人肺癌A549细胞凋亡相关基因的表达及意义
得力生诱导肺癌细胞株A549细胞凋亡及其对survivin基因表达的影响
Ｃａ ｅ ４ ｌ ｎ Ｖｉｒ ｎｃ ｒ Ａ５ ９ Ｃｅｌｉ ｔ ｏ
ＺＨ ＡＮＧ ｎ— ａ ＤＩ Ｇ ｅ — ｏ ｇ ＸＩ Ｙａ ｘｉ ， Ｎ Ｗ ｉｒ ｎ ， ＡＯ － Ｚｕ ｋｅ
（ ． ０ ６Ｇｒ ｄ ｆＭ ｅ ｉ ｌ ｐ ｒｍｅ ｔ ｆ Ｇｒ ｄ ａｅＳ ｈ ｏ ， ｎ ｈ ｎ ｎ ｖｒｉ １ ２ ０ ａ ｅ ｄ ｃ ｏ ａ Ｄｅ ａ ｔ ｎ ａ ｕ ｔ ｃ ｏ ｌ Ｎａ ｃ ａ ｇ Ｕ ｉｅｓｔ ｏ ｙ；
关 键 词 ： 力生 ； ５９ 得 Ａ ４ 细胞株 ； 细胞凋亡 ； ｕｖ ｉ ｓｒｉｎ ｖ
中图分 类号 ： ７４２ Ｒ ３．
文献标 识 码 ： Ａ
文章编 号 ： ００ ２４２０）１ ０４ －０ １０ —２９ （０９０ － ０７ ４
Ｔｈ ｆ ｃ ｆＤｅ ｉｈｅ ｎ Ｉ ｄｕ ｉ ｇ Ａｐ ｐｔ ｓｓ ａ ｕ ｖ ｖ ｎ ｅ Ｅｆ ｅ ｔ ｏ ｌｓ ｎｇ ｉ ｎ ｃ ｎ ｏ ｏ ｉ ｎｄ Ｓ ｒ ｉ ｉ Ｅｘ ｒ ｓ ｉ ｎ ｏ ｕ ａ ｎ ｓ ａ ｌＣｅ ｌＬｕ ｐ ｅ ｓ ｏ ｆ Ｈ ｍ ｎ Ｎｏ — ｍ ｌ ｌ ｎｇ
张艳 霞 ， 丁伟 荣。 肖祖克 。 ，
（ ． 昌 大 学 研 究 生 院 医 学 部 ２ ０ 级 ；２ 江 西 省 人 民 医 院 呼 吸 内科 ， 昌 ３ ０ ０ ） １南 ０６ ． 南 ３ ０ ６
摘 要 ：目的
探讨 中成药得力生诱 导肺癌 细胞株 Ａ ４ 细胞 凋亡 及其 对 ｓｒｉｎ 因表 达 的影响 。方法 ５９ ｕｖ ｉ基 ｖ
ｅ ｐｒ ｓ ｉｎ ｆｈｕ ａ ｏｎ ｓ ｌ ｃ ｌ ｌ ｎｇ ｃ ｎｃ ｒ Ａ５ ｅ １ Ｍ ｅ ｈｏ ｓ Ｍ ＴＴ ｓ ａ ｓ ｕｓ ｄ ｔ ｅ ｘ ｅ ｓｏ ｏ ｍ ｎ ｎ — ｍａ ｌ ｅ ｌ ｕ ａ ｅ ４９ ｃ ｌ． ｔ ｄ ａ ｓ ｙ ｗａ ｅ ｏ ｄ — ｔ ｒ ｎ ｈｅｐｒ ｉｅ ａ ｉ ｎｈｉ ｔｏｎ ｂ ｌｓ ｎ ｏ Ａ５ ｅ １ ｅ ｍｉ ｅ ｔ ｏｌ ｒ ｔｏｎ ｉ ｂｉｉ ｙ Ｄｅ ｉｈｅ ｇ ｔ ４９ ｃ ｌ．Ａｎｎｅ ｎ— ｋｉ ｗａ ｓ ｄ ｔ ｅ ｔｔ ｅ ｆ ｘｉ Ｖ ｔ ｓ ｕ ｅ ｏ ｔ ｓ ｈ
a549细胞形态特点
a549细胞形态特点a549细胞是一种人类肺腺癌细胞系，广泛应用于肺腺癌的研究中。
在细胞形态特点方面，a549细胞表现出以下几个特点：1. 细胞形态a549细胞呈椭圆形或卵圆形，大小约为15-30μm。
细胞质呈淡紫红色，细胞核位于细胞中央，呈圆形或椭圆形，直径约为10-15μm。
细胞核染色质均匀分布，核仁明显。
细胞质内含有丰富的细胞器，如内质网、高尔基体、线粒体等。
2. 细胞表面特征a549细胞表面呈现出微绒毛状结构，使细胞表面显得粗糙。
细胞表面还存在一些微细突起，使细胞具有一定的粘附性。
这些突起结构有助于细胞与周围细胞或基质进行黏附和相互作用。
3. 细胞增殖特点a549细胞具有较高的增殖能力，在培养基中可形成较为紧密的细胞群。
细胞群中的细胞紧密排列，呈薄板状或长条状。
细胞生长速度较快，通常在培养基中可见到细胞的分裂和增殖现象。
4. 细胞迁移特点a549细胞具有一定的迁移能力，在培养基中可形成细胞单层的移行现象。
细胞从初始位置逐渐移动到周围空白区域，形成新的细胞单层。
细胞迁移速度较快，表现出较强的侵袭性。
5. 细胞凋亡特点a549细胞在一定条件下可发生凋亡现象。
凋亡细胞通常具有以下特点：细胞体积缩小，细胞核凝缩和碎裂，细胞质内出现凋亡小体等。
凋亡细胞通常会被周围细胞或者巨噬细胞吞噬，从而完成清除和消除的过程。
a549细胞具有椭圆形或卵圆形的细胞形态，细胞表面具有微细突起和微绒毛状结构，细胞增殖速度快且具有迁移能力，同时可发生凋亡现象。
这些形态特点使得a549细胞在肺腺癌的研究中具有重要的应用价值，并且为科学家们提供了一个重要的模型系统，以进一步研究肺腺癌的发生机制、治疗方法及预后评估等方面的问题。
miR_214对人肺癌A549细胞增殖和侵袭能力的影响
肺癌是对人类生命威胁最大的恶性肿瘤之一。
早期研究表明在部分人类癌症发病机制中MicroRNA(miRNA)的改变可能参与调控[1]。
小分子RNA(miRNAs)是一种内源性的单链非编码RNA，成熟miRNA主要通过与靶基因的3UTR区特异结合来抑制靶基因的转录和翻译过程，引起靶基因mRNA发生降解或翻译受到抑制，进而发挥其生物学功能[2]。
miRNA被认为在多种细胞过程中发挥关键作用如扩散、生长、分化与细胞凋亡[3,4]。
近年来越来越多的研究发现miRNA在乳腺癌、 胃癌、直肠癌及白血病等许多恶性肿瘤的发生过程起着癌基因及抑癌基因作用。
但对于miRNA在肺癌发病机制中的作用还知之甚少[5]。
本研究构建了miR-214的真核表达载体，并将其转染人肺癌A549细胞，以探讨其对A549细胞增殖和侵袭能力的影响。
1材料和方法1.1 细胞培养和转染 人肺腺癌细胞株A549，用含有10%新生牛血清，100 U/ml的青霉素和100 U/ml 的链霉素的DMEM培养液在37℃、5%CO 2饱和湿度条件下培养。
当细胞生长至对数生长期后，按照lipo2000(Invitrogen公司)说明书的方法进行转染。
细胞转染48h后进行后续相关实验。
1.2 Real-time PCR 用Trizol(Invitrogen公司)提取细胞总RNA后反转录为cDNA(Takara)。
miR-214的反转录引物为5′-GTC GTA TCC AGT GCA GGG TCC GAG GTA TTC GCA CTG GAT ACG ACA CTG CC-3′；real-time PCR引物序列：上游引物5′- GGA CAG CAG GCA CAG ACA-3′，下游引物5′- CAG TGC AGG GTC CGA GGT-3′。
以U6为内参，反转录引物序列为5′-GTC GTA TCC AGT GCA GGG TCC GAG GTA TTC GCA CTG GAT ACG ACA AAA TAT GGA AC-3′；real-time PCR引物序列：上游引物作者简介：林述琨(1958-)，男，本科，主治医师，主要从事病理诊断工作，E-mail：ling-tong-sheng@通讯作者：温吉海(1966-)，男，本科，主任医师，肺外科主任，副院长，主要从事肺外科工作，E-mail：wen-jihai@The effects of miR-214 on proliferation and invasion abilities of lung cancer cell line A549ｍｉＲ－２１４对人肺癌Ａ５４９细胞增殖和侵袭能力的影响林述琨1 王耀鹏1 温吉海21.大连，普兰店市中心医院病理科；2.普兰店市中心医院肺外科中图分类号 R735.1 文献标识码 A 文章编号 1672-2809(2012)36-0031-04 LIN Shu-tun 1，WANG Yao-peng 1，WEN Ji-hai 21.Department of Pathology,Pulandian central hospital,Da lian 116200,China；2.Department of Thoracic Surgery,Pulandian central hospital,Da lian 116200,China[摘要] 目的：通过构建miR-214的真核表达载体，研究其对人肺癌A549细胞增殖和侵袭能力的影响。
A549肺癌细胞条件培养液促进人骨髓间充质干细胞的增殖和迁移
CHINESE JOURNAL OF ANATOMY V ol.44 No.1 2021 解剖学杂志 2021年第44卷第1期A549肺癌细胞条件培养液促进人骨髓间充质干细胞的增殖和迁移*姜杨1王璐璐1金海峰1姚立杰1张嵩2刘丹阳3李永涛1张善强1沈雷1△（齐齐哈尔医学院，1 解剖学教研室，2 细胞生物学教研室，3 组织学胚胎学教研室，齐齐哈尔 161006）摘要目的：探讨A549肺癌细胞对人骨髓间充质干细胞（hBMSCs）增殖和运动的影响。
方法：以提取A549肺癌细胞和BEAS-2B正常人肺上皮细胞上清液制备条件培养基，培养的hBMSCs分别为A549组和BEAS-2B组；2组均添50 nmol/L趋化因子-8（CXCL-8），分别为A549 C组和BEAS-2B C组，若同时添加100 nmol/L triciribine （Akt抑制剂）分别为A549 CT组和BEAS-2B CT组；A549组加入100 nmol/L triciribine为A549 T组。
正常条件下培养的hBMSCs为对照组。
ELISA检测细胞上清液中CXCL-8含量和hBMSCs裂解液Akt、P-Akt蛋白的表达。
MTT实验、流式细胞仪和transwell细胞小室实验分别检测各组hBMSCs吸光度值（A490值）、细胞凋亡率和细胞迁移数目。
结果：与BEAS-2B上清液相比，A549上清液中CXCL-8含量明显升高。
各组hBMSCs的A490值、细胞凋亡率、细胞迁移数目、Akt和P-Akt蛋白表达等均具有显著差异，尤以A549 C组hBMSCs最明显。
与A549 C 组相比，A549 CT组hBMSCs的A490值和细胞迁移数目、Akt和P-Akt蛋白表达均降低，细胞凋亡率升高较显著。
结论：A549细胞表达的CXCL-8能激活Akt通路，促进hBMSCs增殖和运动。
关键词趋化因子-8；人骨髓间充质干细胞；Akt信号通路；细胞迁移Conditioned media prepared from A549 lung carcinoma cells promotes the proliferation and migration of human bone marrow mesenchymal stem cells*Jiang Yang1， Wang Lulu1， Jin Haifeng1， Yao Lijie1， Zhang Song2， Liu Danyang3，Li Yongtao1， Zhang Shanqiang1， Shen Lei1△（1. Department of Anatomy，2. Department of Cell Biology，3. Department of Histology and Embryology， Qiqihar Medical University， Qiqihar 161006， China）Abstract Objective：To investigate the effect of A549 cells （lung carcinoma cells） on the proliferation and migration of human bone marrow mesenchymal stem cells （hBMSCs）. Methods： The supernatants of A549 cells and BEAS-2B cells （the normal human bronchial epithelial cell line）were extracted. hBMSCs cultured with the supernatants were called A549 group and BEAS-2B group respectively； 50 nmol/L chemokine-8 （CXCL-8）was added to both groups to form A549 C group and BEAS-2B C group； 100 nmol/L triciribine （Akt inhibitor） was added at the same time to form A549 CT group and BEAS-2B CT group； 100 nmol/L triciribine was added to A549 group to form A549 T group. hBMSCs incubated in the conventional condition were served as the control group. The CXCL-8 in the cell culture supernatants and the expression of Akt and P-Akt in hBMSCs lysates were tested by ELISA. MTT assay， flow cytometry and transwell assay were used to detect the absorbance （A490）， apoptosis rate and the number of migrating cells in each group respectively. Results： Compared with the BEAS-2B supernatant， the CXCL-8 in the A549 supernatant was significantly increased. There were significant differences in A490， apoptosis rate， the number of migrating cells， and Akt and P-Akt expressions of hBMSCs in each group， especially in A549 C group. Compared with the A549 C group， the A490 and the number of migrating cells， Akt and P-Akt expression of hBMSCs in the A549 CT group were reduced， but the apoptosis rate was increased significantly. Conclusion： CXCL-8 expressed by A549 cells can activate the Akt pathway and promote the proliferation and migration of hBMSCs.Key words C-X-C motif chemokine ligand-8；human bone marrow mesenchymal stem cell； Akt signaling pathway； cell migrationdoi： 10.3969/j.issn.1001-1633.2021.01.003·论 著·* 黑龙江省卫生健康委员会科研课题（2018470）第1作者 E-mail：*****************.cn△通信作者，E-mail：******************.cn收稿日期：2020-04-09；修回日期：2020-09-09间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSC）是促成肺癌发生的因素之一[1]。
PUMA基因转染对人肺癌A549细胞的促凋亡作用及其机制研究的开题报告
PUMA基因转染对人肺癌A549细胞的促凋亡作用
及其机制研究的开题报告
【摘要】
肺癌在全球范围内是最常见的恶性肿瘤之一，治疗方案的探索一直是临床医学的重要研究方向。
近年来，基因治疗作为一种新型的治疗手段备受关注。
本文将研究PUMA基因转染对人肺癌A549细胞的促凋亡作用及其机制，为肺癌的治疗开发提供新的治疗思路。
【研究目的】
1.探究PUMA基因转染对人肺癌A549细胞的促凋亡作用。
2.研究PUMA基因转染对A549细胞凋亡机制的影响。
【研究方法】
1.实验室模拟A549细胞。
2.将PUMA基因构建成转染载体。
3.通过Western blot和RT-qPCR检测PUMA基因转染后A549细胞凋亡相关蛋白和mRNA的表达水平。
4.采用流式细胞术检测在PUMA基因转染下A549细胞的凋亡率。
【预期结果】
通过对PUMA基因的转染，可以显著提高A549细胞的凋亡率，同时降低细胞增殖率。
同时，PUMA基因转染的机制主要是通过调节Bcl-
2/Bax通路的平衡，使其向凋亡信号通路倾斜。
【意义】
本研究将探究PUMA基因转染对肺癌的治疗效果以及其可能的作用机制，为肺癌的治疗提供新的思路和理论基础。
通过该研究，可以为肺癌治疗提供新的方案和方法，同时也为基因治疗的应用提供理论支持。
肺腺癌A549细胞抗失巢凋亡相关基因的确认及C8orf4基因的表达
西安 ７ ０ ３ １０ ８
１７ ） 男 河南温县人 ， 博士 ， 主治医师 ， ， 讲师 主要研究方 向： 肺癌的发病分子机制 。Ｅ— ａ ： ｅ ｈｉ ｍ ｕ ｅ ｕ ｃ ｍ ｉ ｌ ｎａ ｌｉ ｗ ＠ｆ ｍ ．ｄ ．ｎ 【 作者简介 】 李 文海（９ ３一 ， ，
１６ ， 河南沁 阳人 ， 博士 ， 主任医师 ， 教授 ， 主要研究方 向： 肺癌的多学科 治疗 。 【 通讯作者 】 李小飞（ ９ １一）男 ，
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∞ ｖｒ ａｓｒ ｔ ｎ—ｐｌ ｅ ｓ ｃａ ａｔ ｎ Ｒ ｅ ｅｒ ｃｐｏ ｓ ｔ ｅｄｆ ｒｎｉ ｅ ｐｅ— ｌ ｓ ｔｎ ｉ ｉ ｏ ｍ ｒ ｅ ｈ ｉ ｒ ｃｉ （ Ｔ—Ｐ Ｒ）ａｄＷｅｔ ｎ ｂ ｏｔｎ ． Ｒｅ ｕｌｓ：Ｔｈ ｉ ｅ ｅ ｔａ ｘ ｒ ｓ ｙ ａ ｎｅ ｏ Ｃ ｎ ｓ ｒ ｌｔｉ ｇ ｅ
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安罗替尼对肺癌细胞A549增殖、凋亡的影响及对PI3K
激光生物学报ACTA LASER BIOLOGY SINICAVol. 32 No. 4Aug . 2023第32卷第4期2023年8月收稿日期：2023-03-11；修回日期：2023-05-26。
基金项目：山西省自然科学基金面上项目（201901D 111371）。
* 通信作者：邓双年，主治医师，主要从事各种实体肿瘤内科治疗方面的研究。
E-mail: dsn 9484647251@ 。
安罗替尼对肺癌细胞A549增殖、凋亡的影响及对PI3K/AKT 通路的调控邓双年a*，李 娟b ，李 辉c（临汾市人民医院 a. 肿瘤科；b. 消化科；c. 胸外科，临汾 041000）摘 要：基于磷脂酰肌醇3-激酶（PI 3K ）/丝苏氨酸蛋白激酶（AKT ）信号通路探究安罗替尼对A 549细胞增殖、凋亡的影响。
将A 549细胞分为对照组、各剂量试验组、安罗替尼组、阳性药物组、抑制剂组和激活剂组。
干预24 h 后检测A 549细胞活力、细胞形态、增殖率、凋亡情况及相关蛋白的表达水平。
结果显示：20 μmol/L 安罗替尼处理后，A 549细胞活力降低；安罗替尼组和阳性药物组较对照组A 549细胞生长受到抑制，细胞增殖率、细胞周期素D 1（Cyclin D 1）及p-PI 3K 、p-AKT 的表达水平降低，细胞凋亡数量和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）的表达水平升高。
抑制剂增强了上述各指标的变化，而激活剂则具有与抑制剂相反的趋势。
该研究结果说明，安罗替尼可显著抑制人肺癌A 549细胞的增殖并促进其凋亡，其作用机制可能与抑制PI 3K/AKT 通路的信号转导相关。
该研究结果进一步说明了安罗替尼作为抗肺癌药物的潜在价值，为抗肺癌药物的研发提供了新的理论基础。
关键词：安罗替尼；肺癌；激酶信号通路；增殖；凋亡中图分类号：R 734.2 文献标志码：A DOI ：10.3969/j.issn.1007-7146.2023.04.009Effect of Anlotinib on Proliferation and Apoptosis of Lung Cancer cellA549 and Regulation of PI3K/AKT PathwayDENG Shuangnian a*, LI Juan b , LI Hui c(Linfen People ’s Hospital a. Department of Oncology; b. Department of Gastroenterology; c. Department of Thoracic Surgery,Linfen 041000, China)Abstract: To investigate the effects of anlotinib on proliferation and apoptosis of A 549 cells based on phosphatidylinosi-tol 3-kinase (PI 3K)/serine-threonine protein kinase (AKT) signaling pathway. A 549 cells were divided into the control group, the experimental groups with different doses, the anlotinib group, the positive drug group, the inhibitor group and the activator group. The intervention time was 24 hours. The cell viability, cell morphology, the rate of proliferation, apoptosis and related protein expression levels were detected. The results showed that cell viability decreased after treatment with 20 μmol/L anlo-tinib. Compared with the control group, the cell growth of anlotinib group and positive drug group was inhibited, the cell prolif-eration rate, cysteinyl aspartate specific proteinase D 1 (Cyclin D 1) and the expression levels of p-PI 3K and p-AKT decreased, and the number of apoptosis cells and the expression of cysteine aspartic protease-3 (Caspase-3) increased. The inhibitor en-hanced these changes, while the activator had the opposite trend to the inhibitor. These results of this study indicate that anlotinib can significantly inhibit the proliferation and promote apoptosis of A 549 cells, and its mechanism might be related to the inhibi-tion of PI 3K/AKT pathway signal transduction. The results of this study further illustrate the potential value of antilung cancer drugs and provide a new theoretical basis for the research and development of anti-lung cancer drugs.Key words: anlotinib; lung cancer; kinase signaling pathway; proliferation; apoptosis （Acta Laser Biology Sinica , 2023, 32(4): 360-367）361第4期肺癌（lung cancer）为常见恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率在我国居于首位［1］。
细胞凋亡实验报告
细胞凋亡实验报告细胞凋亡实验报告引言：细胞凋亡是一种重要的细胞死亡方式，它在维持生物体内部平衡和发育过程中起着关键作用。
本次实验旨在通过细胞凋亡实验，探究不同因素对细胞凋亡的影响，从而进一步了解细胞凋亡的机制和调控。
材料与方法：1. 细胞系：使用人类肺癌细胞系A549作为实验对象。
2. 药物：选择化学药物紫杉醇（Paclitaxel）作为细胞凋亡诱导剂。
3. 细胞培养条件：将A549细胞系在含有DMEM培养基和10%胎牛血清的培养皿中培养，保持在37℃、5% CO2的恒温培养箱中。
实验步骤：1. 细胞培养：将A549细胞系接种于培养皿中，培养至细胞密度达到80%左右。
2. 细胞处理：将培养皿中的培养基抽取，加入不同浓度的紫杉醇处理液，分为高、中、低三个浓度组，每组设置相应的对照组。
3. 细胞观察：将处理后的细胞培养皿放回恒温培养箱中，培养24小时后观察细胞形态和数量的变化。
4. 细胞计数：使用显微镜观察细胞数目，并通过计数室内的细胞数目，计算细胞存活率。
5. 细胞凋亡检测：使用流式细胞仪检测细胞凋亡率，采用荧光染料标记细胞并进行分析。
结果与讨论：在本次实验中，我们观察到不同浓度的紫杉醇处理后，A549细胞的形态和数量发生了明显变化。
在高浓度组，细胞数量明显减少，细胞形态发生变化，出现细胞收缩和凋亡体的形成。
而在低浓度组，细胞数量减少较少，细胞形态变化不明显。
对照组中，细胞数量和形态均与处理组相似。
通过细胞计数的结果，我们计算出了细胞存活率，并发现随着紫杉醇浓度的增加，细胞存活率逐渐降低。
这说明紫杉醇可以诱导A549细胞发生凋亡，并且凋亡率与药物浓度呈正相关。
进一步使用流式细胞仪检测细胞凋亡率，我们发现在高浓度组中，细胞凋亡率明显增加，而在低浓度组和对照组中，细胞凋亡率相对较低。
这与细胞存活率的结果相一致，进一步验证了紫杉醇可以诱导A549细胞发生凋亡的能力。
细胞凋亡是一种高度调控的细胞死亡过程，它在生物体内部平衡和发育过程中发挥着重要作用。
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摘要】目的比较耐顺铂的人肺腺癌细胞(A549DDP)凋亡相关基因的表达与亲代A549细胞的差异，探讨细胞凋亡与细胞耐药的发生机制。
方法应用Oligo GE Array细胞凋亡基因芯片，检测A549和A549DDP细胞相关凋亡基因表达水平。
结果A549DDP细胞表达BAD、BAG3、BFAR、CARD8、CASP6、GADD45、TNFRSF14、CD70、TRADD、TRAF1、TRAF3基因较亲代A549细胞显著增高(P<0.05),二者比值上调2倍以上。
结论肺腺癌A549DDP细胞过表达上述凋亡相关基因，可能是导致细胞凋亡受抑、细胞耐药的主要原因。
【关键词】肺癌;凋亡基因;细胞凋亡;耐药细胞耐药是导致化疗失败的主要原因。
研究发现耐药的发生与细胞凋亡基因的异常表达密切相关。
采用Oligo GE Array细胞凋亡基因芯片方法检测细胞凋亡相关基因，具有敏感性高、速度快和重复性好等优点。
目前尚未见以Oligo GE Array细胞凋亡基因芯片方法检测A549细胞凋亡相关基因的报道。
本文采用Oligo GE Array细胞凋亡基因芯片检测人肺腺癌亲代细胞与耐顺铂细胞(A549和A549DDP)凋亡相关基因,并对检测结果的临床意义进行初步分析，进一步探讨肿瘤细胞凋亡与耐药的发生机制。
1 对象与方法1.1 对象人肺腺癌亲代A549细胞和耐顺铂的A549DDP细胞(华西医科大学新桥医院呼吸病研究所提供)。
1.2 方法1.2.1 细胞培养人肺腺癌A549与A549DDP细胞,以含有10%胎牛血清的DMEM培养基在37℃、5% CO2条件下培养,每2～3 d传代1次,初始密度为2×105/ml(2 ml/6孔板)。
取对数生长期细胞进行实验。
1.2.2 凋亡基因检测按着Oligo GEArray基因芯片实验操作步骤进行(Oligo GEArray细胞凋亡基因芯片由上海康成生物科技有限公司提供)。
1.2.3 RNA 抽提Trizol一步法进行细胞总RNA的抽提。
1.2.4 RNA质量检测经变性琼脂糖凝胶电泳及紫外吸收测定法对RNA质量进行检测。
1.2.5 cRNA标记与合成首先合成cDNA，再合成cRNA，并对合成的cRNA进行标记和扩增，进而cRNA 纯化。
1.2.6 芯片杂交、化学发光检测、图象采集和数据分析。
1.3 统计学分析采用χ2检验。
2 结果对芯片中114个与凋亡相关的基因检测时发现耐顺铂的A549DDP细胞表达凋亡相关基因Bcl 2凋亡调节基因家族(BAD、BAG3)、caspase家族(CASP6、CARD8)、肿瘤坏死因子受体相关因子(TRAF1、TRAF3、CD70)、肿瘤坏死因子受体超家族成员(TNFRSF14、BFAR)及与肿瘤坏死因子受体超家族成员TNFRSF关联的死亡结合域(TRADD、GADD45)较亲代A549细胞显著增高(P<0.05)，二者比值上调2倍以上(表1)。
表1 A549与A549DDP细胞凋亡相关基因表达水平上调2倍以上基因3 讨论肿瘤的发生与发展是细胞增殖和凋亡平衡失调的结果。
凋亡是一种程序性细胞死亡,许多信号通道介导细胞凋亡过程，凋亡相关基因表达异常与细胞凋亡受抑及细胞耐药密切相关。
而耐药性又是影响肿瘤化疗效果的重要因素,化疗失败的主要原因之一就是细胞耐药。
此时,药物能如期进入细胞内并损害细胞,但因与凋亡相关的基因过度表达或表达下调而致凋亡受到抑制,此种损害被转换为无效信号。
本组耐顺铂的A549DDP细胞表达BAD、BAG3、BFAR、CARD8、CASP6、GADD45、TNFRSF14、CD70、TRADD、TRAF1、TRAF3基因较亲代A549细胞显著增高，二者比值上调2倍以上，表明上述凋亡基因的过表达参与A549细胞耐药。
BAD、BAG3均属Bcl 2凋亡调节基因家族成员，位于细胞质内线粒体外膜，通过存在于细胞内的可变蛋白(折叠或伸展结合)和抑制Ga2+跨膜运动，增强肿瘤细胞抗氧化性能，参与细胞的抗凋亡作用，进而增加细胞对化疗药物的抵抗性〔1〕。
肿瘤坏死因子受体相关因子(TRAF)是一类新近发现的细胞内信号传导的衔接蛋白。
迄今为止，已发现6种不同的TRAF (TRAF1、TRAF2、TRAF3、TRAF4、TRAF5、TRAF6)。
作为一种衔接蛋白，TRAFs与一些细胞表面受体直接作用，介导下游信号级联反应，调节细胞生存或死亡平衡。
在6种TRAFs分子中，TRAF1、TRAF3、TRAF5在细胞的凋亡过程中起着重要的作用。
TRAF1表达相当局限，仅存在脾、肺及睾丸中，因此，TRAF1是TRAFs分子中最有可能出现差异表达的分子之一。
新近研究证实TRAF1是一种抗凋亡蛋白，TRAF1过表达抑制caspase 8活化,进而抑制肺癌细胞凋亡〔2，3〕;TRAF3、TRAF5通过活化信号转导，活化泛素蛋白连接酶参与细胞凋亡调节。
本研究显示A549DDP细胞表达TRAF1、TRAF3基因水平明显高于亲代A549细胞，提示TRAF1、TRAF3参与肺腺癌细胞凋亡抑制，导致细胞耐药。
肿瘤坏死因子受体超家族(TNFRSF)有许多成员，涉及到促凋亡及抗凋亡两种截然不同的信号传导途径，究竟TNFRSF活化后细胞是生存还是死亡则取决于双方信号水平的强弱对比及作用时机的不同。
在生理状态下，TNFR1其信号途径是TNF依赖型的，非配体依赖的TNFR1信号凋亡通路被阻断，行使这种负调作用的蛋白是死亡结构域沉默蛋白(silencer of death domains，SODD)。
在非配体存在的情况下，SODD与TNFR1胞浆段的死亡结构域预先结合，形成SODD TNFR1复合体，该复合体不能与含有死亡结构域的TNFR1结合蛋白(TNFR1 associated death domain protein，TRADD)等相互作用，TNFR1信号通路处于失活状态。
给予TNF刺激后，SODD从复合体中脱落，TNFR1信号通路被打开〔4〕。
首先，TRADD与TNFR1通过死亡结构域之间的作用相互结合，然后TRADD作为一个衔接平台，进一步募集其他信号分子至激活受体，从而决定细胞生存与死亡。
受体作用蛋白(receptor interacting protein，RIP)通过死亡结构域与TRADD结合,可进一步激活TNFR相关因子2(TNFR associated factor 2，TRAF2)，活化的TRAF2再激活2个独立的信号传导途径：(1)可通过磷酸化作用激活NF κB诱导激酶，继而活化κB激酶复合物抑制蛋白，导致其降解从而失去对NF κB的抑制，NF κB转位至细胞核激活多种基因的转录，主要包括抗凋亡基因如细胞凋亡抑制蛋白基因 1、2，B细胞淋巴瘤 2基因,生长抑制和DNA 损伤诱导基因45的转录，通过抑制caspase 8的活化等途径发挥抗凋亡作用。
(2)TRAF2还可与凋亡信号调节激酶,转化生长因子 β活化激酶,促分裂原激活的相关蛋白激酶等分子相互作用并最终激活c Jun氨基端激酶(c Jun NH2 terminal kinase，JNK)，通过JNK/SAPK途径抗凋亡〔5，6〕。
肿瘤坏死因子受体超家族14(TNFRSF14)，通过细胞表面受体信号连接转导途径，活化caspase抑制剂，抑制活化的caspase，释放螯合的细胞质中的NF k颗粒，参与细胞凋亡。
caspase家族是一组与细胞凋亡有关的蛋白酶，包括很多成员,本实验中涉及的CARD6、CARD8、CASP6均属caspase家族。
化疗药物引起的细胞凋亡均须激活caspase。
caspase蛋白酶在死亡受体介导的细胞凋亡中起着中心的作用。
其中caspase 8(CARD8)是这一凋亡过程中首先被活化的ICE家族蛋白酶。
由于caspase 8具有FADD样DED结构域，并且能够通过DED结构域与FADD结合，所以caspase 8可以在凋亡过程中间接与细胞膜受体发生联系，从而将细胞膜事件转化为细胞浆事件。
caspase 8活化后，一方面它可以剪切活化caspase 3、caspase 7、caspase 4、caspase 9和caspase 10，通过这些蛋白酶剪切底物使凋亡得以进行;另一方面，它的活性可以被CrmA所抑制，籍此可作为细胞凋亡负调控因素作用的环节。
caspase 6具有活化水解酶、水解蛋白和分解肽作用，可以降解层蛋白B参与细胞的凋亡活动。
本组实验研究显示A549DDP细胞表达CARD8、CASP6水平较亲代A549细胞增高明显，提示上述caspase家族成员参与肺腺癌A549细胞耐药的发生。
CD70分子(CD70)具有结合肿瘤坏死因子的作用，参与细胞间的信号转导，影响细胞凋亡; BFAR 具有双向调节细胞凋亡的功能因子，能够活化泛素蛋白连接酶，进而活化泛素蛋白，具有抗凋亡作用;TRADD，与TNFRSF1A 关联的死亡结合域，活化信号转导，正调节Ⅰ κ(粒)B激酶/NF κ(粒)B级联反应，参与细胞凋亡;本研究显示A549DDP细胞表达BFAR、GADD45、CD70、TRADD水平均较亲代A549细胞高，二者比值超过2倍以上，提示上述基因参与肺腺癌A549细胞凋亡抑制。
本文在对A549DDP与亲代A549细胞凋亡相关基因的表达研究中发现部分基因在细胞耐顺铂后表达明显上调，说明这些基因参与肺腺癌细胞的凋亡抑制和细胞耐药的发生;但也发现部分基因表达下调,是否参与细胞耐药并如何参与还不十分清楚，有待进一步探讨。
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