辣椒叶脉黄化病毒中国分离物全基因组克隆及基于外壳蛋白移动蛋白RNA依赖RNA聚合酶编码区域的进化分析

辣椒叶脉黄化病毒中国分离物全基因组克隆及基于外壳蛋白移动蛋白RNA依赖RNA聚合酶编码区域的进化分析刘茂炎1,2刘湘宁李讯张德咏戴良英* 唐前君*收稿日期：2015年7月15日/接受：2015年11月15日/在线发表时间：2015年11月30日摘要本实验的辣椒叶脉黄化病毒（pepper vein yellowsvirus，PeVYV）基因组序列（PeVYV-HN，登录号KP326573）是从湖南省蔬菜研究所（湖南长沙，中国）种植的辣椒植物（Capsicum annuum L.）上分离并通过深度测序sRNA获取的。

该PeVYV-HN基因组由6244个核苷酸，包含六个开放阅读框（ORF），和日本的分离物（AB594828）类似，同样其基因组结构与马铃薯卷叶病毒属（Polerovirus）的其它成员类似。

序列分析表明，PeVYV-HN与日本PeVYV基因组在核苷酸和氨基酸水平上都共享92％的序列同一性。

基于其外壳蛋白（Coat Protein, CP）的，运动蛋白（Movement Protein, MP），和RNA依赖RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase, RdRP）的进化分析表明，PeVYV可以分成对应于其地理来源的两个主要谱系。

相对于非洲分离物，亚洲分离物相具有较高的种群扩张频率。

负选择作用和遗传漂变（奠基者效应）被认为是潜在的PeVYV的分子进化驱动力。

此外，重组不是PeVYV进化的明显因素。

这是在中国PeVYV 的完整基因组序列的第一份报告。

关键词：辣椒脉黄化病毒; 深度测序；全基因组；分子进化马铃薯卷叶病毒属（Polerovirus），属于黄症病毒科（Luteoviridae）其代表品种马铃薯卷叶病毒（Potato leafroll virus，PLRV），当然也包括PeVYV[1–3]。

其基因组为单分子线形正义ssRNA，包含大约6000个核苷酸（nt），在5'端具有一个特异性蛋白（VPg）结构。

基因组包含六个开放阅读框，O RF 0与ORF 1重叠，ORF 2与ORF 1重叠;ORF 4完全处在ORF 3之中。

ORF 5编码76-kDa的通读蛋白，对蚜虫传播至关重要，也有可能是病毒颗粒的稳定因子。

PLRV主要感染茄科的植物，是通过蚜虫传播。

PeVYV是导致叶脉黄化病( yellow vein disease, YVD )的一个重要的病原体，其在西非是一种主要的辣椒病害[4]。

1995年PeVYV 首次在日本得到确定[5]. PeVYV通过蚜虫（Aphis gossypii）、嫁接等固定的方式传播[5]，对辣椒是一个世界性的难题，并经常在与其它病毒混合侵染中发现。

PeVYV可以基于CP序列从其他的病毒容易地区别[6-8]。

辣椒被PeVYV侵染的主要表现症状有叶脉黄化，叶卷曲，叶片变形，叶褶皱和节间缩短等。

PeVYV已经在印度，印尼，马里，菲律宾，西班牙，台湾，泰国，以及苏丹[2, 3]等国家和地区的辣椒作物上分离得到。

最近，有个新的寄主，龙葵(Solanum nigrum)和在印度[3]得到了鉴定。

这些表明，PeVYV具有广泛的地域分布，对辣椒以及其它植物构成全球性的威胁[3, 9]。

日本分离的PeVYV核苷酸序列是储存在基因库（GenBank）仅有的全长序列（登录号AB594828），还有一些也可提供包括在CP，MP和RdRp 基因等部分序列，分别来自在亚洲的台湾，泰国，印度，印尼和菲律宾；在非洲的苏丹，马里和突尼斯; 以及在欧洲的土耳其和西班牙（表S2）。

然而，这些不同的PeVYV分离物的进化史是鲜为人知的[10]。

在2013年，有可能被病毒感染的展示植物矮化，叶片萎缩/畸形，脉间黄化，叶脉变黄，叶片卷曲，叶片褶皱和黄色斑块等症状的辣椒叶片从中国湖南省长沙市收集。

病毒RNA是使用氯化锂法从这些辣椒叶提的[11]，全基因组序列是在Illumina NextSeq 500平台通过小分子RNA（sRNAS）深度测序法得到的。

总共得到12910408个读取点。

低质量的读取数据（Q<20），读取点包含N，并且读取数小于18核苷酸（nt）的，从数据集中移除。

整理好的读取数据集，采用BOWTIE进行BLAST搜索处理，以具有至少15个核苷酸和18-50 nt长度的5'和3'连接匹配作为标准。

在miRBase数据库v.21.0中的初级转录物（pre-miRNA）和成熟miRNA进行BLAST（/BLAST）检索来识别的miRNA。

使用RFAM（10.1）数据库(/)除去非miRNA，包括rRNA，tRNA，snRNA，snoRNA。

最后，在平均覆盖率达到超过100倍的情况下，PeVYV基因组用Velvet组装成了两个线性重叠群[12]。

长重叠群（3990个核苷酸长度）具有95％的核苷酸序列同源性与PeVYV-日本的31-4020 nt，而短重叠群（1746 nt）与PeVYV-Japan的核苷酸4261-6006 nt具有85％的同源性[13，14]。

根据这两个重叠群设计八个特异性引物（表S1），然后进行RT-PCR 扩增相应的DNA产物。

两个重叠群之间的序列也是利用特异性引物（表S1）进行RT-PCR扩增得到的。

所有RT-PCR的产物通过1％琼脂糖凝胶进行分离，然后使用DNA提取试剂盒（TiangenBiotech, Beijing, China）提取。

纯化的片段克隆到pEASY-T1（TransGen Biotech, Beijing,China），将得到的构体转载到TRANS1-T1噬菌体抗性化学感受态细胞（TransGen Biotech, Beijing,China），具体操作根据制造商的说明。

这八个特异性引物用来通过PCR确定所得到的克隆。

然后五个克隆用来送到BioSune Biotech公司（Changsha,Hunan, China）测序。

3'-和5'-末端序列采用3'和5' RACE（Rapid Amplification of cDNA Ends）（Invitrogen）得到。

在两个连续的片段之间重叠区域的核苷酸序列片段的长度至少为100个基点。

这样一个分离物（命名为PeVYV-HN，accession no.KP326573）通过使用DNASTAR软件（DNASTAR Inc.,Madison, WI, USA）和BioEdit 版本5.0.9 [15] 组装上述序列确定。

全序列的同源性分析使用ClustalW（/Tools/clustalw2/ index.html）[16]和BLAST 进行。

PeVYV分离物，包括PeVYV-HN的外壳蛋白（CP），移动蛋白（MP）和RNA依赖RNA聚合酶（RdRP）的编码区域序列被用来进行进化分析（表S2）。

首先使用CLUSTAL X 2[17 ]对这些序列和亲缘最近的PLRV 分离物的相应区（也担任系统发育分析的外群）进行序列匹配。

为了确保所得的氨基酸对应的核苷酸序列正确编译，采用TRANSALIGN 校准序列。

删除缺口（gaps）后，最终得到的CP，MP和的RdRP序列的长度分别是339，201和483 nt。

从西班牙和土耳其的一些分离物序列经过以上两个步骤后太短，因此，从最后的数据集中移除。

所有序列的推测的重组位点使用RDP4软件包[18]和经典的SimPlot程序[19]进行筛选。

推定的重组事件（P value<1 *10-6）无统计学支持，因此在随后的分析[20]中删除（视为丢失的数据）。

对齐的序列的系统发育树的构建使用最大似然（ML）方法通过PhyML-3.1[21]来实现。

每个数据想核苷酸最适替代模型使用jModeltest0.1.1[22]确定。

结果表明，TrNef+G提供CP序列的最佳拟合，TIM3ef于MP 序列，TIM2ef+I+G为RdRP序列最佳拟合。

使用基于1000倍重复自举法计算支架支持。

此外，采用MEGA5.1[23]软件1000倍自举法构建了一个邻接（NJ）树。

核苷酸和氨基酸序列的相似性分别使用Kimura two-parameter method [24]和DayhoffPAM 250 matrix [25]来评估，而种群内多样性采用MEGA5.1来衡量[25]。

与系统发育关系相关联的非同义（DN）和同义（DS）替换数值的差异各自使用Pamilo-Bianchi-Li (PBL)方法[26]在MEGA5.1中实施计算。

进行了Tajima’s D, Fu和Li’sD*, and F*统计学检测，同时每个PeVYV蛋白编码序列的单倍体多样性，使用DnaSP5.10[27]估计。

PeVYV种群的基因漂流和遗传分化还采用DnaSP5.10计算。

PeVYV-HN的组装全长序列是6244个核苷酸长度。

PeVYV-HN与其他完整的基因组序列的核苷酸序列比较表明PeVYV-HN的1-6244 nt具有最高的身份（92％），与来自日本的分离物序列，同时核苷酸PeVYV-HN的1-5059 nt与辣椒黄化曲叶病毒序列（pepper yellow leaf curl virus，PYLCV，HM439608来自以色列）[28]具有最高的同源性（93％），和序列辣椒黄化病毒（pepper yellows virus，PYV，FN600344）在核苷酸位置2613-4243 nt 具有最高94％的同源性。

另外，PeVYV-HN与日本的分离物共享最高氨基酸序列同源性在ORF0，ORF1，ORF1-ORF2，ORF3，ORF4及ORF3-ORF5（分别是86，92，93，99％，99％，和88％）。

对29个CP，29个MP和20个RdRP序列进行分析，采用SimPlot 和RDP4软件鉴定重组事件。

在PeVYV分离物的三个编码区没有发现重组位点。

三个编码区比较短，因此，分析有可能有低估了重组事件。

使用这些CP，MP和的RdRP 序列来计算构建进化树。

在这些树中所有的序列被一致地分配成相同的两个谱系（I和II）（图1，2，3）。

大多数来自亚洲的分离物聚类在谱系I，而那些来自非洲的则聚在谱系II。

HN分离物显然属于谱系I（亚洲种群），并且在CP进化树上（图1）该分离物聚集在分离物JP（来自日本）旁边。

在CP，MP和的RdRP基因区域分离株间的核苷酸序列差异分别为0.03979±0.00651，0.02418±0.00721和0.05734±0.00630，（表S3）。

在非洲和亚洲PeVYV分离物之间的量级和阈值的差异也被计算了，在非洲的分离物比亚洲的似乎更可变。