质粒DNA的提纯,原位杂交步骤
质粒DNA的提取和纯化
质粒DNA的提取和纯化一、实验目的掌握碱法小量提取质粒DNA。
二、实验内容质粒DNA的小量提取。
三、实验原理所有分离质粒DNA的方法都包括三个基本步骤：培养细菌扩增质粒；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。
将细菌悬浮液暴露于高pH值的强阴离子洗涤剂中，会使细胞壁破裂，将质粒DNA释放到上清液中。
碱性溶剂使碱基配对完全被破坏，闭环质粒DNA双链由于处于拓扑缠绕状态而不能彼此分开。
当pH值恢复到中性时，重新形成完全天然地超螺旋结构。
在裂解过程中，细菌蛋白质、破裂的细胞壁和变性的染色体DNA会相互缠绕成大型复合物，与PDS一起沉淀。
离心除去变性剂，从上清液中回收复性的质粒DNA。
四、实验方法与步骤㈠细菌培养和收集将带有pUC19质粒的大肠杆菌接种在LB固体培养基（含100μg/ml Amp）中，37℃培养12～24小时。
在超净工作台中用无菌的牙签挑取平板培养基上的单菌落接种到25ml LB液体培养基（含100μg/ml Amp）中，37℃振荡培养（220rpm）约18小时至对数生长后期（OD600=0.6）。
㈡碱法小量提取质粒DNA1、将菌液倒入1.5ml的微量离心管中，于4℃12000rpm离心30秒，弃去上清液，将剩余的培养物贮存于4℃。
重复3次，以得到较多的细菌沉淀（视具体情况而定）。
2、将微量离心管开口倒置在卫生纸上，使离心管底部的液体流尽。
3、加入100μl用冰预冷的溶液I，在涡旋振荡器上剧烈振荡，将沉淀彻底悬浮，然后室温放置5分钟。
4、加入200μl现配的溶液II，盖紧管口，轻轻快速颠倒离心管（不要振荡，以避免DNA断裂），使混合物混匀，冰浴2～5分钟。
5、加入150μl预冷的溶液III，盖紧管口，温和颠倒混匀，使粘稠地细菌裂解物均匀地分布于溶液III中，冰浴2～5分钟。
6、4℃,12000rpm离心10分钟。
将上清液转入另一只1.5ml离心管中，加入0.6倍体积的异丙醇，室温放置10分钟。
原位杂交步骤自己整理的精讲
原位杂交步骤自己整理的精讲原位杂交是一种常用的实验方法，可以用来检测DNA或RNA序列在细胞或组织中的分布情况。
这种方法可以帮助研究人员确定基因在染色体上的位置，并研究基因的表达和调控。
下面是原位杂交的详细步骤：1.样品处理：首先，需要提取并处理样品中的细胞或组织。
这一步骤通常包括细胞固定、组织切片和蛋白酶处理等。
细胞固定能够保持细胞的形态和结构，而组织切片则能够使得样品更容易进行观察和分析。
蛋白酶处理的目的是通过消化蛋白质来提高核酸的可达性。
2.探针设计：在进行原位杂交之前，需要准备一个能够与目标DNA或RNA序列互补配对的探针。
这个探针通常是由DNA或RNA序列构建而成的，可以通过人工合成或PCR扩增获得。
在设计探针时，一般要考虑到探针的长度、碱基组成和互补性等因素。
3.标记探针：为了便于后续的检测，需要将探针标记上报告标记物。
常用的报告标记物有荧光染料、放射性同位素和酶等。
标记探针的方法通常包括非放射性标记和放射性标记两种方式，具体选择哪一种方法取决于实验的需求和要求。
4.杂交反应：将标记好的探针与样品中的DNA或RNA序列进行杂交反应。
这种反应通常在固定样本上进行，样品和探针会在适当的杂交缓冲液中反应一段时间。
杂交反应的温度和时间会根据探针的长度和互补性等因素进行调节。
反应结束后，通常需要进行洗涤以去除未结合的探针和杂交缓冲液。
5.可视化和分析：经过洗涤之后，探针与目标DNA或RNA序列杂交形成的杂交体可以通过其中一种方法进行可视化和分析。
常用的方法包括荧光显微镜观察、放射性测量和酶活性检测等。
通过这些方法，可以确定目标序列在样品中的分布情况和数量。
除了上述的基本步骤，还可以根据实验的具体要求进行一些改进和优化。
例如，可以采用双标记法来同时检测不同序列的分布情况；可以使用探针混合标记法来提高检测的灵敏度和特异性；可以用信号扩增技术来增加检测的信号强度等。
总体来说，原位杂交是一种常用的实验方法，可以用于研究基因的定位和表达。
质粒dna的提取步骤
质粒dna的提取步骤质粒DNA的提取步骤质粒DNA是细菌中的圆形DNA分子，与细胞染色体不同，可以在细菌中自主复制。
质粒DNA的提取是一项常规实验，可用于高效地分离纯化质粒。
在进行质粒DNA提取之前，需要准备一些必要的试剂和设备。
材料和试剂：1.细菌培养物2.经过钙离子或热处理的TTES缓冲液（10mM Tris-HCl [pH8.0]，1mM EDTA [pH8.0]，25%蔗糖溶液）3.蛋白酶K处理缓冲液（50mM Tris-HCl [pH8.0]，100mM NaCl，10mM EDTA [pH8.0]）4.醇5.异丙醇6.以太7.加拿大CFII列的紫外灯8.恒温振荡器步骤：1.收集培养物将培养物用无菌工具收集到1.5毫升离心管中。
通过离心将细胞沉淀到离心管底部。
2.细胞溶解添加500 μl TTES缓冲液到离心管中，并用Vortex或20号钢珠打破细胞壁。
将离心管放在水浴中恒温振荡器中，30分钟以70 rpm。
3.移除细胞碎片离心管离心2分钟，将浮于上层的无菌细胞断片去除（上清），移至另外的离心管。
4.蛋白酶K处理向上清中加入100 μl蛋白酶K处理缓冲液和15μl蛋白酶K，室温下静置10分钟，然后加入200 μl醇混合液（3：7乙醇：异丙醇），与上清混合均匀。
5.沉淀DNA的制备离心管离心2分钟，然后将上清倒出。
沉淀物将采用70%的醇作为清洗液，在沉淀物上滴入1 ml的70%醇，在打破后的沉淀物中短暂的搅拌。
离心管轻轻晃动，浮于上层的除去，再加1ml的70%酒精，将沉淀物中混合在一起。
6.沉淀物最佳溶解将沉淀物在无尘工作台上空气干燥（大约10~15分钟），直到酒精挥发。
将沉淀物用10毫升 TE缓冲液（10mM Tris-HCl [pH8.0]，1mM EDTA [pH8.0]）悬浮，经缓慢抽气镇静。
7.检测提取的DNA通过紫外光下的可见目标，如果质粒DNA等目标脱胶，就可以看到了。
通常设定为 OD260/OD280值为1.8-2.0。
两大实验：质粒DNA 提取,质粒转化和筛选
蓝白筛选筛选的原理
1.α互补 1.α互补 载体上携带一段细菌lacZ基因的α 载体上携带一段细菌lacZ基因的α肽编码序 lacZ基因的 其编码产物为β 半乳糖苷酶的α 列，其编码产物为β-半乳糖苷酶的α肽。当无外 DNA插入时 质粒表达α 插入时， 突变型Lac Lac源DNA插入时，质粒表达α肽。突变型Lac-E.coli 可表达该酶的ω肽。单独存在的α及ω肽均无β可表达该酶的ω 单独存在的α 肽均无β 半乳糖苷酶活性， 半乳糖苷酶活性，只有宿主细胞与克隆载体同时 共表达这两个肽时，宿主细胞内才有β 共表达这两个肽时，宿主细胞内才有β-半乳糖苷 酶活性，这种现象称为α互补。 酶活性，这种现象称为α互补。
Ⅱ 质粒转化
1. 加10 µl 含40 ng 的DNA溶液至 溶液至200 µl 感受态细 溶液至 胞中，温和混匀，置于冰上30 胞中，温和混匀，置于冰上 min 2. 42 ℃热冲击 ，迅速放回冰上，将细胞冷却 热冲击90s，迅速放回冰上， 1~2 min，加入 ，加入500 µl LB（或者 （或者SOC）培养基。 ）培养基。 3. 将转化后细菌放置 ℃，200 rpm 振荡培养 将转化后细菌放置37 振荡培养45 min，让细菌中的质粒表达抗生素抗性蛋白。 ，让细菌中的质粒表达抗生素抗性蛋白。
TE溶液：10 mmol/L Tris-Cl, pH 8.0 溶液： 溶液 1 mmol/L EDTA, pH 8.0
pGEMpGEM-T Easy Vector Plot
实验二 氯化钙法进行质粒转化及筛选
一、原理
细菌处于0 低渗溶液（ 细菌处于 ℃，在CaCl2低渗溶液（0.1M）中，菌 ） 体细胞膨胀成球形， 则与CaCl2形成抗 体细胞膨胀成球形，DNA则与 则与 Dnase的羟基－磷酸钙复合物粘附于细胞表面， 的羟基－ 的羟基 磷酸钙复合物粘附于细胞表面， 短时间热冲击处理，促进细胞吸收DNA 经42 ℃短时间热冲击处理，促进细胞吸收 复合物，在丰富培养基上生长数小时后， 复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细 胞复原并分裂增殖， 胞复原并分裂增殖，重组子的基因在被转化的细 菌中得到表达，在选择性培养基平板上， 菌中得到表达，在选择性培养基平板上，可选出 所需的转化子。 所需的转化子。
提取质粒dna的方法
提取质粒dna的方法提取质粒DNA的方法是一种从生物样品中提取DNA的方法，用于分析基因组学、遗传学或其他基因相关的研究。
它是所有DNA技术的基础。
提取质粒DNA的方法主要包括三个步骤：破解细胞壁、提取DNA片段和提取DNA片段。
第一步，破解细胞壁。
为了提取细胞内的DNA，必须先破坏细胞壁。
这一步可以通过使用植物激素、酶和其他破坏细胞壁的物质来完成。
第二步，提取DNA片段。
在破坏细胞壁之后，生物样品中的DNA就可以从细胞内被提取出来。
这一步通常是将样品加入一定的溶液，如洗涤溶液，然后用放大器去提取DNA片段。
第三步，提取DNA片段。
在提取DNA片段之后，必须对其进行纯化处理，以便提取的DNA片段不会受到其他物质的干扰。
一般情况下，这一步是通过使用离心机将DNA 片段从溶液中分离出来，然后用水冲洗去除其他物质，最后得到纯净的DNA片段。
提取质粒DNA的方法也可以用来提取植物细胞内的DNA。
与提取动物细胞中的DNA不同，植物细胞内的DNA要更加困难，因为植物细胞周围可能有多层细胞壁，而这些细胞壁很难被破坏。
因此，植物细胞内的DNA提取一般都是采用化学方法，即使用碱性有机溶液，以破坏细胞壁，然后再用放大器提取DNA片段。
此外，还有一些无细胞DNA提取的方法，如PCR法、小RNA测序、质粒提取等。
PCR法是用来检测和检验DNA的一种技术，可以扩增微量DNA，从而获取充足的DNA材料进行检测。
小RNA测序是一种新型的基因测序技术，可以检测植物和动物体内特定的RNA，检测特定靶基因的表达。
最后，质粒提取是一种从生物样品中提取DNA质粒的技术，可以用于分子生物学研究，如基因克隆、DNA测序等。
总之，提取质粒DNA的方法是一种常用的DNA提取技术，也是所有DNA技术的基础。
它可以用于从动物和植物样品中提取DNA片段，以及从无细胞DNA中提取DNA质粒，以用于各种基因组学、遗传学和分子生物学研究。
原位杂交原理及具体操作
原位杂交原理及具体操作原位杂交的具体操作包括以下几个步骤：1.样本准备：收集需要研究的细胞或组织样品，并进行固定和处理。
具体处理方法根据研究对象的特点和需求而定，可以涉及蛋白酶消化、脱脂、固定等步骤。
2.产生标记探针：首先要选择合适的探针来检测目标序列。
探针可以是DNA或RNA序列，根据研究对象选择相应的方法进行标记，常见的标记方法有荧光标记、放射性标记和酶标记等。
标记后的探针需要经过纯化和检测，确保标记效果良好。
3.杂交反应：将标记的探针与样本中的DNA或RNA进行杂交反应。
首先需要将样本脱水，并在适当温度下使用探针溶液进行孵育反应，使探针与目标序列发生特异性结合。
杂交温度根据探针和目标序列的互补性来确定，一般在适当的温度下进行持续反应。
4.洗涤：杂交反应结束后，需要进行严格的洗涤步骤，以去除未结合的探针和非特异性结合。
洗涤的条件也根据研究需要而定，可以使用高盐溶液、低盐溶液或有机溶剂等来去除非特异性结合。
5.信号检测：根据具体标记方法的不同，可以使用荧光显微镜、射线计数器或底物染色等方法来检测标记的探针。
通过观察探针的位置和强度，可以得到目标序列在细胞或组织中的分布和表达情况。
6.分析与图像处理：根据实验结果，可以对图像进行定量分析和处理。
现代技术已经能够通过图像软件进行分析和定量，得到原位杂交的定量数据。
原位杂交技术的优点在于可以在细胞或组织水平上观察和定位目标序列的存在和表达情况，为研究基因表达、基因功能以及病理学等提供了强有力的工具。
但是在操作过程中需要注意探针的选择和合成、杂交条件的优化以及样品处理的标准化等问题，以确保实验结果的准确性和可重复性。
质粒纯化标准操作流程
质粒纯化标准操作流程
质粒纯化标准操作流程是一种用于从大量细菌中提取和纯化质粒的常用实验方法。
下面是质粒纯化的标准操作流程：
1. 培养细菌：首先，将含有目标质粒的细菌菌株在含有适当抗生素的培养基上
培养过夜。
这样可以保证细菌中含有大量的质粒。
2. 收获细菌：将培养好的细菌菌液进行离心，将菌体沉淀。
丢弃上清液，然后
用适量的缓冲液重悬菌体沉淀。
3. 细胞破碎：将重悬的菌体经过多次冻融循环或超声破碎等方式破碎细胞，释
放质粒进入溶液中。
4. 澄清溶液：为了去除残余的细胞碎片、蛋白质和其他杂质，利用离心或滤膜
等方法将细菌碎片从溶液中除去，获得相对清晰的上清溶液。
5. 去核酸：为了去除细菌染色体DNA的干扰，可通过加入蛋白酶K或依靠离
心等方法去除核酸。
6. 结合离子交换层析：使用阴离子交换树脂进行质粒吸附。
将上清液加入预先
平衡好的离子交换树脂柱中，然后洗涤以去除非特异的蛋白质和杂质。
7. 质粒洗脱：通过改变离子交换树脂的盐浓度或PH值，洗脱并收集质粒DNA。
8. 纯化质粒：通过进一步的纯化步骤，如乙醇沉淀、网膜滤纸或凝胶过滤等，
去除残留的污染物。
9. 检测纯化的质粒：利用琼脂糖凝胶电泳或其他适当的检测方法，验证质粒的
纯度和大小。
以上就是质粒纯化的标准操作流程。
进行这些步骤能够有效地提取和纯化质粒，并为后续的实验提供高质量的质粒样品。
原位杂交技术的具体步骤
原位杂交（In situ hybridization）是一种用于检测核酸序列在细胞或组织中的位置和表
达水平的技术。
下面是原位杂交技术的一般步骤：
1.样品固定：首先，准备需要检测的细胞或组织样品，并将其进行固定。
常用的固定方法包括使用乙醛、乙酸、甲醛等。
2.使DNA或RNA标记：选择适当的探针，它可以是DNA或RNA序列，用于与目标
核酸序列杂交。
标记的方法通常使用荧光染料、酶或同位素等。
3.制备与标记探针配对的杂交缓冲溶液：制备含有探针的杂交缓冲溶液，其中包含适当的盐和添加剂，以提供最佳的杂交条件。
4.杂交：将标记的探针加入样品中，让其与目标序列进行杂交。
这一步可以在高温条件下进行，以增加探针与目标序列的特异性结合。
5.洗涤：进行一系列洗涤步骤，以去除未结合的探针和非特异结合物，提高信号的特异性。
6.反应可视化：根据所使用的标记方式，进行合适的染色或检测步骤，以显示杂交信号。
这可以是荧光显微镜观察、酶反应染色或同位素探测等。
7.结果分析：通过显微镜观察或其他适当的图像分析方法来解读和分析杂交结果。
评估信号的位置、强度和特异性。
这些步骤仅为一般原位杂交的基本流程，具体的实验条件和步骤可能会根据研究目的
和样本类型的不同而有所调整。
原位杂交技术在生物医学研究等领域广泛应用，可以
帮助研究者了解基因表达和变化的空间定位和时序关系。
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原位杂交实验步骤一质粒制备1质粒的转化和扩增1.1制备XL1-Blue感受态细菌1．取400uL XL1-Blue菌种加入到含200ml LB培养基的锥形瓶中，37 ℃、100 rpm培养4h，离心，倒置，以冰冷的0.1 mol／L CaCl_2重悬细菌，冰浴30 min，离心，弃上清，倒置，再加4ml(含15％甘油)冰冷的CaCl2重悬细菌，分装(200 μ／tube)，-80 ℃保存。
2．转化：在冰浴中将1管XL1-Blue感受态菌解冻，将浓度为2ng／μ1的质粒DNA4μ1加入到8Oμ1感受态菌中。
3．轻轻摇匀，冰浴30 min。
4．42 ℃热激9O秒，然后迅速冰浴2 min。
5．加入LB培养液(无氨苄青霉素)0.8ml，在37 ℃，100转／min水浴孵育60 min。
6．取200μl菌液铺于琼脂板上(涂有X-Gal(20mg／ml)-IPTG(200mg／ml)的LB-氨苄青霉素50 mg／ml,1μl／ml培养基)，待菌液全部被吸收后，倒置平板于37 ℃培养12-16h。
1.2鉴定和挑选含重组质粒的菌落1．用无菌牙签挑取单菌落，接种到10 ml含氨苄青霉素的LB培养液的离心管中，于37 ℃，200转／分培养2h，取1 ml之一Eppendorf离心管，加50μl10mmol／L EDTA(pH 8.0)。
2．加入50μl新配置的0.2mol／L NaOH、0.5％SDS、20％蔗糖溶液后，振荡3O秒。
3．在70 ℃温育5 min，然后冷却到室温。
4．加1.5μ14mol／L KCl和0.5μ1含0.4％溴酚兰染液，振荡3O秒后，冰浴5 min。
5．12000g，4 ℃离以3 min，以除去细菌碎片。
6．制备1％的琼脂糖凝胶(含E B0.5μg／ml)，取50μl上清液加入到样品孔中，其中一孔加入中等分子量DNA Marker。
恒压50V，进行电泳。
7．当溴酚兰迁移到凝胶全长的2／3-3／4时，停止电泳，在紫外灯下检查质粒DNA分于量的大小是否与转入质粒相符。
1.3质粒的扩增和纯化1．用无菌牙签分别挑取单个白色菌落移入含30ml LB-氨苄青霉素(50μg／ml)培养液的聚丙烯管中，于37 ℃，200转／分培养3h。
2．将菌液转入含70 ml LB-氨苄青霉素培养液的250ml锥形瓶中，37 ℃，200转／分培养过夜(12-16h)，细菌浑浊。
3. 菌液中加入氯霉素液(34mg溶于lml乙醇，100ml菌液加入0.5ml氯霉素溶液，终浓度为170 μ／ml)。
37 ℃，200转／分培养12-16h。
4. 将培养的细菌倒入50ml的离心管中，6000rpm，4 ℃离,th,15 min，沉淀细菌。
5. 弃净上清夜，用2ml预冷的溶液I，悬浮菌体沉淀，剧烈振荡，于室温静置5 min6. 加入新配制的溶液II 4ml，快速用手晃动10秒，颠倒数次后，于室温静置10 min。
7. 加入预冷的溶液III 3ml，温和振荡l0秒，于冰上静置10 min，出现白色絮状沉淀。
8．6000rpm，4 ℃离心15 min，保留上清。
9．将上清(若带细菌残片，则再次离心)移入另一50ml的离心管中，加入O.6倍体积的异丙醇混匀，于室温静置10 min。
(或-20 ℃4h，或4 ℃过夜，可便核酸沉淀)10.12000 rpm，4 ℃离心15 min，回收核酸。
小心弃去上清，倒置离心管使残兼上清液流尽。
11．于室温用70％的乙醇洗涤沉淀物和管壁，室温12000 rpm离心，15 min，充分弃去乙醇，于室温将离心管倒置在纸巾上，使最后残余的痕量乙醇挥发殆尽。
12．用500μl TE(pH8.0)溶解核酸沉淀，转移至1.5 ml Eppendorf管中。
13．加入用冰预冷的5mol／L的LiCl溶液600μl，充分混匀。
12000 rpm，4 ℃离心15 min，以沉淀高分子量的RNA。
14.将上清转移到另一1.5 ml Eppendorf管中，加等量异丙醇，充分混匀，于室温静置10min。
15.12000 rpm,4 ℃离心15 min，回收核酸。
小心弃去上清，倒置离心管使残余上清液流尽。
16．于室温用70％的乙醇洗涤沉淀物和管壁，室温12000 rpm离心，15 min，充分弃去乙醇，于室温将离心管倒置在纸巾上，使最后残余的痕量乙醇挥发殆尽。
17.400μl含无DNA酶的RNA酶(20μg/ml)的TE缓冲液(pH8.0)溶解沉淀，将溶液转移到另－1.5 ml Eppendorf管中，室温放置1.5ml Eppendorf管中30min。
18．加入400μl 13％(v／v)的PEG 8000-NaCl(1.6 mol／L)，混匀，4 ℃12000 rpm离心5 min以回收质粒DNA，弃去上清。
19．加入400μl TE缓冲液(pH 8.O)溶解沉淀，再分别用等体积的Tris饱和酚、酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)、和氯仿各抽提一次。
20．将水相(上清)移入另一1.5ml Eppendorf管中，加入O.1体积(约50μ13M的醋酸钠(pH 5.2)和2倍体积(大约1 ml)的无水乙醇，充分混匀后于4℃放置30 min。
21．于4 ℃12000 rpm离心5 min回收沉淀的质粒DNA。
尽可能弃去上清，敞开管口，置工作台上使残留的痕量乙醇蒸发殆尽。
22．加入400 μl处于4 ℃的70％乙醇，稍加振荡，漂洗沉淀，4 ℃12000 rpm离心2 min。
23．吸去上清，室温敞开管口，直到乙醇完全挥发。
24．用100μl TE缓冲液(pH 8.0)溶解沉淀。
25．取4μl溶液1：100稀释后，测定其OD260、OD280，以确定质粒DNA的纯度和浓度(OD260／OD280>1.8。
OD260／OD280对DNA而言其值大约为1.8，高于2.0则可能有RNA污染，低于1.8则有蛋白质污染。
；DNA浓度=OD260 X 0.05 X稀释倍数(μg／μl)。
26．质粒DNA溶液于-20 ℃保存待用。
二、cRNA探针的标记1．将质粒DNA，用相应的限制性内切酶线性化，通过琼脂糖凝胶电泳以确保完全线性化。
2．线性化后的DNA按“质粒的纯化”步骤19-24进行纯化，作为cRNA探针标记的模板，用相应的RNA聚合酶合成地高辛标记的反义和正义RNA探针。
3．进行体外转录，步骤如下：4．在冰上将各试剂加入一1.5 ml无RNA酶的Eppendorf管中。
DEPC处理的三蒸水8μl质粒DNA模板0.05μg／μl1μl10 x NTP地高辛标记混合物1 x2μl0.1 M DTT溶液10 mM2μl5 x转录缓冲液1 x4μlRNAse抑制剂2U／μl1μlRNA聚合酶2U/μl2μl反应体系总体积20μl5．加入上述各试剂后，混匀，简短离心后在37 ℃孵育2h。
6．加入2μl无RNA酶的DNA酶I(10U／μ1)，37 ℃孵育15 min降解模板DNA。
7．加入0.2M EDTA(pH 8.0)溶液2μl终止反应。
8．加入2.5μl的4 M Licl和7.5μl冷的无水乙醇，混匀，-20 ℃放置2h。
9．12000g下离以15 min，弃上清，小心地用50 μl冷的70％乙醇洗涤沉淀。
1O．室温下稍干燥，溶于100μ1 DEPC处理过的三蒸水中，混匀分装，-20 ℃下保持备用。
三、原位杂交3.1冰冻切片与杂交前预处理1．将子宫样品从-80 ℃取出，用OCT包埋，在-23 ℃(切片机腔体温度)平衡至少30 min。
将包埋好的样品固定在样品头上，切10μm厚的连续组织切片，平铺于涂有多聚赖氨酸(1mg／m1)的玻片上(玻片预先经180 ℃干烤6小时)，保存于-70 ℃冰柜备用。
2．冰冻切片经室温干燥10 min后，在4％的多聚甲醛-PBS(pH 7.4)固定lO min。
3．活跃的DEPC-PBS(未高压的0.1％DEPC-1XPBS溶液)洗2次，每次5 min。
4．在0.2M的盐酸作用中作用10 min后，重复步骤4)。
5．在切片上滴加蛋白酶K(0.1μg／m1)，37 ℃孵育15 min，重复步骤4)。
6．经0.1M TEA(三乙醇胺)作用5min后，再在新配制的0.25％AA／0.1M TEA (乙酸酐／三乙醇胺，pH 8.0)中乙酰化10 min。
(在大多数实验中，步骤4，5，6省略)7．5 x SSC中平衡15 min。
3.2杂交8．在脱水后的玻片上滴加预杂交液(约100 μl／玻片)，置于放有湿盒液(50％甲酰胺v／v；0.3 M NaCl；1Mm EDTA；10 mM Tris-Cl，pH 8.O)的湿盒中，55～58 ℃下的烘箱中预杂交2 h。
9．甩掉预杂交液，地高辛标记的反义或正义cRNA探针(浓度1-2ng／μl)经70 ℃变性1O分钟，置冰上1 min，玻片上滴加预杂交液(约60μl／玻片)，覆盖parafilm膜，放湿盒中在48～58 ℃下杂交18-30 h。
3.3杂交后处理1O．取出玻片，小心去掉Parafilm膜，甩掉杂交液，用52 ℃预热的5×SSC洗30 min。
11．在无DNA的RNA酶A(20μg／ml)溶液中37 ℃下孵育30 min。
12．分别依次用52 ℃预热的2 X SSC，1 X SSC和O.1 X SSC洗2次，每次30 min。
3.4杂交信号检测13．在缓冲液A(0.1M Tris-HC 1 pH 7.5，0.15M NaC1)中平衡5min。
14．在玻片上滴加碱性磷酸酶的抗地高辛抗体(1：500～1:2000稀释于含0.5％，阻断液的缓冲液A中)，室温反应2h。
15．用缓冲液A洗2次，每次15 min。
16．在缓冲液B(0.1M Tris-HCl；0.1M NaCl；0.05M MgCl_2，pH 9.5)中平衡5 min。
17．硝基四氮唑蓝(NBT)和5-溴-4-氯-3-吲哚氧磷酸盐(BCIP)溶于缓冲液B中，每ml缓冲液B含有4.5μ1 NBT和3.5μ1 BCIP。
在玻片上滴加混合染液在湿盒中显色过夜。
18．充分显色后，用EDTA(1 mM EDTA，pH 8.0)洗15 min终止反应。
19．在95％乙醇中洗l h以除去非特异的背景。
20．用蒸馏水洗15 min除去可能存在的结晶体。
21．脱水、透明，用中性树胶封片。
22．充分干燥后在显微镜下观察、照相。