培养特性

茶藨子叶状层菌固体培养特性研究了6种不同培养基对茶藨子叶状层菌（Phylloporia ribis）菌丝形态、生长速度、生物量及三萜含量的影响。

结果表明：茶藨子叶状层菌菌丝体在麦芽汁、胡萝卜和PDA固体培养基中生长速度较快，在麦麸与PDA固体培养基中生物量较高，而在生长速度最慢的GPY固体培养基中，三萜含量最高。

茶藨子叶状层菌；固体培养；培养特性；三萜茶藨子叶状层菌（Phylloporia ribis）为锈革孔菌科（Hymenochaetaceae）叶状层菌属（Phylloporia）真菌，发现于山东省平邑县，寄生在当地金银花树活体根茎韧皮部，当地人称之为“银花蛾子”。

茶藨子叶状层菌子实体的功效与金银花有相似之处，可用于消炎、解毒、止痛，当地居民用其治疗咽炎、喉炎、肝炎及癌症，有良好的临床治疗效果，具有很大的药用开发价值[1]。

由于受寄主和产地的限制，野生茶藨子叶状层菌采集量很低，限制了对其进一步的开发与利用，目前对它的研究主要集中在采集的野生子实体活性成分分析，而对于其人工培养方面的研究较少，因此，探讨其固体培养特性可为其下一步大规模人工培养奠定基础。

1 材料与方法1.1标本与菌种野生茶藨子叶状层菌（P. ribis）采集于山东省平邑县郑城镇西山的金银花树上（封三图1），子实体形状不规则，呈扁平状半圆形，菌盖表面粗糙，硬而韧，木质化，瓦状叠生排列，深棕色至浅栗色，有同心环状棱纹似年轮及细微绒毛，菌盖长为3～6 cm，宽为1.5～3.5 cm，无菌柄，子实体背面暗褐色，肉眼可见细小的管口，管口浅褐色至暗褐色，断面可见菌肉呈木质化的纤维质，棕黄色，菌管长1～2 mm。

经吉林农业大学菌物研究所图力古尔教授鉴定，该标本为茶藨子叶状层菌。

采用组织分离法分离菌种，将新鲜子实体标本用大量无菌水冲洗至表面无泥沙杂物，再用75%的酒精擦拭表面，将菌盖纵剖为二，用尖头镊子从剖面上取5 mm×5 mm的菌肉组织，置于PDA平板，25 ℃下暗培养，选取生长良好的菌丝，转接到PDA平板，反复纯化，选取生长健壮的菌丝转接至试管斜面PDA培养基，4 ℃冰箱保存。

图1 野生茶藨子叶状层菌子实体Fig.1 Wild P. ribis fruiting bodies1.2培养基麦芽汁固体培养基（g/L）：50麦芽汁，15琼脂。

胡萝卜固体培养基（g/L）：200胡萝卜（煮汁），20葡萄糖，15琼脂。

麦麸固体培养基（g/L）：30麦麸（煮汁），20葡萄糖，3 KH2PO4，1.5 MgSO4，15琼脂。

GPC固体培养基（g/L）：20葡萄糖，6蛋白胨，10玉米浆，15琼脂。

PDA固体培养基（g/L）：200马铃薯（煮汁），20葡萄糖，15琼脂。

GPY固体培养基（g/L）：20葡萄糖，6蛋白胨，10酵母膏，15琼脂。

1.3菌种鉴定参照MAKIMURA等[2]的方法分别提取茶藨子叶状层菌子实体样品（削去子实体表层，取内部组织）DNA和菌丝体DNA。

按照刘贵巧等[3]的方法扩增ITS 序列，采用真菌ITS通用引物ITS1：5 ′TCCGTAGGTGAACCTGCGC3 ′，ITS4：5 ′TCCTCCGCTTATTGATATGC3 ′，扩增ITS全长序列，每个样品5个重复，3次测序，得到的扩增产物送往华大基因股份有限公司测序。

陈蒙蒙，等：茶藨子叶状层菌固体培养特性1.4菌丝体培养将1.2中的6种固体培养基分别倒入平板，凝固后铺上已灭菌的单层玻璃纸（上海金穗生物科技有限公司产品，用时将0.5 m×0.5 m的玻璃纸剪成平板内径大小的圆形），将菌种转接到PDA平板上活化，采用直径为6 mm的打孔器在生长良好的菌落边缘处取菌块，分别接种于不同培养基内，26 ℃、避光培养，观察菌落生长情况及菌落特征，从第20天开始每隔10 d记录菌落直径，到60 d 时结束，每种处理3个重复。

1.5菌丝体生物量和三萜含量测定将每个阶段（20、30、40、50和60 d）的茶藨子叶状层菌菌丝体从培养基表面的玻璃纸上刮下，每种培养基3个重复，称量湿重，然后置于60 ℃烘箱中烘干至恒重，测其干重即为生物量。

按照参考文献[4]的方法制作标准曲线，三萜标准品为齐墩果酸（≥98%，上海源叶生物科技有限公司）。

样品溶液制备：将烘干至恒重的茶藨子叶状层菌菌丝体研磨，精确称取0.5 g 粉末，用95%的乙醇溶液定容至50 mL，用超声波（42 kHz左右）室温提取2 h，4800 g离心10 min，取上清液。

样品溶液测定：各取3份0.3 mL样品溶液至试管中，按标准曲线制作方法在波长550 nm处测定吸光度（A）值，根据标准曲线计算菌丝中三萜含量。

1.6统计学处理采用SPSS17.0 进行单因素方差分析。

2 结果与分析2.1菌种鉴定经过测序，茶藨子叶状层菌子实体样品ITS序列与分离纯化后的菌种ITS序列完全一致，确定该菌种为茶藨子叶状层菌。

2.2菌丝体形态和生长特性此菌在6种培养基上菌丝生长均较缓慢，培养60 d时菌丝未能覆盖满平板，在麦芽汁、PDA、GPC和胡萝卜培养基上菌丝生长比较旺盛；在麦麸培养基上30 d变色，最快，而在麦芽汁、PDA、GPC和胡萝卜固体培养基上变色较慢；6种固体培养基上的生长速度排序为麦芽汁、胡萝卜、PDA、GPC、麦麸和GPY （表1）。

1：麦芽汁固体培养基；2：胡萝卜固体培养基；3：麦麸固体培养基；4：GPC固体培养基；5：PDA固体培养基；6：GPY固体培养基；+：微弱；++：强壮Growth recorded after 60 d incubation. 1：Malt liquor agar medium（malt liquor containing 5.0% solids）；2：Carrot medium （liquor from boiling 200 g/L carrots+20 g/L glucose）；3：Wheat bran medium （liquor from boiling 30 g/L wheat bran+20 g/L glucose+3 g/L KH2PO4+1.5 g/L MgSO4）；4：GPC （g/L）（20 glucose+6 peptone+10 corn starch）；5：Potato dextrose agar（g/L）（liquor from boiling 200 g/L potato+20 g/L glucose）；6：GPY medium（g/L，20 glucose+6 peptone+10 yeast extract）. All medium contained 15 g/L agar. +：weak；++：strong y and t refer to DNA from fruiting body and mycelium，respectively图2 茶藨子叶状层菌的子实体ITS序列和菌丝体ITS序列Fig.2 ITS sequences from P. ribis mycelium and fruiting body2.3菌丝体生物量和三萜含量接种后的20～30 d，菌丝体生长较缓慢，为延滞期，30～50 d，生长较快，为对数生长期，50 d之后，生物量开始降低，为衰亡期，培养到第50天时，麦麸固体培养基的菌丝体生物量最大，平均干重为84.2 mg，同期，菌丝体生物量从大到小的固体培养基依次为PDA、GPC、胡萝卜、麦芽汁和GPY（图2）。

图2 茶藨子叶状层菌菌丝体在不同培养基上的生物量Fig.2 P. ribis mycelial biomass productionon different media根据齐墩果酸的质量和测得的A值，得回归方程：Y=14.69X+0.041。

培养60 d以内的菌丝体，从图3的趋势线可以看出，茶藨子叶状层菌中三萜含量有两种趋势：一种为随时间延长，三萜含量越来越高，主要有麦芽汁、麦麸、GPC和胡萝卜固体培养基；另一图3 茶藨子叶状层菌菌丝体中三萜含量的变化Fig.3 Triperpenoid content of P. ribis myceliagrown on different media种是随时间延长，三萜含量先升高后降低，主要是GPY固体培养基。

第40天时，GPY固体培养基培养的菌丝体中三萜含量为0.39%，已经比第60天的其他培养基都高，具有较明显的优势；然后依次为第60天的胡萝卜、麦麸和GPC 固体培养基。

亭亭，将“ Malt juice ”替换为“ Malt liquor”（同样的处理在表4）亭亭，Y轴改为“菌丝体生物量（干重）（mg）”Mycelial biomass（dry weight）（mg）3 小结固体培养条件下，茶藨子叶状层菌在PDA、麦芽汁和胡萝卜固体培养基上生长更快，但麦麸固体培养基菌丝体生物量最高，其次依次是PDA、GPC、胡萝卜、麦芽汁和GPY固体培养基。

茶藨子叶状层菌40 d的GPY固体培养基三萜含量比60 d的胡萝卜固体培养基中高，然后依次为60 d的胡萝卜、麦麸和GPC 固体培养基。

程书华. 忍冬茶藨子叶层孔菌生药学研究[D]. 济南：山东中医药大学，2012.[2] MAKIMURA K，MURAYAMA YS，YAMAGUCHI H. Detection of awide range of medically important fungal species by polymerase chain reaction （PCR）[J]. J Med Microbiol，1994，40：358364.[3] 刘贵巧，何华奇，王建明. 一株野生食用菌株的种类鉴定研究[J]. 北方园艺，2014（12）：118121.[4] 陈飞，马闽卉，梁运祥，等. 不同品种灵芝固态发酵菌丝体多糖和三萜含量的比较[J]. 食品科技，2011，36（9）：1922.。