培养细胞的有被小泡免疫细胞化学染色与观察

培养细胞的有被小泡免疫细胞化学染色与观察
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一、实验目的：
1、掌握免疫细胞化学染色的基本原理和步骤。

2、对成笼蛋白有被小泡在细胞内的形态和分布有直观认识。

二、实验原理：
真核细胞中的有被小泡是参与细胞内物质运输的重要成员，按照衣被成分的不同，有被小泡可以分为成笼蛋白有被小泡、COPⅠ被小泡和COPⅡ被小泡等不同类型。

免疫细胞化学是将免疫学基本原理与细胞化学技术相结合所建立起来的新技术，根据抗原与抗体特异性结合的特点，检测细胞内某种多肽、蛋白质及膜表面抗原和受体等大分子物质的存在与分布。

免疫细胞化学染色技术在分析有机体、细胞及亚细胞水平上特定分子的定位及相互联系时是一个有力的工具，在细胞生物学研究中有着广泛的应用。

它利用了抗原与抗体之间特异性结合的性质，即某种抗体仅能与刺激其产生的抗原物质结合，故当发生抗原抗体反应时，可用已知抗体去追踪和鉴定未知的抗原。

一般而言，发生在固定组织或细胞内的抗原抗体反应是不可见的，但如将荧光素、酶等标记在抗体分子上，就能凭借荧光或酶与底物的颜色反应在某一部位的有无，来判断是否发生了特异的抗原抗体反应及研究抗原物质的定位。

标记抗体与抗原结合方式主要有两种：①直接法；
②间接法：
间接法较直接法的敏感性大为增高，故应用更为广泛。

间接法中较常用的有荧光标记法、过氧化物酶标记法等。

本实验所用的即为辣根过氧化物酶标记的二抗，然后用DAB(3,3-二氨基联苯胺)作为辣根过氧化物酶的作用底物来显色抗原存在部位，可见棕黄色产物
三、实验方法：
1、细胞培养：
在HeLa细胞进行传代培养时，将消毒的盖玻片条放入24孔培养板中，培养48小时后细胞密度达70-80%时，可取出盖玻片进行染色。

【如图所示：培养的癌细胞-Hela细胞】
将长有细胞的盖玻片放入盛有PBS的小培养皿中漂洗，以洗去培养液。

2、固定：
弃去PBS液，加入含3.7%甲醛的PBS溶液3ml，固定10分钟。

用PBS洗2次，每次10分钟。

3、透化：
吸去多余PBS，用0.5%的Triton X－100透化处理10分钟。

用PBS洗2次，每次10分钟。

加入含1％BSA的PBS溶液3ml，室温温育10分钟（BSA用来封闭非特异性蛋白结合位点）。

4、加入一抗：
将盖片有细胞的一面向上，水平地放入培养皿中，加稀释好的第一抗体液（3mlPBS中加入30μl），盖好培养皿，平稳地放入37℃温箱中温育30分钟。

取出盖片，放入盛有含0.1%吐温20的PBS的培养皿中室温洗2次，每次10分钟，以洗去未结合的抗体。

5、加入二抗：
将盖片放入培养皿，加稀释好的第二抗体（3mlPBS中加入15μl），在37℃温箱中温育30分钟。

取出盖片，放入盛有含0.1%吐温20的PBS的培养皿A中室温洗2次，每次10分钟。

6、染色：
染色10分钟：2760μl PBS+120μl B液+120μl A液。

滴一滴50％甘油－PBS混合液于载玻片上，将盖片有细胞的一面向下进行封片，防止产生气泡。

7、观察：
将制好的片子放在显微镜下观察：
四、实验结果：
在光学显微镜下可见棕黄色的小泡分布在细胞中，在不同细胞中小泡的大小和分布位置有所差别。

实验中，由于：
1、在第6步，错误地将PBS缓冲液换用为蒸馏水；
2、实验中，各步均用吸管吹吸，力度可能过大，造成细胞减少。

3、细胞贴壁培养不够，仅达到20%左右，达不到要求的70%~80%。

导致实验结果很不理想：视野中细胞很少，染色很差，细胞中有被小泡不清晰。

五、思考题：
1、实验过程中所使用的一抗和二抗的浓度如果过高或者过低会出现什么样的实验结果？
答：一抗和二抗浓度过高会导致染色过深，有被小泡不能清晰成像。

造成如【三-7左图】一样的结果。

浓度过低会使染色很浅，有被小泡看起来不完整或染不上色。

如【三-7右图】
一样的结果。

六、小结：
通过本次实验，我掌握了免疫细胞化学染色的基本原理和步骤，对成笼蛋白有被小泡在细胞内的形态和分布有了直观的认识。

并且通过实验对有被小泡进行了染色，虽然实验结果不很理想，但基本上掌握了实验操作，总体上达到了本次实验的目的与要求。