质粒提取操作步骤
质粒dna提取原理
质粒dna提取原理
质粒DNA提取原理是通过破坏细菌细胞壁和细胞膜结构，释
放质粒DNA，并利用化学方法提取纯化质粒DNA。
质粒DNA提取的步骤如下：
1. 细胞裂解：将细菌培养物经过离心，得到菌体沉淀，然后加入裂解缓冲液，破坏细菌细胞壁和细胞膜，释放质粒DNA。
2. 质粒DNA纯化：加入一定量的碱性溶液，使细菌染色体DNA变性沉淀，而质粒DNA仍溶于溶液中。
然后通过离心，将质粒DNA沉淀下来。
3. 质粒DNA沉淀：将溶液中的质粒DNA与乙醇混合，使质
粒DNA沉淀成片状。
通过离心，得到质粒DNA沉淀。
4. 质粒DNA溶解：将质粒DNA沉淀洗涤去除杂质，并用适
当的缓冲液将质粒DNA溶解，得到高浓度的质粒DNA。
质粒DNA提取的关键在于破坏细菌细胞结构，释放质粒DNA，然后利用沉淀和溶解等步骤进行纯化。
通过以上步骤，可以提取到纯化后的质粒DNA，用于后续实验或分析。
质粒提取的原理及步骤
碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，其基本原理为：当菌体在NaOH 和 SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。
一、试剂准备1. 溶液Ⅰ: 50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH 8.0)，10mM EDTA(pH 8.0）。
1M Tris-HCl[t1] (pH 8.0）12.5ml，0.5M EDTA（pH 8.0）10ml，葡萄糖4.730g，加ddH2O至500ml。
在10 lbf/in2高压灭菌15min ，贮存于4℃。
溶液Ⅰ50mM 葡萄糖/ 10mM EDTA / 25mM Tris-HCl，pH=8.0葡萄糖增稠，使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部；EDTA 抑制DNase的活性。
这一步溶液中还可以加入RNase，不受EDTA影响，并且可以在后续步骤中被除去2. 溶液Ⅱ：0.2N NaOH，1% SDS。
2N NaOH 1ml，10%SDS 1ml，加ddH2O至10ml。
使用前临时配置[t2]。
这是用新鲜的0.4 N的NaOH和2％的SDS等体积混合后使用的。
要新从浓NaOH稀释制备0.4N的NaOH，无非是为了保证NaOH没有吸收空气中的CO2而减弱了碱性。
很多人不知道其实破细胞的主要是碱，而不是SDS，所以才叫碱法抽提。
事实上NaOH是最佳的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱都会几乎在瞬间就溶解，这是由于细胞膜发生了从bilayer（双层膜）结构向 micelle（微囊）结构的相变化所导致。
用了不新鲜的0.4 N NaOH，即便是有SDS也无法有效溶解大肠杆菌（不妨可以自己试一下），自然就难高效率抽提得到质粒。
如果只用SDS当然也能抽提得到少量质粒，因为 SDS也是碱性的，只是弱了点而已。
很多人对NaOH的作用误以为是为了让基因组DNA变性，以便沉淀，这是由于没有正确理解一些书上的有关DNA变性复性的描述所导致。
质粒提取步骤protcol
质粒提取步骤（去除内毒素的kit）准备：挑取单克隆后摇菌12-16小时‘异丙醇，无水乙醇，1.5毫升无酶EP管，无菌去离子水，涡旋在SOLUTION 1中加入RNASE A 保存在4度冰箱DNA W ASH buffer中加入无水乙醇，室温保存HBC Buffer 中加入异丙醇，室温保存检查SOLUTION 2是否沉淀，若有沉淀，加热到37度溶解N3缓冲液放在冰上热块加热到42 度，或者水浴锅，还有一个，加热到70度离心机转速5000XG微凉离心机13000XG步骤：1、摇菌2、收集菌液，5000XG，室温离心，10min3、弃掉上层培养基4、加入500ul SOLUTION 1/RNASE A ，涡旋或者抽吸，彻底混匀。
重悬完全能获得好的结果5、转移细胞到新的2ml离心管中6、加入500ul SOLUTION 2，涡旋或轻柔旋转数次，获得澄清裂解液，孵育2-3min，注意避免用力混合，否则会剪切染色体DNA，降低质粒纯度，不要让裂解液反应超过5min，SOLUTION 2要盖紧，防止空气中的CO2导致其酸化7、加入250ul冰浴预冷的N3 Buffer，轻柔颠倒数次，直到形成白色絮状沉淀（除蛋白）Buffer必须充分混合，如果混合液是粘的，棕色的，成团的，需要更多次混合完全中和SOLUTION。
完全中和绝对影响结果。
8、最大转速（大于13000XG），离心10min,形成白色沉淀，迅速进行下一步9、将清澈的裂解有转移到1.5ml EP管，量取清澈的裂解液的体积10、加入1/10的ETR溶液，此时会浑浊，颠倒EP管10次，彻底混匀如果转移500ul清澈裂解液，就加入50ulETR溶液11、冰上孵育10min,在孵育过程中，颠倒混匀数次，冰上裂解后悔澄清，2min/次12、裂解液42度孵育5min,裂解液又会出现浑浊13、25℃12000XG，离心3min,,ETR溶液在管底部14、将上层水相转移到一个新的1.5ml EP管中，加入1/2体积无水乙醇，轻柔颠倒6-7次，室温培养1-2min15、将小柱加入2ml管中，注意：选择性步骤：小柱是否处理16、将700ul混合液加入小柱中17、最大转速（大于13000XG），离心1min,18、弃去滤液，重新放回19、重复16-18，所有的东西都保存在柱里20、加入500ul HBC Buffer 注意加入异丙醇21、最大转速（大于13000XG），离心1min,22、弃去滤液，重新放回23、加入700ul DNA wash buffer 注意加入无水乙醇24、最大转速（大于13000XG），离心1min,25、弃去滤液，重新放回26、重复步骤23-25，27、最大转速空载离心2min,使管干燥，残余乙醇有干扰28、将滤柱放于1.5ml EP管中29、加入80ul洗脱缓冲液或者无酶水，直接加到中间，主要看穿着和穿着的悬液。
质粒提取 原理及步骤
质粒提取原理及步骤质粒提取是分子生物学中的一项重要实验技术，被广泛应用于基因克隆、基因转染、基因表达等方面。
本文将重点介绍质粒提取的原理及步骤。
一、原理质粒提取的原理基于质粒和细胞的生化学性质差异。
质粒是一种独立复制的DNA分子，可以自主复制并传递给细胞的子代。
而在真核细胞中，大多数DNA都位于细胞核中，很难获得足够的DNA量进行实验。
质粒提取利用了这一差异，将大量的质粒从细胞中提取出来。
质粒提取的主要步骤如下：二、步骤1. 细胞培养首先需要选择适当的细胞类型并在培养基中培养，使细胞处于最佳生长状态。
对于大多数细胞类型，建议在对数生长期时采集，因为此时细胞数量最多且代谢活跃，可以有效提高质粒提取的DNA量和质量。
同时，还需注意避免细胞因为过于密集而形成聚集体或凝胶。
2. 细胞收获收获细胞的方法取决于细胞类型和实验的目的。
常见的方法包括用PBS或细胞培养液将细胞冲洗下来，或者用胶体离心等方法进行细胞收获。
收获的细胞量需要根据实验需求进行调整，一般建议在0.1-1g的范围内收获细胞。
3. 细胞裂解细胞裂解是质粒提取过程中最关键的步骤之一，它能有效破坏细胞膜和核膜，释放细胞内的DNA。
常用的细胞裂解剂包括SDS、Triton X-100和Tween-20等，同时还需要将细胞裂解液加入蛋白酶抑制剂和DNA酶切酶，以避免核酸降解和一些酶促反应的发生。
细胞裂解后，将细胞裂解液转移到离心管中，并进行离心分离，将细胞碎片等大分子杂质通过离心将其剔除。
4. DNA纯化DNA纯化是质粒提取的最后一步，目的是将提取得到的DNA从其他杂质中纯化出来。
不同的实验需求需要不同级别的DNA纯化，从而需要使用不同种类的DNA纯化试剂盒。
目前常用的DNA纯化试剂盒包括酚/氯仿提取法、离子交换柱纯化法、硅胶膜纯化法等。
在DNA纯化后，通过分析电泳和UV测定等方法进行检测，以确保提取的DNA质量和浓度满足实验需求。
总结质粒提取是分子生物学中非常基础和常用的实验技术，其所涉及的步骤包括细胞培养、细胞收获、细胞裂解和DNA纯化等步骤。
质粒提取方法
质粒提取：质粒是细胞染色体外弄够自主复制的很小的环状DNA分子。
1、将新鲜单菌落或液体培养物接种到5mL液体培养基中，32℃振荡培养至对数生长后期；（振荡速度250-300rpm）2.将菌液倒入1.5mL离心管中，4℃，10000rpm离心20秒，弃去上清液，将离心管倒置于吸水纸上，使上清液尽可能去尽。
为增加菌体的量，可重复操作2-3次；3.将收集的沉淀重悬于预冷的100μL溶液Ⅰ中，涡旋混匀，使充分悬浮，温室放置5分钟。
4.加入200μL溶液Ⅱ，颠倒混匀，冰浴5分钟。
（1、溶液变成半透明粘液；2、冰浴使染色体DNA片段不至于太小，质粒不容易开环；3、若SDS因温度太低析出，需微热使融）5.加入150μL溶液Ⅲ，混匀，冰浴5分钟，（DNA复性）6.12000rpm离心5分钟，将上清液移至1个新的1.5mL的离心管中，（上清液为复性的质粒，沉淀为缠绕的染色体及少量蛋白质）7.加入2倍体积无水乙醇颠倒混匀，室温放置10分钟，（无需-20℃）8.12000rpm离心10分钟，弃去上清液，将管口打开，倒置于吸水纸上，使所有液体尽可能流出。
9.加入1mL75%乙醇（洗去DNA表面的盐类），12000rpm离心5分钟。
10.弃去上清液，将离心管倒置于吸水纸上，使液体流尽，置通风厨中至液体挥干（乙醇需完全挥发）11.将沉淀溶于40μL含20μg/L（2%的浓度）的RNA酶的TE溶液中，38℃放置于10分钟，-20℃保存。
12.检验（DNA溶于水，不溶于酒精）质粒提取中溶液的配制(准备工作)1. 0.5M EDTA（pH=8.0）(10mL)称取1.8g Na2EDTA•2H2O加入约8mL的去离子水，充分搅拌均匀，用NaOH调节pH至8.0（约0.2gNaOH）pH值为8.0时，EDTA才能完全溶解，加入去离子水将溶液定溶至10mL，高温高压灭菌后室温保存。
2. 1M Tris-HCL(pH=8.0)10mL称量1.211g Tris,加入约8mL去离子水，充分搅拌溶解，加入0.42mL浓盐酸，定容至10mL，高温高压灭菌后，室温保存。
质粒dna提取步骤
质粒dna提取步骤
质粒 DNA 提取是分子生物学实验中的一项基本技术，用于从细菌细胞中分离出质粒DNA。
以下是一般的质粒 DNA 提取步骤：
1. 收集细菌培养物：将含有质粒的细菌培养在适当的培养基上，直到培养物达到合适的密度。
可以使用离心或过滤的方法收集细菌细胞。
2. 细胞裂解：将收集的细菌细胞加入裂解缓冲液中，通过物理方法（如搅拌、超声处理等）或化学方法（如加入裂解酶等）使细胞破裂，释放出质粒 DNA 和其他细胞成分。
3. 去除细胞碎片：将裂解后的混合液通过离心或过滤的方法去除细胞碎片和其他杂质。
4. 沉淀 DNA：向裂解液中加入乙醇或异丙醇等沉淀剂，使质粒 DNA 沉淀。
通过离心将沉淀收集。
5. 洗涤沉淀：用 70%的乙醇洗涤沉淀，以去除残留的盐分和杂质。
6. 干燥沉淀：将洗涤后的沉淀离心，并去除上清液。
然后将沉淀在室温下干燥，以去除残留的乙醇。
7. 溶解 DNA：将干燥的沉淀加入适当的缓冲液中，使质粒 DNA 溶解。
可以在缓冲液中加入 RNA 酶以去除 RNA 杂质。
8. 纯化和浓缩 DNA：可以使用柱层析、电泳或其他方法对提取的质粒 DNA 进行进一步的纯化和浓缩。
9. 质量检测：使用琼脂糖凝胶电泳或其他适当的方法检测提取的质粒 DNA 的质量和完整性。
需要注意的是，具体的质粒 DNA 提取步骤可能因使用的试剂盒或实验条件而有所不同。
在进行质粒 DNA 提取之前，应仔细阅读所使用的试剂盒说明书或相关实验方案，并根据实际情况进行适当的调整和优化。
质粒DNA的提取实验报告
质粒DNA的提取一、实验方法碱裂解法抽提质粒DNA二、实验原理基于质粒DNA与染色体DNA变性与复性的差异。
三、实验步骤1）质粒提取1. 10,000g,1min离心收集1.5－5ml菌液沉淀于1.5ml离心管中。
2. 加入100μl溶液1，振荡至彻底悬浮。
3. 加入200μl溶液2，立即轻柔颠倒离心管6次，使菌体充分裂解，随后将离心管冰上放置3分钟4. 加入150μl溶液3，立即温和颠倒离心管数次，冰上放置3分钟，10，000g离心10min。
5. 将步骤4的上清转移至新的离心管（尽量去除杂质），加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇混合均匀10，000g离心5min。
6. 将步骤5的上清转移至新的离心管，加入2倍体积的无水乙醇，室温放置5－10min，沉降DNA7. 10，000g离心10分钟,弃乙醇，保留沉淀，加入1ml 70％的乙醇洗涤沉淀，10，000g离心5分钟8. 倒掉乙醇溶液，用吸水纸吸净管壁上的水珠，室温蒸发痕量乙醇9. 加入适量含RNase的TE或灭菌双蒸水溶解质粒DNA2）质粒鉴定→琼脂糖凝胶电泳灌胶：胶中加入荧光染料(SYBR Green I)加样：质粒+上样缓冲液→混匀电泳结果观察：UV灯下四、实验结果五、实验分析裂解细胞中除含有质粒DNA外，还含有基因组DNA、各种RNA、蛋白质和脂类等物质，因此用碱裂解法除去杂质1、防止DNA裂解：Solution 11）、所含糖增加溶液黏度，维持渗透压，防止DNA受机械剪切作用降解2）、所含EDTA抑制酶活性2、溶解与变性：Solution21)强碱使质粒DNA和染色体DNA变性2）离子型表面活性剂SDS可溶解膜蛋白3、沉降与复性：Solution31)质粒DNA复性2）在钾盐中，染色体DNA形成缠连的不溶性网状结构，和不稳定的大分子RNA以及变性的蛋白质和细菌碎片等一起沉淀预期结果为剩余质粒DNA4、琼脂糖凝胶电泳1）荧光染色染料分子可嵌入双链DNA分子配对碱基之间2）琼脂糖可起到电泳和分子筛的作用，因所带电荷、分子量大小和构型不同，泳动速度不同六、误差分析实验失败，本组实验出现4条带，3明1暗，明亮处应为DNA分子数最多的，为质粒DNA，质粒DNA前有较暗的两条带，推测其中一条为未复性质粒DNA，可能Solution2处变性过长，不易复性，或Solution3处时间过短，复性不充分。
质-粒-提-取-原理及步骤
质-粒-提-取-原理及步骤概述质粒提取，又称DNA提取，是一种分离和提取所需DNA的过程。
质粒提取在许多实验中都是非常重要的步骤，例如基因工程、分子生物学、遗传学和其他DNA相关实验。
本文将介绍质粒提取的原理及步骤。
原理DNA提取的过程通常包括细胞破碎、DNA纯化、DNA溶解和复性等步骤。
对于质粒提取，主要步骤通常包括以下内容：1.细菌培养：在质粒提取之前，需要将细菌培养在含有适当抗生素的培养基中，用于扩增质粒数量。
2.细胞破碎：使细胞破裂以释放出含有质粒的细胞内物质，此步骤需要进行严格的抗污染措施，以避免污染质粒样本。
3.除去污染物：除去细胞壁、蛋白质、核酸和其他污染物。
4.离心分离：将上述步骤中提取出的样本进行离心分离，使DNA沉淀，以便进一步纯化。
5.溶解：通过加入一定的缓冲液或去离子水，使DNA重新溶解。
步骤以下是一种常见的质粒提取步骤：1.处理样本：将含有所需质粒的细胞收集，并进行初始处理，包括细胞壁破裂、核酸纤维溶解等。
2.傅里叶纯化：通过傅里叶变换纯化，将细胞内杂质和有机污染物清除。
3.离心分离：将细胞样本离心，使DNA沉淀到底部，并且将上层样本移除。
4.乙醇沉淀：加入乙醇沉淀，将DNA纯化到上清液。
5.重振溶解：最后使用适当缓冲液重振重振溶解DNA，也可以使用去离子水重振。
以上就是质粒提取的原理和步骤，这是一个非常重要的操作，在DNA研究和实验中有着广泛的应用。
我们需要注意的是，在操作过程中需要进行高标准的质量控制，以确保实验结果的准确性。
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操作步骤：
本实验方法适用于从1-10ml过夜培养的大肠杆菌菌液中提取质粒。
提取量受菌株、质粒拷贝数、菌液体积和培养时间、培养基类型等因素的综合影响。
1.收菌：将过夜培养（37℃，12-16小时）的菌液于室温≧10,000g
离心1-2分钟，彻底弃除上清。
注意：高拷贝质粒建议使用≦5ml菌液；菌液用量过大不仅不能增加质粒产量，反而会因裂解不完全或杂质封闭硅胶膜而降低产量；培养时间不宜过长，否则会增加开环结构质粒的比例。
2.重悬：加入250µl含RNase A的细胞悬浮液（S1），充分混悬震荡
或用枪头反复抽打使细菌彻底分散悬浮。
3.裂解：加入250µl细胞裂解液（S2），轻轻上下颠倒混合5次，室
温静置1-5分钟，待细菌充分裂解，溶液变半透明。
注意：避免剧烈震荡导致基因组DNA裂解，裂解时间不能超过5分钟。
4.中和：加入350µl中和缓冲液（S3），轻轻上下颠倒混合5次，充
分混匀，避免剧烈震荡。
室温下≧12,000g离心10分钟。
5.DNA结合：小心吸取上清，转移到插入收集管的离心吸附柱内，室
温下≧12,000g离心1分钟，弃除收集管中的废液，将离心吸附柱重新插回收集管中。
6.清洗：加入500µl漂洗液（WB,请确认已加入乙醇！）于离心吸附
柱中，室温下≧12,000g离心30秒，弃除收集管中的废液，将离心吸附柱重新插回收集管中。
7.再次清洗：加入500µl漂洗液（WB）于离心吸附柱中，室温下≧
12,000g离心30秒，弃除收集管中的废液，将离心吸附柱重新插
回收集管中。
将离心吸附柱开盖再次离心2分钟，彻底除去残余漂洗液。
8.洗脱：小心取出离心吸附柱，将其套入一个新的1.5ml灭菌离心
管中。
向硅胶吸附膜的中央加入100µl洗脱缓冲液（EB），室温放置1分钟后，≧12,000g离心1分钟收集质粒DNA。
注意：为提高质粒浓度，最低可使用30µl的EB溶液，离心收集后壳将洗脱的质粒溶液再次加入离心吸附柱中重复洗脱；使用100µlEB溶液则无需二次洗脱；对6kb以上的质粒，可使用预先加热至55℃的EB溶液洗脱以提高产量；EB溶液不含EDTA，故不会影响荧光测序等后续反应；如必须使用无菌去离子水洗脱，需注意其pH值是否接近中性，否则应使用NaOH溶液将pH值调节至7.0-8.5之间。
9.储存：弃除离心吸附柱，纯化的质粒可直接用于后续反应或于
-20℃长期保存。
注意：经检测，本试剂盒从endA¯菌株（如DH5α，TOP10，XL1-blue等）中提取的质粒反复冻融20次无降解；如需在4℃长期保存或者保存从endA+菌株（如JM109，HB101，BL21等）中提取的质粒，可向每100µl质粒溶液中加入11µl的10×TE溶液，但含EDTA的质粒溶液不可用作荧光测序模板。