基因组装工具的过程与原理
2020年高考山东版高考生物 专题24 基因工程
专题24 基因工程挖命题【考情探究】考点考向考题示例素养要素难度预测热度1基因工程的原理及技术基因工程的基本操作程序2018课标全国Ⅰ,38,15分生命观念,科学思维中★★★基因工程的应用2018天津理综,10,14分生命观念,社会责任中★★★2基因工程的应用与蛋白质工程蛋白质工程2015课标全国Ⅱ,40,15分生命观念,科学探究0.4173★☆☆分析解读 基因工程在“生物工程技术”模块中占有举足轻重的地位,是高考命题的高频考点。
常考查基因工程三种工具的特点和作用、基因工程操作各个步骤的原理和方法。
高考命题时常常结合具体实例综合考查基因工程的基本操作程序和操作原理,其中限制酶的选择、基因表达载体的构建、目的基因的检测和鉴定等是本专题的难点,复习时应注意归纳梳理基因工程的基础知识,注重重难点知识的突破训练。
【真题典例】破考点考点一 基因工程的原理及技术【考点集训】考向 基因工程的基本操作程序1.(2019届黑龙江哈尔滨六中第二次月考,54)绿色荧光是由绿色荧光蛋白发出的,为培育能发出绿色荧光的小鼠,人们设计了如下的流程:(1)获取绿色荧光蛋白基因的常用方法有从基因文库中获取和 等。
(2)绿色荧光基因通常可以从基因文库中获取,含有一种生物一部分基因的文库称为 。
(3)A过程是基因工程的核心,常用到的工具酶有限制性核酸内切酶和 , 它们作用的化学键是 。
一个基因表达载体的组成,除了目的基因和复制原点外,还需有 、 以及标记基因等。
(4)B过程常用的方法是 。
(5)通常采用 技术检测外源基因是否插入到小鼠的基因组。
答案 (1)人工合成 (2)部分基因文库 (3)DNA连接酶 磷酸二酯键 启动子 终止子 (4)显微注射技术 (5)DNA分子杂交2.(2019届江苏徐州一中升级考试,41) PCR技术(多聚酶链式反应)成为分子生物学实验室的一种常规手段,其过程如图,PCR与DNA体内复制的比较如表,请回答下列问题:原料ATPDNA体内复制四种脱氧核苷酸需要脱氧胞苷三磷酸、脱氧腺苷三磷酸PCR不需要脱氧胸苷三磷酸、脱氧鸟苷三磷酸(1)加热使DNA双链打开,这一步是打开 键,称为 ,在细胞中是在 酶的作用下进行的。
简化基因组测序原理
简化基因组测序原理基因组测序是通过分析DNA序列来确定一个个体的基因组构成的过程。
它是生物学和遗传学研究的基础，也是现代医学和生物技术的重要工具。
基因组是一个个体的全部遗传信息的总和，它所包含的基因决定了生物个体的特征和功能。
基因组测序的目的是确定一个个体的基因组序列，从而帮助我们更好地理解生物个体的遗传特性和功能。
基因组测序的原理可以简化为以下几个步骤：1. 样本提取：首先，从目标个体的细胞中提取DNA样本。
这个样本可以是血液、组织或唾液等。
2. DNA纯化：提取的DNA样本可能含有其他杂质，需要进行纯化处理，将目标DNA分离出来。
3. DNA片段化：将纯化后的DNA样本进行片段化处理，将长的DNA分子切割成短的片段。
现代基因组测序通常是通过高通量测序技术进行，可以同时测序几百万个DNA片段。
4. 文库构建：将片段化的DNA样本与特定的测序文库适配体连接。
测序文库是一组DNA片段，每个片段都有一个特定的序列标签，用于测序后的数据解码和分析。
5. 扩增和测序：通过PCR（聚合酶链式反应）或其它扩增方法，复制文库中的DNA片段，形成大量的DNA模板。
然后，借助于高通量测序技术（如Illumina 测序仪），对DNA模板进行测序。
这些技术能够同时测序数百万个DNA片段，从而加快测序过程并降低成本。
6. 数据分析：测序仪会生成海量的原始测序数据，需要经过一系列的数据处理和分析步骤来得到准确的基因组序列数据。
首先，原始测序数据要经过识别和去除测序错误的步骤；然后，将测序片段拼接成完整的序列，这个过程称为基因组装。
最后，通过与已知的基因组数据库进行比对，将测序数据与参考序列对比，来确定碱基的次序和确定基因组上的随机突变。
以上就是基因组测序的主要原理和步骤。
随着技术的不断发展和进步，基因组测序已经成为一项快速、精确且富有信息的工具，对于基础科学研究、医学诊断和个体化治疗都具有重要的应用前景。
高中生物选修3教案 第1章 基因工程
专题一 1.1 DNA重组技术的基本工具1、教材分析《DNA重组技术的基本工具》是人教版生物选修三专题一《基因工程》的第一节，本节内容主要是介绍了DNA重组技术的三种基本工具，是学习《基因工程的基本操作程序》的基础和前提。
2、教学目标1．知识目标：（1）简述基础理论研究和技术进步催生了基因工程。
（2）简述DNA重组技术所需的三种基本工具。
2．能力目标：运用所学DNA重组技术的知识，模拟制作重组DNA模型。
3．情感、态度和价值观目标：（1）关注基因工程的发展。
（2）认同基因工程的诞生和发展离不开理论研究和技术创新。
3、教学重点和难点1、教学重点DNA重组技术所需的三种基本工具的作用。
2、教学难点基因工程载体需要具备的条件。
4、学情分析学生在必修课中已经学习过关于基因工程的基础知识，对于本部分内容已经有了初步了解，所以学习起来应该不会有太大的困难。
5、教学方法1、学案导学：见学案。
2、新授课教学基本环节：预习检查、总结疑惑→情境导入、展示目标→合作探究、精讲点拨→反思总结、当堂检测→发导学案、布置预习6、课前准备1．学生的学习准备：预习《DNA重组技术的基本工具》，初步把握DNA重组技术所需的三种基本工具的作用。
2．教师的教学准备：多媒体课件制作，课前预习学案，课内探究学案，课后延伸拓展学案。
七、课时安排：1课时一、教学过程(一) 预习检查、总结疑惑。
检查学生落实预习情况并了解学生的疑惑，使教学具有针对性。
（二）情景导入、展示目标。
教师首先提问：A.我们以前在哪部分学习过基因工程？（必修二从杂交育种到基因工程）B.回想一下，转基因抗虫棉是怎样培育出来的？经过了哪些主要步骤？（实质是基因工程的基本操作程序：目的基因的获取，基因表达载体的构建，将目的基因导入受体细胞，目的基因的检测与鉴定）从这节课开始，我们将深入学习基因工程，今天我们来学习DNA重组技术的基本工具。
我们来看本节课的学习目标。
（多媒体展示学习目标，强调重难点）（三）合作探究、精讲点拨。
rnp法敲除基因
rnp法敲除基因
RNP法是一种用于敲除基因的技术，它利用的是CRISPR/Cas9
系统。
CRISPR/Cas9系统是一种基因编辑工具，可以精确地切割DNA
分子，从而允许科学家们删除、修改或插入基因。
RNP法是
CRISPR/Cas9系统的一种应用方式，其优点在于可以减少细胞中CRISPR/Cas9系统的副作用，并提高基因编辑的准确性。
RNP法的基本原理是将CRISPR/Cas9系统中的Cas9蛋白和单导RNA（sgRNA）组装成RNP复合物，然后将其导入目标细胞。
RNP复
合物会与目标基因的特定序列结合，从而引导Cas9蛋白精确地切割DNA。
一旦DNA被切割，细胞会修复这一损伤，通常会导致目标基因
的敲除或修饰。
使用RNP法敲除基因的过程通常包括以下步骤，首先，设计合
适的sgRNA，使其能够与目标基因的特定序列结合；然后，将sgRNA
与Cas9蛋白组装成RNP复合物；接下来，将RNP复合物导入目标细胞；最后，观察细胞中目标基因的变化，并进行后续的分析和验证。
RNP法敲除基因具有许多优点，例如能够减少细胞中
CRISPR/Cas9系统的副作用，提高基因编辑的准确性，以及减少对
细胞的干扰。
因此，RNP法已经成为基因编辑领域中一种常用且有效的工具。
当然，在使用RNP法敲除基因时，仍然需要谨慎操作，以确保实验的准确性和可重复性。
基因测序仪_实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 了解基因测序仪的基本原理和操作流程。
2. 掌握基因测序的基本操作步骤。
3. 熟悉基因测序仪在实际科研中的应用。
二、实验原理基因测序仪是一种用于测定生物体DNA或RNA序列的仪器。
通过分析DNA或RNA分子中的碱基排列顺序，可以了解生物体的遗传信息。
目前，常见的基因测序技术主要有Sanger测序、Illumina测序和纳米孔测序等。
本实验采用Illumina测序技术，该技术具有高通量、高准确度、操作简便等优点。
Illumina测序原理基于Sanger测序技术，通过PCR扩增目的基因，然后将扩增产物进行文库构建，最后利用测序仪对文库进行测序。
三、实验材料与仪器1. 材料：目的基因DNA模板、引物、dNTPs、PCR酶、Illumina测序试剂盒等。
2. 仪器：PCR仪、基因测序仪、凝胶成像系统、移液器、离心机等。
四、实验步骤1. DNA提取：根据实验室常规方法提取目的基因DNA。
2. PCR扩增：设计特异性引物，进行PCR扩增目的基因。
3. 文库构建：将PCR扩增产物进行文库构建，包括末端修复、接头连接、PCR扩增等步骤。
4. 测序：将构建好的文库上机进行测序。
5. 数据分析：利用测序仪自带的分析软件或第三方分析软件对测序数据进行质控、比对、组装等分析。
五、实验结果与分析1. PCR扩增：通过凝胶成像系统观察PCR扩增结果，判断扩增是否成功。
2. 文库构建：通过PCR扩增结果和测序结果判断文库构建是否成功。
3. 测序：通过测序仪自带的分析软件对测序数据进行质控、比对、组装等分析，得到目的基因的序列。
4. 数据分析：将测序结果与参考序列进行比对，分析目的基因的结构和功能。
六、实验讨论1. 影响PCR扩增的因素：引物设计、模板DNA质量、PCR酶活性等。
2. 影响文库构建的因素：末端修复、接头连接、PCR扩增等步骤。
3. 影响测序的因素：测序仪参数设置、测序深度等。
4. 数据分析过程中需要注意的问题：比对准确性、组装质量等。
人类基因组计划原理和基本步骤
人类基因组计划原理和基本步骤人类基因组计划(humangenome projec t, HGP)是由美国科学家于1985年率先提出，于1990年正式启动的。
美国、英国、法国、德国、日本和我国科学家共同参与了这一预算达30亿美元的人类基因组计划。
序列图的绘制主要采用两大策略: 即逐个克隆法（Cloneby Clone）和全基因组鸟枪法（WholeGenome Shot-gun)。
逐个克隆法的原理逐个克隆法的原理是Sanger双末端终止法。
人类基因组框架图全部采用基于Sa nger双脱氧原理的自动化毛细管测序。
在1977年，英国人Fre deric k Sanger创建了双脱氧链末端合成终止法（chaintermin ation method），简称Sang er法、双脱氧法或酶法。
他发现如果在DNA复制过程中掺入ddNTP，就会产生一系列末端终止的DNA链，并能通过电泳按长度分辨。
不同末端终止DNA链的长度是由掺入到新合成链上随机位置的ddN TP决定的。
Sanger双末端终止法的基本原理是利用D NA聚合酶，以待测单链D NA为模板，以dNTP为底物，设立四种相互独立的测序反应体系，在每个反应体系中加入不同的双脱氧核苷三磷酸（dideox yribo nucle oside tripho sphat e，ddNTP）作为链延伸终止剂。
具体实验是通过PCR来完成的，但与普通PC R不同，它只需要一个引物而不是一对。
在4个相同的反应体系中分别加入普通的dNT P以及4种不同的dd NTP（比如体系1里面缺少dA TP，而有ddAT P,以此类推）。
假设四个体系中分别加入的是ddA TP, ddGTP, ddCTP和ddGTP我们就分别把这个叫做A，G，C，T体系，然后每个体系中，会在遇到相应碱基的时候停止反应，这样就产生了一系列长度不一并且分别在以A,G,C,T时终止的D NA片段，比如A体系中的DNA片段，都是以A结尾的DNA。
基因工程知识点全
第一章基因工程概述1.什么是基因工程,基因工程的基本流程基因工程Genetic engineering原称遗传工程;从狭义上讲,基因工程是指将一种或多种生物体供体的基因与载体在体外进行拼接重组,然后转入另一种生物体受体内,使之按照人们的意愿遗传并表达出新的性状;因此,供体、受体和载体称为基因工程的三大要素;1.分离目的基因2.限制酶切目的基因与载体3.目的基因和载体DNA在体外连接4.将重组DNA分子转入合适的宿主细胞,进行扩增培养5.选择、筛选含目的基因的克隆6.培养、观察目的基因的表达第二章基因工程的载体和工具酶1. 基因工程载体必须满足哪些基本条件➢具有对受体细胞的可转移性或亲和性;➢具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点;➢具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点;➢具有合适的筛选标记;➢分子量小,拷贝数多;➢具有安全性;2. 质粒载体有什么特征,有哪些主要类型1、自主复制性2、可扩增性3、可转移性4、不相容性主要类型有1.克隆质粒2.测序质粒3.整合质粒4.穿梭质粒5.探针质粒6.表达质粒3. 质粒的构建1删除不必要的 DNA 区域,尽量缩小质粒的分子量,以提高外源 DNA 片段的装载量;一般来说,大于20Kb 的质粒很难导入受体细胞,而且极不稳定;2灭活某些质粒的编码基因,如促进质粒在细菌种间转移的 mob 基因,杜绝重组质粒扩散污染环境,保证 DNA 重组实验的安全,同时灭活那些对质粒复制产生负调控效应的基因,提高质粒的拷贝数3加入易于识别的选择标记基因,最好是双重或多重标记,便于检测含有重组质粒的受体细胞;4在选择性标记基因内引入具有多种限制性内切酶识别及切割位点的 DNA序列,即多克隆接头Polylinker,便于多种外源基因的重组,同时删除重复的酶切位点,使其单一化,以便环状质粒分子经酶处理后,只在一处断裂,保证外源基因的准确插入;5根据外源基因克隆的不同要求,分别加装特殊的基因表达调控元件;4. 什么是人工染色体载体将细菌接合因子、酵母或人类染色体上的复制区、分配区、稳定区与质粒组装在一起,即可构成染色体载体5. 什么是穿梭载体人工构建的、具有两种不同复制起点和选择标记、可以在两种不同的寄主细胞中存活和复制的载体;6.入-噬菌体载体及构建-DNA为线状双链DNA分子,长度为,在分子两端各有12个碱基的单链互补粘性末端;➢1缩短长度提高外源 DNA 片段的有效装载量删除重复的酶切位点➢引入单一的多酶切位点接头序列,增加外源DNA片段克隆的可操作性➢灭活某些与裂解周期有关基因;➢使λ-DNA载体只能在特殊的实验条件下感染裂解宿主细菌,以避免可能出现的污染现象的发生;➢加装选择标记,便于重组体的检测单链噬菌体DNA载体➢过定点诱变技术封闭重复的重要限制性酶切口;➢引入合适的选择性标记基因,如含有启动子、操作子和半乳糖苷酶氨基端编码序列lacZ’的乳糖操纵子片段lac、组氨酸操纵子片段his以及抗生素抗性基因等;➢将人工合成的多克隆位点接头片段插在 lacZ’标记基因内部,使得含有重组子的噬菌斑呈白色,而只含有载体 DNA 的混浊噬菌斑呈蓝色;➢4在多克隆位点接头片段的两侧区域改为统一的 DNA 测序引物序列,使得重组 DNA 分子的单链形式经分离纯化后,可直接进行测序反应;8. II类限制性内切核酸酶的特点限制性核酸内切酶 Restriction endonucleases是一类能在特异位点上催化双链DNA 分子的断裂,产生相应的限制性片段的核酸水解酶;➢识别位点的特异性：每种酶都有其特定的DNA识别位点,通常是由4、5或6核苷酸组成的特定序列靶序列;➢识别序列的对称性：靶序列通常具有双重旋转对称的结构,即双链的核苷酸顺序呈回文结构;➢切割位点的规范性：双链DNA被酶切后,分布在两条链上的切割位点旋转对称可形成粘性末端或平末端的DNA分子;同位酶：一部分酶识别相同的序列,但切点不同,这些酶称为同位酶;同裂酶：识别位点与切割位点均相同的不同来源的酶称为同裂酶同尾酶Isocandamers：识别位点不同,但切出的 DNA 片段具有相同的末端序列,这些酶称为同尾酶;9.甲基化酶Ⅱ类限制性内切酶有相应甲基化酶伙伴,甲基化酶的识别位点与限制性内切酶相同,并在识别序列内使某位碱基甲基化,从而封闭该酶切口;甲基化酶在封闭一个限制性内切酶切口的同时,却产生出另一种酶的切口➢甲基化酶可修饰限制性核酸内切酶识别序列,从而使DNA免受相应的限制性核酸内切酶的切割;➢甲基化酶的用途就是在必要时可以封闭某一限制性核酸内切酶的酶切位点;连接酶连接作用的特点:①DNA连接酶需要一条DNA链的3’末端有一个游离的羟基-OH,另一条DNA链的5’末端有一个磷酸基-P的情况下,只有在这种情况下,才能发挥连接DNA分子的作用;②只有当3’－OH和5’－P彼此相邻,并且各自位于与互补链上的互补碱基配对的两个脱氧核苷酸末端时,DNA连接酶才能将它们连接成磷酸二酯键;③DNA连接酶不能连接两条单链的DNA分子或环化的单链DNA分子,被连接的DNA链必须是双螺旋DNA分子的一部分;④DNA连接酶只能封闭双螺旋DNA上失去一个磷酸二酯键所出现的单链缺口nick,而不能封闭双链DNA的某一条链上失去一个或数个核苷酸所形成的单链裂口gap;⑤由于在羟基和磷酸基团之间形成磷酸二酯键是一种吸能反应,因此,DNA连接酶在进行连接反应时,还需要提供一种能源分子NAD＋或ATP11.大肠杆菌 DNA聚合酶和Klenow大片段各有什么作用DNA聚合酶作用的特点：➢要有底物4种dNTP为前体催化合成DNA;➢接受模板指导;➢需要有引物3’羟基的存在;➢不能起始合成新的DNA链;➢催化dNTP加到生长中的DNA链3’-OH末端;➢催化DNA的合成方向是5’→3’;Klenow酶的基本性质：➢大肠杆菌DNA聚合酶I经胰蛋白酶或枯草杆菌蛋白酶部分水解生成的C末端604个氨基酸残基片段,即Klenow酶;分子量为76kDa;➢Klenow酶仍拥有5’→3’的DNA聚合酶活性和5’→3’的核酸外切酶活性,但失去了5’→3’的核酸外切酶活性;Klenow酶的基本用途：➢修复由限制性核酸内切酶造成的 3’凹端,使之成为平头末端;➢以含有同位素的脱氧核苷酸为底物,对DNA片段进行标记;➢用于催化 cDNA 第二链的合成;➢用于双脱氧末端终止法测定 DNA 的序列;聚合酶T4-DNA聚合酶酶的基本特性：➢有3’→5’的核酸外切酶活性和5’→3’的DNA聚合酶活性;➢在无dNTP时,可以从任何3’-OH端外切;➢在只有一种dNTP时,外切至互补核苷酸;➢在四种dNTP均存在时,聚合活性占主导地位;T4-DNA聚合酶的基本用途：切平由核酸内切酶产生的3’粘性末端13. 影响连接效率的因素有：➢温度最主要的因素离子浓度➢ATP的浓度 10μM - 1μM➢连接酶浓度平末端较粘性末端要求高➢反应时间通常连接过夜➢插入片段和载体片段的摩尔比➢DNA末端性质➢DNA片段的大小14.如何将不同DNA分子末端进行连接1.相同粘性末端的连接如果外源DNA与载体DNA均用相同的限制性内切酶切割,则不管是单酶酶解还是双酶联合酶解,两种DNA分子均含有相同的粘性末端,因此混合后能顺利的连接成一个重组DNA分子 2.平头末端的连接T4-DNA连接酶在ATP和高浓度酶的条件下,能连接具有完全碱基配对的平末端DNA分子,但平末端连接效率不高,基因操作不经常采用;3.不用粘性末端的连接3’端的粘性末端用T4-DNA聚合酶切平5’端的粘性末端用klenow酶补平,或者用S1核酸酶切平最后用T4-DNA连接酶进行平末端连接15. 碱性磷酸酶有什么作用1.该酶用于载体 DNA的5’末端除磷操作,以提高重组效率；2.用于外源DNA片段的5’端除磷,则可有效防止外源 DNA 片段之间的连接;16. 末端脱氧核苷酸转移酶有哪些作用➢给载体或目的DNA加上互补的同聚物尾;➢DNA片段3’末端的同位素标记;17. 2、细菌转化的步骤：∙感受态的形成;感受态时细胞表面出现各种蛋白质和酶类,负责转化因子的结合、切割及加工;感受态细胞能分泌一种小分子量的激活蛋白或感受因子,其功能是与细胞表面受体结合,诱导某些与感受态有关的特征性蛋白质如细菌溶素的合成,使细菌胞壁部分溶解,局部暴露出细胞膜上的 DNA 结合蛋白和核酸酶等;∙转化因子的结合;受体菌细胞膜上的DNA结合蛋白可与转化因子的双链DNA结构特异性结合,单链DNA或RNA双链RNA以及DNA/RNA杂合双链都不能结合在膜上;∙转化因子的吸收;双链 DNA 分子与结合蛋白作用后,激活邻近的核酸酶,一条链被降解,而另一条链则被吸收到受体菌中;∙整合复合物前体的形成;进入受体细胞的单链 DNA 与另一种游离的蛋白因子结合,形成整合复合物前体结构,它能有效地保护单链DNA免受各种胞内核酸酶的降解,并将其引导至受体菌染色体DNA处;∙转化因子单链DNA的整合;供体单链DNA片段通过同源重组,置换受体染色体DNA的同源区域,形成异源杂合双链 DNA结构;+诱导转化原理：①在0℃的Cacl2低渗溶液中,细菌细胞发生膨胀,同时Cacl2使细胞膜磷脂层形成液晶结构促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来,诱导大肠杆菌形成感受态;②Ca2+能与加入的DNA分子结合,形成抗DNA酶DNase的羟基-磷酸钙复合物,并黏附在细菌细胞膜的外表面上;当42℃热刺激短暂处理细菌细胞时,细胞膜的液晶结构发生剧烈扰动,并随之出现许多间隙,为DNA分子提供了进入细胞的通道;③Mg2+对DNA分子有很大的稳定性作用,因此利用Mgcl2与Cacl2共同处理大肠杆菌细胞,可以提高DNA的转化效率;∙但该法要求条件高,对外界污染物极为敏感,通常很少采用;介导细菌的原生质体转化∙PEG是乙二醇的多聚物, 存在不同分子量的多聚体,它可改变各类细胞的膜结构, 使两细胞相互接触部位的膜脂双层中脂类分子发生疏散和重组,此时相互接触的两细胞的胞质沟通成为可能,从而造成细胞之间发生融合;20.电穿孔法是指在细胞上施加短暂、高压的电流脉冲,在质膜上形成纳米大小的微孔,DNA直接通过这些微孔或者作为微孔闭合时所伴随发生的膜组分重新分布通过质膜进入细胞质中,这种方法称为电穿孔法;P52 接合转化,入噬菌体感染未归纳21.转化率的影响因素.载体及重组DNA方面载体本身的性质：不同的载体转化同一株受体细胞,其转化率不同;载体的空间构象：与受体细胞亲和性较强的质粒载体转化率要高于亲和性较弱的质粒载体; 插入片段大小：对质粒载体而言,插入片段越大,转化效率越低;重组DNA分子的浓度和纯度受体细胞方面：受体细胞必须与载体相匹配转化操作的影响22.转化细胞的扩增转化细胞的扩增操作：指转化完成之后细胞的短时间培养;在实验时,扩增操作往往与转化操作偶联在一起,如：∙Ca2+诱导转化后的37℃培养一个小时∙原生质体转化后的再生过程∙λ噬菌体转染后的30℃培养等,均属扩增操作扩增操作的目的∙增殖转化细胞,使得有足够数量的转化细胞用于筛选程序;∙扩增和表达载体分子上的标记基因,便于筛选;∙表达外源基因,便于筛选和鉴定;23.抗药性筛选法这是利用载体DNA分子上的抗药性选择标记进行的筛选方法;抗药性筛选法的基本原理：抗药性筛选法可区分转化子与非转化子、重组子与非重组子将外源DNA片段插在EcoRI位点：∙非重组子呈 Apr、Tcr∙重组子呈 Apr、Tcr将外源DNA片段插在BamHI位点：∙非重组子呈 Apr、Tcr∙重组子呈 Apr、Tcs抗药性筛选法的基本操作：先将转化液涂布含有Ap的平板再将Ap平板上的转化子影印至含有Tc的平板上在Ap平板上生长,但在Tc平板上不长的转化子即为重组子 P56抗药性标记插入失活选择法∙经过上述抗药性筛选获得的大量转化子中既包括需要的重组子,也含有不需要的非重组子;为了进一步筛选出重组子,可利用质粒载体的双抗药性进行再次筛选;如果外源基因插入在载体的抗药性基因中间使得该抗药性基因失活,这种抗药性标记就会消失,从而筛选出阳性重组子;24. 什么是蓝白斑筛选法这种方法是根据组织化学的原理来筛选重组体;主要是在λ载体的非必要区插入一个带有大肠杆菌β—半乳糖苷酶的基因片段,携带有lac基因片段的λ载体转入lac的宿主菌后,在含有5—溴—4—氯—3—引哚—β—D—半乳糖苷X-gal平板上形成浅蓝色的噬菌斑;外源基因插人lac或lac基因部分被取代后,重组的噬菌体将丧失分解X-gal的能力,转入lac-宿主菌后,在含有5—溴—4—氯—3—引哚—β—D—半乳糖苷 X-gal平板上形成白色的噬菌斑,非重组的噬菌体则为蓝色噬菌斑;筛选法利用合适的引物,以从初选出来的阳性克隆中提出的质粒为模板进行PCR,通过对PCR产物的电泳分析,确定目的基因是否插入到载体中;由于在载体DNA分子中,外源DNA插入位点的两侧序列多数是已知的,可以设计合成相应的PCR引物,以待鉴定的转化子或重组子的DNA为模板进行PCR反应,反应产物经琼脂糖凝胶电泳,若出现特异性扩增DNA带,并且其分子量同预期的一致,则可确定含此重组DNA分子的重组子是期待的重组子;第三章基因工程的常规技术1. 探针有哪些类型探针标记有哪些方法类型：同源或部分同源探针cDNA探针人工合成的寡核苷酸探针标记方法：①5’端标记法②反转录标记法③缺刻前移标记法④ABC标记法4.什么是ABC荧光显色酶标记法ABC 标记法;∙A为Avidin生物素抗性蛋白,每个Avidin分子可结合3 - 4个生物素分子；∙B为Biotin生物素,每个Biotin分子可结合2个Avidin分子；∙C为Complex,首先将Biotin共价结合在探针分子上,荧光胺标记在Avidin上,两者形成复合物,即可将荧光胺标记在探针上,发出的荧光也能使普通胶片感光;如果将某一生色酶接在Avidin上,并辅以合适底物,则杂交反应还可直接以颜色反应检测,这一技术称为酶标技术5.亚克隆法∙亚克隆：是将克隆片段进一步片段化后再次进行的克隆;∙一般是将重组DNA分别用几种限制性核酸内切酶切割后,将所得各片段分别重组到载体上再转化宿主细胞,然后通过转化细胞的表型鉴定或鉴定,获得含有目的基因的重组子;此时,该重组分子中的无关DNA区域以被大量删除;6. 菌落嗜菌斑原位杂交的基本原理、流程∙该项技术是直接把菌落印迹转移到硝酸纤维素滤膜上,经溶菌和变性处理后使DNA 暴露出来并与滤膜原位结合再与特异性DNA探针杂交,筛选出含有插入序列菌落;∙操作步骤：∙①菌落生长∙②转移到NC膜上∙③DNA释放和变性∙变成单链DNA：∙ 10％SDS NaOH∙④中和 Tris-HCl pH∙⑤固定 80 ℃ 120’∙⑥杂交包括预杂交,加探针DNA杂交∙⑦放射自显影∙⑧对照比较,选出重组克隆7.鸟枪法∙鸟枪法：将某种生物体的全基因组或单一染色体切成大小适宜的 DNA 片段,分别连接到载体 DNA上,转化受体细胞,形成一套重组克隆,从中筛选出含有目的基因的期望重组子;鸟枪法制备目的基因的主要步骤∙①目的基因组DNA片段的制备超声波处理：片段长度均一,大小可控,平头末端;原核生物的基因长度大都在2Kb以内,真核生物的基因长度变化很大,最大的基因可达100Kb以上;全酶切：片段长度不均一,粘性末端便于连接,但有可能使目的基因断开,大小不可控;部分酶切：片段长度可控,含有粘性末端,目的基因完整;∙②DNA片段与载体连接如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选,则选择多拷贝克隆载体；如果转化子采用基因产物功能检测法筛选,则选择表达型载体;∙③重组DNA分子导入受体细胞如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选,则选择大肠杆菌作为受体细胞；如果转化子采用基因产物功能检测法筛选,则选择能使目的基因表达的受体细胞;∙④筛选含有目的基因的目的重组子菌落原位杂交法、基因产物功能检测法筛选模型的建立;∙⑤目的基因的定位利用鸟枪法获得的期望重组子只是含有目的基因的 DNA 片段,必须通过次级克隆或插入灭活,在已克隆的 DNA 片段上准确定位目的基因,然后对目的基因进行序列分析,搜寻其编码序列以及可能存在的表达调控序列;法酶促逆转录主要用于合成分子质量较大,转录产物mRNA易分离的目的基因;这种方法以目的基因的mRNA为模板,在逆转录酶的作用下合成互补的DNA,即cDNA,然后在DNA聚合酶的催化下合成双链cDNA片段,与适当的载体重组后转入受体菌扩增,获得目的基因的cDNA克隆; 的分离纯化绝大多数的真核生物mRNA在其3’端都存在一个多聚腺苷酸的尾巴,利用它可以迅速的将mRNA从细胞总的混合物中分离出来,将寡聚脱氧胸腺嘧啶共价交联在纤维素分子上,制成亲和层析柱,然后将细胞总的RNA混合物上层析柱分离,mRNA会挂在层析住上,后洗脱即可分离10. 简述PCR技术的基本原理,PCR反应体系的主要成分与主要程序是怎样的PCR技术的基本原理：类似于DNA的天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物;过程：PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR 扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火复性：模板DNA经加热变性成单链后,温度降至55℃左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链;重复循环变性--退火--延伸三过程,就可获得更多的“半保留复制链”,而且这种新链又可成为下次循环的模板;每完成一个循环需2～4分钟, 2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍;11. 什么是基因组文库其构建方法是怎样的是指将某种生物的全部基因组的遗传信息贮存在可以长期保存的稳定的重组体中,以备需要时能够随时应用它分离所需要的目的基因,这种保存基因遗传信息的材料,就称为基因文库又称DNA文库;基因组文库构建的一般步骤①载体的选择和制备;②高纯度、大分子量基因组 DNA 的提取;③基因组 DNA 的部分酶切与分级分离;④载体与DNA片段的连接;⑤转化或侵染宿主细胞;⑥筛选鉴定基因组及保存;12. 基因组DNA文库的质量标准除了尽可能高的完备性外,一个理想的基因组DNA文库应具备下列条件：∙重组克隆的总数不宜过大,以减轻筛选工作的压力∙载体的装载量最好大于基因的长度,避免基因被分隔克隆;∙克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域,以利于克隆排序;∙克隆片段易于从载体分子上完整卸下;∙重组克隆能稳定保存、扩增、筛选;基因文库的构建通常采用鸟枪法和cDNA法13.外源DNA片段的切割原则片段之间要有一定的重叠序列片段大小要均一文库构建的步骤∙细胞总RNA的提取和mRNA的分离∙第一链cDNA合成∙第二链cDNA合成∙双链cDNA的分级分离∙双链cDNA克隆进质粒或噬菌体载体并导入宿主中繁殖∙重组体的筛选与鉴定第四章基因在大肠杆菌、酵母的高效表达1. 启动子∙启动子：是DNA链上一段能与RNA聚合酶结合并能起始转录的序列,其大小在20～300个碱基,是控制基因转录的重要调控元件;在一定条件下mRNA的合成速率与启动子的强弱密切相关,而转录又在很大程度上影响基因的表达;∙启动子的特征：①序列特异性②方向性③位置特性④种属特异性2.启动子类型∙组成型启动子：是指在该类启动子控制下,结构基因的表达大体恒定在一定水平上,在不同组织、部位表达水平没有明显差异;∙组织特异启动子：又称器官特异性启动子;在这类启动子调控下,基因往往只在某些特定的器官或组织部位表达,并表现出发育调节的特性;∙诱导型启动子：是指在某些特定的物理或化学信号的刺激下,该种类型的启动子可以大幅度地提高基因的转录水平;目前已经分离了光诱导表达基因启动子、热诱导表达基因启动子、创伤诱导表达基因启动子、真菌诱导表达基因启动子和共生细菌诱导表达基因启动子等;3.终止子终止子：是位于结构基因下游的一段DNA序列,基因转录时,该序列被转录为mRNA的一部分,并形成特殊的二级结构,由此终止基因的转录;序列SD序列：mRNA中起始密码子上游8-13个核苷酸处有一段富含嘌呤核苷酸的顺序,它可以与30S亚基中的16S rRNA 3’端富含嘧啶的尾部互补,形成氢键结合,有助于mRNA的翻译从起始密码子处开始5.密码子不同生物对密码子的偏爱性1.生物体基因组中的碱基含量2.密码子与反密码子的相互作用的自由能3.细胞内tRNA的含量6. 密码子偏爱性对外源基因表达的影响∙由于原核生物和真核生物基因组中密码子的使用频率具有较大程大的差异性,因此外源基因尤其是高等哺乳动物基因在大肠杆菌中高效翻译的一个重要因素是密码子的正确选择;一般而言,有两种策略可以使外源基因上的密码子在大肠杆菌细胞中获得最佳表达：∙外源基因全合成∙同步表达相关tRNA编码基因7. 包涵体及其性质在某些生长条件下,大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子,它们致密地集聚在细胞内,或被膜包裹或形成无膜裸露结构,这种水不溶性的结构称为包涵体8. 包涵体的形成机理∙①折叠状态的蛋白质集聚作用;∙②非折叠状态的蛋白质集聚作用∙③蛋白折叠中间体的集聚作用;9. 包涵体的分离检测∙包涵体的分离主要包括菌体破碎、离心收集以及清洗三大操作步骤;10. 分泌型目的蛋白表达系统的构建∙包括大肠杆菌在内的绝大多数革兰氏阴性菌不能将蛋白质直接分泌到胞外,但有些革兰氏阴性菌能将细菌的抗菌蛋白细菌素分泌到培养基中,这一过程严格依赖于细菌素释放蛋白,它激活定位于内膜上的磷酸酯酶A,导致细菌内外膜的通透性增大∙因此,只要将细菌素释放蛋白编码基因克隆在一个合适的质粒上即可构建完全分泌型的受体细胞;此时,用另一种携带大肠杆菌信号肽编码序列和目的基因的表达质粒转化上述完全分泌型受体细胞,并使用相同性质的启动子介导目的基因的转录,则可实现目的蛋白从重组大肠杆菌中的完全分泌;11融合蛋白表达质粒的构建原则：∙受体细胞的结构基因能高效表达,且其表达产物可以通过亲和层析进行特异性简单纯化;。
DNA合成的原理与方法
DNA合成的原理与方法DNA合成是指将单个核苷酸迅速连接成DNA分子，这是一个生物化学的过程。
它是DNA复制和基因组宏基因组学中必不可少的过程，因为DNA合成是生命体进化和繁殖的关键步骤。
在本文中，将介绍DNA合成的基本原理和方法。
DNA合成的基本原理结构上，DNA由两条互补的链组成，每个链由一些核苷酸组成。
核苷酸由一个五碳糖、一个苷基和一个磷酸基组成。
在DNA链中，核苷酸通过它们之间的磷酸酯键连接在一起。
这些酯键在形成DNA分子时形成了磷酸二酯键杆。
DNA合成是一个需要高能物质的过程。
在细胞周期的S期，DNA合成会被触发，这是为了让染色体复制以备细胞分裂。
细胞通过不断地使用ATP分解来释放能量，提供给DNA合成反应所需的高能物质。
DNA合成的方法DNA复制可以分成两个步骤：模板DNA链的拆分和新合成的DNA的组装。
DNA合成的方法如下：1. 拆分模板DNA链。
DNA复制开始时，两个互补的链都需要通过酶的作用分离开来。
在这种情况下，酶称为DNA脱氧核苷酸链终止酶，或称拉格酶。
拉格酶对模板DNA进行切割，使RNA 引物被加到DNA链上。
2. 添加引物。
在DNA复制过程中，DNA合成酶不能直接合成DNA链，因为它没有起始位置。
因此，必须有一小部分RNA链被添加到DNA链上，称为RNA引物。
DNA链上的RNA引物将为DNA合成酶提供启动点。
3. 新的DNA链的组装。
一旦引物和DNA合成酶都聚集在基因组的起始点上，DNA合成酶可以开始将新的DNA链组装在已存在的DNA链上。
这个过程涉及到DNA合成酶将新的核苷酸加入到芯片DNA链的所有位置，按照RNA引物指示的方向进行。
4. 砍断RNA引物。
最后，DNA合成酶也需要处理添加到DNA 链上的RNA引物。
它做的是将这些引物破坏，以便RNA链不与DNA链结合，而新的DNA链可以匹配起来，形成一个完整的双链DNA分子。
DNA合成的其他原理除了上述的步骤之外，DNA合成还有另外一些原理。
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基因组装工具的过程与原理
基因组装是指通过体外方法,按照设计从单个核苷酸片段构建出全基因组或大片基因组的过程。
目前常用的基因组装方法有两大类:
一、基于酶切的基因组装
1. 设计目标基因组序列,并经软件在全序列上选择酶切位点。
2. 经合成获得所有短小DNA片段,两端含有酶切位点。
3. 将所有DNA片段混合,经连接酶或组装酶识别酶切位点,将这些片段连接起来。
4. 最后经PCR填充连接间隙,组装出完整的目标基因组序列。
此方法依赖于DNA序列特异性酶切位点的设计,酶切连接反应完成序列拼接。
二、基于DNA合成的基因组装
1. 根据目标基因组序列,设计大量短小的重叠DNA片段。
2. 化学合成获得所有重叠DNA片段。
3. 将这些DNA片段混合,重叠区域发生自发杂交。
4. 经过PCR或Gibson组装反应,成功拼接成完整的基因组。
此方法依赖DNA片段的重叠设计,利用同源重组反应完成准确拼接。
相比传统的克隆方法,以上基因组装技术可以在体外直接合成长片段甚至整个基因组。
其主要优势有:
1. 效率高,不依赖载体,只需简单的体外混合反应。
2. 精准度高,可以按照设定序列合成。
3. 操作容易,合成产物易于设计和检测。
4. 成本低,合成小片段的成本较低。
综上所述,基因组装技术利用酶切位点设计或序列重叠设计,采用体外酶切连接或同源重组反应,可以高效、精准地实现长片段DNA的合成,是合成生物学领域非常重要的工具,推动了合成生物学和合成基因组的发展。