三磷酸腺苷生物发光法快速测定食品中细菌的含量_林玲
三磷酸腺苷生物发光法
三磷酸腺苷生物发光法摘要：一、引言二、三磷酸腺苷（ATP）的作用与意义1.生物学功能2.在生物发光中的应用三、生物发光法的原理1.发光生物分子的合成2.发光反应的触发与调控四、三磷酸腺苷生物发光法的实验操作步骤1.制备发光生物分子2.添加三磷酸腺苷3.激发发光反应4.检测与分析发光信号五、应用领域与前景六、总结与展望正文：一、引言三磷酸腺苷（ATP）作为生物体内能量的主要载体，其含量和分布对生物体的生理功能具有重要意义。
近年来，随着生物发光技术的发展，三磷酸腺苷生物发光法在生物学、医学等领域的研究中得到了广泛应用。
本文将对三磷酸腺苷生物发光法的原理、实验操作步骤及其应用领域进行详细介绍。
二、三磷酸腺苷（ATP）的作用与意义1.生物学功能ATP是生物体内能量的主要来源，通过其磷酸键的水解，释放出大量的能量，供给细胞进行各种生物活动。
ATP在细胞内的浓度梯度对于许多生物学过程，如细胞内物质的运输、生物大分子的合成与降解等，具有调控作用。
2.在生物发光中的应用ATP在生物发光过程中的作用主要体现在两个方面：一是作为能量源，为发光生物分子提供能量；二是作为发光反应的底物，参与发光过程。
在生物发光法中，ATP的浓度与发光强度成正比，从而可以间接反映生物体内能量代谢的水平。
三、生物发光法的原理1.发光生物分子的合成生物发光是由生物体内某些特定分子在受到激发后，通过发光反应产生的。
常见的发光生物分子有荧光素、荧光蛋白等。
在实验室中，可以通过基因重组技术或化学合成方法制备这些发光生物分子。
2.发光反应的触发与调控生物发光反应通常在特定条件下进行，如温度、pH值、酶的催化等。
在反应过程中，发光生物分子受到激活，产生发光现象。
ATP作为能量源，在反应中被消耗，使发光强度与ATP浓度呈动态平衡。
通过调控ATP的浓度，可以实现对发光强度的调节。
四、三磷酸腺苷生物发光法的实验操作步骤1.制备发光生物分子根据研究需要，通过基因重组技术或化学合成方法制备发光生物分子。
三磷酸腺苷生物发光法
三磷酸腺苷生物发光法摘要：一、引言二、三磷酸腺苷（ATP）的作用与生物发光法的原理三、三磷酸腺苷生物发光法的应用四、技术优缺点分析五、未来发展趋势与展望六、总结正文：一、引言随着科学技术的不断发展，生物发光法作为一种检测技术，在生物学、医学等领域发挥着重要作用。
其中，三磷酸腺苷（ATP）生物发光法凭借其高灵敏度、高特异性等优点，日益受到研究者的青睐。
本文将简要介绍三磷酸腺苷生物发光法的基本原理、应用领域及其优缺点，并对未来发展趋势进行展望。
二、三磷酸腺苷（ATP）的作用与生物发光法的原理三磷酸腺苷（ATP）是生物体内能量的主要储存形式，几乎所有生物细胞中都含有ATP。
当ATP与荧光素结合后，通过荧光素酶的催化作用，ATP释放出能量，使荧光素发光。
这种现象称为生物发光。
利用这一原理，研究者开发出了三磷酸腺苷生物发光法，用于检测生物样品中的ATP含量。
三、三磷酸腺苷生物发光法的应用1.生物学研究：三磷酸腺苷生物发光法可用于研究细胞、微生物等生物体内的ATP含量，进一步了解生物能量代谢、信号传导等生物学过程。
2.医学诊断：该方法在临床检验中具有广泛应用，如检测肿瘤标志物、病原体感染等。
通过检测生物样品中的ATP含量，有助于疾病的早期诊断和病情监测。
3.农业领域：在植物生理学研究中，三磷酸腺苷生物发光法可用于评估植物生长状况、检测植物病害等。
此外，还可应用于动物养殖业的饲料效果评价、生长发育监测等。
四、技术优缺点分析优点：1.灵敏度高：三磷酸腺苷生物发光法能够检测到微克级别的ATP，灵敏度远高于传统方法。
2.特异性强：该方法具有很高的特异性，可区分不同物种或不同组织来源的ATP。
3.操作简便：实验操作简单，无需特殊设备，易于普及和推广。
缺点：1.受荧光素酶活性影响：荧光素酶的活性和稳定性对生物发光信号的强度和稳定性有一定影响。
2.信号干扰：生物样品中的其他成分可能对发光信号产生干扰。
五、未来发展趋势与展望1.仪器设备的研发：随着技术的进步，未来可能会出现更加灵敏、高效的检测仪器，进一步提高三磷酸腺苷生物发光法的检测性能。
ATP生物发光法在快速检测饮用水菌落总数中的应用
Ａ Ｔ Ｐ生物发光 法
文章编号 ： １ ０ ４ —１ ０ ２ ５ ７ （ ２ ０ １ ４ ） １ ０—１ ３ ２ ５— ０ ３
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职业与健 康 ２ ０ １ ４ 年５ 月第３ ０ 卷第 １ ０ 期
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论 著 ・
Ａ Ｔ Ｐ生物发光 法在 快速检测 饮用水 菌落总数中的应 用
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人教生物必修1课堂跟踪检测：5.2 细胞的能量“货币”ATP
人教生物必修1课堂跟踪检测5.2细胞的能量“货币”ATP一、单选题1．A TP的结构如图所示，①①表示组成A TP的化学基团，①①表示化学键。
下列有关叙述错误的是（）A．①为腺嘌呤，是一种含氮碱基B．①为一种容易断裂和重建的化学键C．在ATP-ADP循环中，①可重复利用D．若化学键①断裂，可生成化合物ADP【答案】D【分析】ATP的中文名称叫三磷酸腺苷，其结构简式为A-P～P～P，其中A代表腺苷，P代表磷酸基团，-代表普通磷酸键，～代表特殊的化学键。
ATP是细胞生命活动的直接能源物质，在体内含量不高，可与ADP在体内迅速转化。
①是腺嘌呤，①和①是特殊的化学键，①是磷酸基团。
【详解】A、①为腺嘌呤，是一种含氮碱基，A正确；B、化学键①为特殊的化学键，容易断裂和重建，B正确；C、①是磷酸基团，在ATP-ADP循环中可重复利用，C正确；D、若①特殊的化学键断裂，即丢掉两个磷酸基团，则左边的化合物是AMP（或腺嘌呤核糖核苷酸），D错误。
2．下图是ATP逐级水解的过程图，其中①是腺苷，①是能量。
下列有关叙述错误的是（）A．ATP和①的快速转化依赖于酶的高效性B．①是组成RNA的基本单位之一C．酶的作用机理是降低了化学反应所需的活化能D．ATP水解过程中，II过程释放①最多【答案】D【分析】据图分析得知：①为ADP、①为AMP、①是腺苷、①是磷酸、①能量。
①和①断裂的都是特殊的化学键，III断裂的是普通化学键。
ATP中文名称叫三磷酸腺苷，结构简式A-P～P～P，其中A代表腺苷，P代表磷酸基团，～代表特殊的化学键。
水解时远离A的磷酸键先断裂，释放的能量是细胞新陈代谢所需能量的直接来源。
【详解】A、ATP与①ADP的快速转化依赖于酶催化作用的高效性，A正确；B、①为AMP，是腺嘌呤+核糖+磷酸组成，也称为腺嘌呤核糖核苷酸，是RNA的基本单位之一，B正确；C、酶的作用机理是降低化学反应的活化能，C正确；D、ATP水解过程中，①过程释放①最多，D错误。
Promicol ATP微生物快速检测系统在UHT灭菌奶商业无菌检测上的应用研究
Promicol ATP微生物快速检测系统在UHT灭菌奶商业无菌检测上的应用研究林木娣;黄诗韵;杨爱君;何瑛【摘要】介绍一种微生物快速检测系统,利用活体微生物中的三磷酸腺苷(ATP)作为标记分子,通过检测超高温(UHT)灭菌奶中微生物的ATP在反应过程中产生的荧光强度,可以间接测定样品中的微生物含量.该方法具有简便、快速、灵敏度高的优点,经验证能与国标法商业无菌检测达到一样的筛查检验目的,能够对UHT产品进行快速放行,在UHT灭菌乳与乳制品的质量监控中具有重要的意义.【期刊名称】《中国乳业》【年(卷),期】2017(000)006【总页数】6页(P69-74)【关键词】三磷酸腺苷(ATP);商业无菌检测;超高温(UHT)灭菌奶;快速检测【作者】林木娣;黄诗韵;杨爱君;何瑛【作者单位】广东燕塘乳业股份有限公司;广州中实生物科技有限公司;广东燕塘乳业股份有限公司;广东燕塘乳业股份有限公司【正文语种】中文（1 广东燕塘乳业股份有限公司；2 广州中实生物科技有限公司）乳与乳制品是大家公认的营养全面的食品，对改善居民的营养、平衡膳食结构、补钙和增强体质均有重要的作用。
超高温（UHT）灭菌奶是其中的一种，因其保存方便、保质期长的特点，受到广大消费者的喜爱。
按照国家安全标准的要求，所有经过UHT灭菌的食品都需要经过商业无菌检验合格才能出售，因商业无菌的微生物检验[1]需耗时10 天以上，检验周期长给企业的仓储、资金回笼等带来较大的压力，越来越多的企业迫切需要一种可靠的、稳定的、快速的微生物检测方法来替代传统的商业无菌检验方法，从而达到快速筛查放行的目的，为抢占市场及内部经营提供便利。
三磷酸腺苷（Adenosine triphosphate，ATP）生物发光检测方法具有简便、快速、灵敏度高的优点，已广泛应用在微生物检测[2]、食品卫生监控[3]等领域，而欧洲、澳洲等地近年也致力于ATP微生物快速检测系统在UHT灭菌奶的商业无菌检验的研究及推广。
生物发光法细菌快速检测仪的研制及应用
生物发光法细菌快速检测仪的研制及应用田青;罗金平;刘晓红;高从军;刘春秀;蔡新霞【摘要】基于ATP生物发光法,研制了一种细菌快速检测仪.该检测仪内置高精度A/D转换器,以小型光电倍增管进行光电转换,结合实验室自制的生物传感器,集光路、电路及软件设计于一体,组成了完整的细菌快速检测系统.其用于大肠杆菌标准品溶液检测时,检测结果与培养计数法结果的相关系数(R)达到0.976 0,同时获得了仪表检测光强和细菌浓度关系曲线.针对实际样品检测中存在的问题,提出了相应的数据处理改进算法,引入了校准方程修正系数,用于食品及卡介苗样品检测,获得了良好的检测结果.对猴头菇类食品样品检测的结果与培养计数法检测结果的R达到0.993,重复性检测的相对平均偏差(R.A.D.)为7.69 %,变异系数(CV)为9.07 %.对卡介苗(BCG)样品检测结果与培养计数法检测结果的R达到0.997,R.A.D.为5.72 %,CV为7.73 %.与传统培养计数法相比,该仪表具有较好的检测速度,准确度和重复性.【期刊名称】《光学精密工程》【年(卷),期】2010(018)004【总页数】8页(P771-778)【关键词】细胞检测仪;生物发光;快速检测;三磷酸腺苷(ATP)【作者】田青;罗金平;刘晓红;高从军;刘春秀;蔡新霞【作者单位】中国科学院,电子学研究所,传感技术国家重点实验室,北京100190;中国科学院,研究生院,北京100190;中国科学院,电子学研究所,传感技术国家重点实验室,北京100190;中国科学院,研究生院,北京100190;中国科学院,电子学研究所,传感技术国家重点实验室,北京100190;中国科学院,研究生院,北京100190;中国兵器工业集团公司,北京北方医院,北京,100089;中国科学院,电子学研究所,传感技术国家重点实验室,北京,100190;中国科学院,电子学研究所,传感技术国家重点实验室,北京,100190;中国科学院,研究生院,北京,100190【正文语种】中文【中图分类】TH776.2细菌检测在食品卫生、疫苗质控等众多领域有着重要的应用[1-2],传统的检测方法是培养计数法,该方法需要至少24 h的细菌培养,检测速度慢,无法满足现场快速检测的需求。
三磷酸腺苷生物发光法
三磷酸腺苷生物发光法摘要：1.引言2.三磷酸腺苷生物发光法的原理3.三磷酸腺苷生物发光法在实验中的应用4.三磷酸腺苷生物发光法的优缺点5.结论正文：三磷酸腺苷（ATP）生物发光法是一种在生物学和生物化学实验中广泛应用的技术。
该方法基于ATP 与荧光素酶的反应，产生可见光，从而实现生物发光。
这种方法具有高度灵敏、快速、简便等优点，使其成为实验室中必不可少的工具。
1.引言三磷酸腺苷生物发光法是一种强大的实验技术，为生物学家和生物化学家提供了快速、准确和灵敏的手段来检测生物分子。
该方法依赖于ATP 与荧光素酶的反应，这一反应产生的可见光使实验者能够实时监测生物过程。
2.三磷酸腺苷生物发光法的原理三磷酸腺苷生物发光法的基本原理是ATP 与荧光素酶的反应。
当ATP 存在时，荧光素酶与ATP 和荧光素底物结合，形成荧光素酶-ATP 复合物。
这个复合物不稳定，会迅速分解为荧光素和磷酸。
荧光素在水中扩散，与氧气结合，产生生物发光。
3.三磷酸腺苷生物发光法在实验中的应用三磷酸腺苷生物发光法在实验中的应用非常广泛，包括细胞活力检测、药物筛选、基因表达分析等。
例如，在细胞活力检测中，通过检测细胞内ATP 水平的变化，可以快速评估细胞的活力。
在药物筛选中，该方法可用于检测药物对细胞的影响，从而确定潜在药物的作用靶点。
此外，三磷酸腺苷生物发光法还可用于基因表达分析，通过检测特定基因的表达水平，研究基因的功能。
4.三磷酸腺苷生物发光法的优缺点三磷酸腺苷生物发光法的优点包括高度灵敏、快速、简便等。
这种方法对实验条件要求较低，可以在短时间内得到可靠的结果。
然而，这种方法也存在一些缺点，如易受到外部环境因素的干扰，对实验操作的准确性要求较高。
5.结论总之，三磷酸腺苷生物发光法是一种在生物学和生物化学实验中非常有价值的工具。
它具有高度灵敏、快速、简便等优点，使其成为实验室中必不可少的检测手段。
发酵食品微生物检验技术
发酵食品微生物检验技术引言发酵食品是含有微生物菌种的食品，包括酸奶、泡菜、酱油等。
由于微生物的作用，这些食品具有特殊的香味、口感和营养，深受消费者喜爱。
然而，不当的发酵过程或者微生物污染可能导致食品质量下降，甚至引发食品安全问题。
因此，检验发酵食品中微生物的技术显得尤为重要。
本文将介绍一些常见的发酵食品微生物检验技术。
1. 总菌数检测总菌数是发酵食品中存在的所有微生物的数量，包括有益菌和有害菌。
通过检测总菌数，可以了解到食品发酵过程中的微生物增殖情况，进而判断食品是否合格。
常用的检测方法有以下几种：•培养法：将食品样品接种于富含营养物质的琼脂平板上，通过微生物的生长形成菌落，再进行计数。
这种方法操作简单，但需要较长的时间来获取结果。
•ATP生物发光法：利用微生物中的ATP （三磷酸腺苷）作为指标，通过酶反应使其产生光，利用光强度来评估微生物的数量。
这种方法快速、准确，但设备和试剂成本较高。
•PCR法：利用聚合酶链反应（PCR）技术，通过特异性引物扩增目标微生物的DNA，然后通过电泳分离并测定扩增产物。
这种方法灵敏度高，但需要特定的实验室设备和技术。
2. 有害微生物检测除了总菌数的检测，发酵食品中的有害微生物也需要进行检测和监控，以确保食品的安全性。
常见的有害微生物有大肠杆菌、沙门氏菌等。
以下是一些常用的检测方法：•大肠杆菌检测：使用MPN法（MostProbable Number）或培养法检测食品中的大肠杆菌数量。
这些方法可以粗略估计食品样品中大肠杆菌的数量，但都需要较长的时间来获取结果。
•沙门氏菌检测：使用PCR法或培养法检测食品样品中的沙门氏菌。
PCR法可以提供快速、准确的结果，但需要特定的实验室设备和技术；培养法则需花费较长的时间。
3. 变质菌的检测发酵食品中存在的变质菌会导致食品质量下降，产生异常的气味、味道和外观。
因此，发酵食品中变质菌的检测也是重要的一项技术。
以下是一些常用的检测方法：•气味检测：通过嗅觉来判断食品是否存在异常气味。
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三磷酸腺苷生物发光法快速测定食品中细菌的含量林 玲1,陈 惠2,郭广生2(1.福建师范大学化学与材料学院,福州350007;2.北京化工大学理学院,北京100029)摘 要:建立了测定食品中细菌三磷酸腺苷(ATP )的生物发光分析方法。
生物发光原理基于萤光素酶、虫萤光素、氧气、ATP 和Mg 2+的催化氧化反应。
产生的光信号强度与ATP 含量成一定关系。
考察了各种物理化学参数对反应的影响。
反应体系最优化条件:pH 7.4、牛血清白蛋白(BSA )浓度为1.0g L 和室温反应。
方法检出限为1.0×10-12mol L ,线性范围1.0×10-7～1.0×10-11mol L ,分析时间30min ,批内变异和批间变异分别小于4%和5%。
研究了部分食品中细菌检测的样品前处理方法,应用于糕点和饮料样品中细菌的测定,加标回收率范围为82.1%～115%。
检测结果与传统培养方法检测结果相关性良好。
关键词:三磷酸腺苷;生物发光;细菌;萤光素酶中图分类号:O657.3 文献标识码:A 文章编号:1000-0720(2009)07-026-05 在众多的食品安全事件中,微生物污染是极为重要的直接因素。
对食品中微生物污染进行监测和控制,最大程度地减少食源性疾病对公共健康的威胁,是解决食品安全问题的重要任务。
中国食品卫生微生物学菌落总数检测的标准方法是传统的平板培养方法[1],获得的数字只能代表在特殊物理环境和供给各种营养物时有生长能力的细菌,而不能代表食品中存在的全部活细菌。
因此,建立及时、快速和准确的食品中微生物的检测方法具有重要意义。
三磷酸腺苷(ATP )为代谢提供能量来源,是微生物不可缺少的物质。
如果样品中污染了微生物,用试剂破菌后,ATP 就被释放出。
国外对于ATP及生物发光现象的研究较早,McElr oy 和Strehler [2]首先提出了基于ATP 的生物发光反应机理:ATP 和虫萤光素(Luciferin )在萤光素酶(Luciferase )和氧气的催化氧化下,释放能量,产生光信号。
ATP 生物发光法因为无需培养,操作快速简便[3],具有10-12～10-18mol L [6]的高灵敏度以及相对可行性(菌落总数与发光值呈显著相关[9])和可扩展性(食品、食品生产设备和清洁设备[10]及环境样品[11,12]检测)等优点,目前已广泛用于食品[13～15]及食品类器材[16]中菌类测定。
本研究建立了稳定可靠的生物发光体系,采用磷酸盐加热提取ATP ,方法简单快速,能够在30min 内准确可靠检测出食品中细菌ATP 含量,从而评估细菌的含量,将生物的ATP 与化学发光相结合用于食品中微生物的测定。
1 实验部分1.1 仪器与试剂B HP9504型微孔板发光分析仪(北京滨松光子技术公司);96孔微孔板(厦门市金铂铱科技公司);其林贝尔MH -Ⅰ型微孔板振荡器;Eppendorf 5804R 型离心机(德国Eppendorf 公司)。
ATP (美国Amresc o 公司);虫萤光素和三磷酸腺苷双磷酸酶(美国Sigma 公司);萤光素酶(美国Promega 公司);三氯乙酸(德国Merck 公司);小牛血清白蛋白(B SA ,美国Genview 公司);胰化(蛋白)胨、酵母提取物和琼脂(英国Oxoid 公司);光明橙汁饮料、青岛啤酒、三鹿君乐宝酸奶、三鹿君乐宝高钙酸奶、双汇王中王火腿和康师傅妙芙欧式蛋糕等样品均购自北京超市。
其它试剂均为分—26—第28卷第7期2009年7月 分析试验室Chinese Journal of Analysis Laboratory Vol .28.No .72009-7收稿日期:2008-06-26;修订日期:2008-10-21基金项目:国家科技支撑(2006BAK02A13)项目资助作者简介:林 玲(1987-),女,本科生;E -mail :rinrei00@yahoo .com .cn 、chem0550@yahoo .com .cnDOI :10.13595/j .cn ki .issn 1000-0720.2009.0187析纯,实验所有用水为超纯水(Barnstead Easypure 超纯水系统)。
1.2 实验方法1.2.1 溶液 10m mol L 磷酸盐缓冲溶液(pH 7.4)用于配制ATP 标准溶液;生物发光底物为10mmol L Tris -乙酸缓冲溶液,1g L B SA ,2mmol L EDTA 和20mmol L MgCl 2,pH 7.4;样品稀释液为8.5g L 生理盐水。
1.2.2 样品前处理和ATP 提取 取光明橙汁饮料1.00mL 、青岛啤酒1.00mL 、三鹿君乐宝酸奶1.00mL 、三鹿君乐宝高钙酸奶1.00mL 、双汇王中王火腿5.00g 和康师傅妙芙欧式蛋糕3.60g 。
用8.5g L 的生理盐水稀释酸奶和搅拌机绞碎的火腿及蛋糕样品。
橙汁、啤酒、蛋糕和火腿样品需在37℃恒温培养箱人工增菌培养。
将前处理好的样品与pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液等体积混合,沸水浴中加热3min 提取ATP ,12000r min 离心1min 取上清待测。
1.2.3 生物发光分析 移取100μL ATP 标准溶液或上清样品溶液加入微孔板,再加入100μL 虫萤光素-萤光素酶底物溶液,微孔板振荡器上混匀1min 后立即室温检测。
生物发光强度(Relative Light Unit ,RLU )取10s 积分结果,以ATP 浓度和发光强度分别取对数进行线性拟和。
2 结果与讨论2.1 ATP 标准溶液ATP 容易水解形成磷酸根。
磷酸盐缓冲溶液配制的系列ATP 标准溶液相对比较稳定。
结果表明:在4℃放置1天相对-20℃放置1天光强度减少18%,-20℃放置1周信号较-20℃放置1天减少20%。
所以-20℃保存,使用不超过3天。
2.2 反应影响因素的考察考察了不同pH 的Tris -乙酸缓冲体系对分析的影响(见图1a )。
反应发光强度在pH 为7.4时达到最大值,选择缓冲液的pH 为7.4。
考察了温度从4℃到37℃对反应的影响(见图1b )。
该反应体系在25℃时发光强度最大,所以尽量选择在室温进行反应。
实验中选择小牛血清白蛋白(B SA )来保护萤光素酶的活性和增强发光强度。
图1c 显示不同浓度B SA 对反应的影响,结果表明选择1.0g L B SA 效果较好。
图1 ATP 生物发光体系参数的优化和选择Fig .1 Optimization and selection of physicochemical parameters in BL(a )Tris -乙酸缓冲体系pH 对发光反应的影响;(b )温度对发光反应的影响;(c )BSA 浓度对发光反应的影响;(d )ATP 生物发光反应标准曲线—27— 发光反应中使用Mg2+配制底物时会引进阴离子,阴离子会不同程度的影响发光反应强度[17]。
分别考察了阴离子SO42-,NO3-,Cl-和Ac-(20m mol L)对反应的影响。
NO3-对反应的抑制作用最强,光强最弱,RLU值为5244,相反Cl-抑制作用最弱,光强最大,RLU值为9962。
所以选择20mmol L的MgCl2配制底物。
萤光素酶的活性直接影响着检测结果。
酶溶液活性会随着时间逐渐下降,下降速率与环境温度有关[18]。
分别考察了在4、25和-20℃保存不同时间的酶溶液活性。
结果表明温度越高,酶的活性下降越快。
-20℃放置21天较新配制酶溶液相对发光强度下降了83%,所以实验中需要注意酶活性的影响。
2.3 线性范围、检出限和精密度配制一系列不同浓度的ATP标准溶液,在优化的实验条件下进行测定,用发光强度RLU对数对ATP浓度的对数进行线性回归,标准曲线具有较好的线性关系(见图1d),相关系数R2=0.999、线性范围为1.0×10-7～1.0×10-11mol L、线性回归方程为y=0.9096c+12.941(y为10s积分相对发光强度的对数,c为ATP浓度对数,单位: mol L),最低检出限为10-12mol L。
批内变异和批间变异分别见表1,批内变异小于4%,批间变异小于5%。
表1 ATP生物发光反应精密度Tab.1 Precision of the proposed bioluminescence assay分析类型编号c ATP(10-9mol L)相对发光强度平均值相对发光强度标准偏差10.11.010.09129530047325102665745235批内变异(n=10)20.11.010.09332524797347733248411064330.11.010.088515299973430011560713220批间变异(n=30,连续3天分析)0.11.010.090745282773386144170799442.4 样品测定实验发现橙汁饮料溶液颜色对发光计数有影响,需要脱色处理,选择其余5种食品样品,参照实验方法进行前处理。
检测前需要清除样品中所含游离ATP,选择0.1活力单位mL的三磷酸腺苷双磷酸酶用于清除。
2.4.1 ATP提取方法的优化 实验了3种提取食品中细菌ATP的方法。
分别为双蒸水[19]、磷酸盐缓冲溶液加热提取和三氯乙酸(0.03%TCA)室温化学裂解方法。
3种方法提取结果见图2(1～5编号样品分别对应为三鹿君乐宝酸奶、三鹿君乐宝高钙酸奶、双汇王中王火腿、康师傅妙芙欧式蛋糕和青岛啤酒),所以选择磷酸盐缓冲溶液加热提取ATP。
图2 3种ATP提取方法的比较Fig.2 Comparison of results of five samples detected bythree extraction methodsa-双蒸水体系煮沸;b-磷酸盐缓冲体系煮沸;c-三氯乙酸裂解1～5分别对应为三鹿君乐宝酸奶、三鹿君乐宝高钙酸奶、双汇王中王火腿、康师傅妙芙欧式蛋糕和青岛啤酒—28—2.4.2 ATP提取时间的优化ATP的性质受温度影响较大,样品中新鲜提取的ATP需立即置冰上保存。
控制ATP加热提取时间对于检测结果的准确性非常重要。
分别考察了1～15min加热提取时间的影响。
结果显示2～3min效果较好,为减少实验误差,提取时间统一选择为3min。
2.4.3 回收率 对各样品进行加标回收实验。
用磷酸盐缓冲溶液加热法提取样品中的ATP后,加入不同体积的ATP标准溶液,根据检出的总ATP 浓度计算回收率(见表2)。
ATP回收率范围为82.1%～115%,说明该方法准确可靠性。
表2 样品测定与加标回收Tab.2 determination results of samples and recoveries样品编号标准加入值(10-10mol L)测得值(10-10mol L,n=3)回收率%13.005.0010.004.658.009.5414.71-11297.810125.0010.0020.008.4113.9317.4027.27-11089.994.3310.0020.0040.0026.4837.0942.9063.33-10682.192.1410.0020.0040.0014.6623.4534.8351.60-87.910192.455.0010.0020.004.059.6412.7327.08-11286.81152.4.4 与其他方法的相关性 同时参照文献[1],采用传统方法培养样品中细菌,进行菌落计数(CFU mL),其结果与本文建立方法检出的ATP浓度相关性良好(见图3)。