登革2型病毒浙江分离株的鉴定与分子流行病学研究.
登革2型病毒E基因克隆及B细胞抗原表位分析
【 ｅ ｗ ｒｓ Ｄ ｎｕ ｖｕ ； ｎ ； ｌｅｉｐ Ｋ ｙ ｏｄ 】 ｅｇｅ ｒ Ｅ ｇ ｅ Ｂｃ ｌ ｐ ｏｅ ｉ ｓ ｅ ｅ ｔ
登革病毒 （ｅｇｅｖ ｕ， Ｅ ） 黄病毒科 黄病毒属 ， 因 ｄｎｕ ｉ ｓＤ Ｎ 属 ｒ 基 组为单股 正链 Ｒ Ａ， Ｎ 全长 约 １ ｋ ， １ ｂ 包括 ５ 和 ３非编码 区及一 ’ ’ 个开放 阅读 框 。Ｄ Ｎ共 有 ４个 血 清 型 ， 可 引起 登 革 热 Ｅ 均 （Ｆ 、 Ｄ ）登革出血热（ Ｈ ） Ｄ Ｆ 和登革休 克综合征 （ Ｓ ）通 常登革 ＤＳ， ２型病 毒（ Ｅ ２ 的感染较其 他血 清型更为严重“ Ｄ Ｎ） 。 大量研究表 明 ， Ｅ蛋 白作 为登 革病 毒重 要 的抗 原蛋 白 ， 它不仅是登革病毒 主要 的毒力 蛋 白， 而且 还带 有型 特异 、 属 特异抗原决定 簇 。Ｅ蛋 白存 在诱 导 中和抗 体及 血凝 作用 有 关的抗体 表位 ， 能诱导 宿主 产生保 护性 的 中和抗体 ， 能 它 又 诱导产生血凝抑制抗 体 ， １ 可弓 起宿 主保护 性免 疫反 应 ， 此外 还与 Ｄ Ｆ和 Ｄ Ｓ的致 病机制有关。同时 ， 白在毒 粒侵染 Ｈ Ｓ Ｅ蛋 细胞过程 中起 重要作用 ， 白上可 能具有 某些 宿主细胞 表 Ｅ蛋 面受体结合的配体。因此 ， 获得 高纯度 的 Ｅ蛋 白为制备登 革 病毒高效 、 特异 的单克 隆抗体 和研究 宿主细胞上 登革病 毒受 体有重要 意义 ， 为进一 步探讨 Ｄ Ｆ Ｄ Ｓ的致病 机 制提 供 还 Ｈ 、Ｓ 坚实 的基础 。本研 究通 过 Ｒ －Ｃ ＴＰ Ｒ方法 ， 建了登革 ２型病 构 毒新几 内亚株 （ Ｇ Ｅ基 因的克 隆载体 ， Ｎ Ｃ） 并对 其 Ｅ蛋 白进行 Ｂ细胞抗原表位分析 ， 为制备登 革 ２型病毒 Ｅ基 因单 克隆抗 体 和疫苗奠定 了基础 。
白蚊伊蚊经卵传递登革2型病毒的实验研究
白蚊伊蚊经卵传递登革2型病毒的实验研究
宋秀玲;黄炯烈;郑小英;吴瑜;王玲;潘实清
【期刊名称】《热带医学杂志》
【年(卷),期】2005(5)1
【摘要】目的证明白蚊伊蚊亲代能够经卵传递登革2型病毒给子代,并且在传递过程中病毒毒力呈逐渐增强趋势。
方法采用套式PCR分批检测感染雌蚊的子一代至子四代卵内登革病毒结合C6/36细胞培养分离病毒及TCID50法滴定病毒滴度。
结果白蚊伊蚊能经卵传递DEN-2,至少可传四代以上;且在传代中病毒毒力有增强的趋势。
结论实验证明白蚊伊蚊对登革2型病毒有较大的媒介效能,且在维持登革病毒的自然循环中起重要作用。
【总页数】4页(P22-25)
【关键词】白蚊伊蚊;登革2型病毒;经卵传递;登革病毒毒力
【作者】宋秀玲;黄炯烈;郑小英;吴瑜;王玲;潘实清
【作者单位】中山大学基础医学院寄生虫学教研室
【正文语种】中文
【中图分类】R384.1
【相关文献】
1.白纹伊蚊干燥卵保存登革2型病毒的实验研究 [J], 郭晓霞;赵彤言;董言德
2.共感染白纹伊蚊浓核病毒-3对登革2型病毒在蚊细胞内复制的影响研究 [J], 郭菁华;王衍海
3.登革Ⅱ型病毒经白纹伊蚊滞育卵的传递 [J], 郭晓霞;赵彤言;董言德;蒋书楠;陆宝麟
4.白纹伊蚊经交配传递登革1型病毒的实验研究 [J], 江毅民;严子锵;胡志刚;李成玲
5.白纹伊蚊经滞育卵传递登革Ⅱ型病毒的实验研究 [J], 郭晓霞;赵彤言;董言德;蒋书楠;陆宝麟
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登革热的鉴别诊断及治疗
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重症登革热
发病初期临床表现同登革热 发热数天后病情突然加重，快速进展为登革出血热或登革休克综合征（退热或许
就是重症的开始！） 死亡率较普通登革热大幅增高 重症登革热发病机制：未完全清楚 抗体依赖的增强作用（antibody-dependent enhancement, ADE） • 增强病毒对靶细胞的吸附 • 免疫细胞过度释放促炎细胞因子 • 抗原抗体复合物激活补体损伤靶细胞
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（二）临床表现
1、 急起高热，可伴畏寒，24小时内体温可达40℃部分病例发热3-5天后体温降至 正常，1-3 天后再度上升，呈双峰或马鞍热型。 2、三痛：头痛、眼球后痛、全身肌肉和骨关节痛 3、皮疹：病程第 3～7 天出现，多有痒感 4、出血：可出现不同程度皮下出血、注射部位瘀点瘀斑、牙龈出血、鼻衄等；束 臂试验阳性。 5、乏力；胃肠道症状（恶心，呕吐，腹痛，腹泻） 6、浅表淋巴结肿大
1、登革热的诊断。 根据流行病学史、临床表现及实验室检查结果，可做出登革热 的诊断。在流行病学史不详的情况下，根据临床表现、辅助检查和 实验室检测结果作出诊断。 （1）疑似病例：符合登革热临床表现，有流行病学史（发病 前15天内到过登革热流行区，或居住地有登革热病例发生），或有 白细胞和血小板减少者。
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（二）实验室检查
4、病原学及血清学检测：可采集急性期及恢复期血液标本送检。有病原 学检测条件的医疗机构应尽快检测，无病原学检测条件的医疗机构应留取标本送 指定机构检测。
急性发热期可应用登革热抗原(NS1) 检测及病毒核酸检测进行早期诊断，有条件进行病毒分离。 初次感染患 者，发病后3～5天可检出IgM抗体，发病2周后达到高峰，可维持2～3月； 发病1周后可检出IgG抗体，IgG抗体可维持数年甚至终生；发病1周内， 在患者血清中检出高水平特异性IgG抗体提示二次感染，也可结合捕获法检测的 IgM/IgG抗体比值进行综合判断。
登革2型型内嵌合病毒HFT04／501乳鼠神经毒力特征的研究
嵌 合 病 毒 全 长 ｅ Ａ 克 隆 的 构 建 ： 用 Ｏ －Ｃ ＤＮ 采 ＬＰ Ｒ
（ｖｒｐｅｅｓｎＰ Ｒ 方法 构 建嵌 合 登 革 ２型病 毒 ｏｅａ ｘ ｎｉ ｃ ） ｌ ｔ ｏ
全长 ｃＮ Ｄ Ａ克 隆 Ｑ －４ＭＯ Ｓ １ 。 Ｈ０ ／ Ｎ ０ … 全 长 ＲＮ 转 录 体 的 产 生 ： ＱＡ Ｅ ｌｓ ｉ Ａ 用 ＩＧ Ｎ Ｐａｍｄ 菌 株 、 粒 和 细 胞 ：Ｄ ＷＳ０ 质 ｐ Ｖ ５ １为 含 登 革 ２型 病
赵 卫 范 宝 昌 胡 志君 陈 水 平 王 鹏 程 苑 锡 同 李 晓 萸 于 曼 秦 鄂 德 杨 佩 英 登 革 ２型 （ Ｅ ２ 病 毒 ０ 是 １８ ＤＮ） ４株 ９５年 海 南 省 登 革 热 流 行 高 峰 期 从 登 革 出 血 热 患 者 血 清 中分 离 ， 无 乳 鼠 神 经 毒 力 。 ｐ Ｖ Ｓ １为 含 有 Ｄ Ｎ Ｄ ＷＳＯ Ｅ ２全 长 ｃ Ｎ Ｄ Ａ
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２Ｏ Ｏ ２年 ｌ 第 ２ １月 ２卷 第 ６
Ｃ ｉ ｃｏｉｌ ｍ ｕ ｏ，Ｎ ｖｍ ｅ ０ ２ ｈｎＪＭｉｒ ｏ Ｉ ｍ ｎ ｌ ｏｅ ｂｒ ０ Ｌ Ｄ Ｌ ｂ ２ ｌ
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病 毒 学 ．
Hale Waihona Puke 登 革 ２型 型 内嵌 合 病 毒 Ｈ Ｔ ４５ １乳 鼠神 经 毒 力 特 征 的研 究 Ｆ ０ ／０
ｏ ａ体 Ｎ Ｐ ２眦 ＬＡｌ Ｃ Ｐ Ｉ Ｐ、 Ｔ 、 自 Ｐ ） 帮 公 司 。 登 革 ２型 病 毒 ０ ｎｍｅ ４株 、 肠 杆 菌 以 ２ｔ 系进 行体外转 录 ： ， （５ 大
Ｄ ５ 、 ６３ Ｈ ａＣ ／ ６和 Ｂ Ｋ ２ 细胞 由本实验室保存 。 Ｈ －１
工 具 酶 及 其 它 试 剂 ：Ｎ Ｐ购 自 Ｐ ａｎｅａ 司 ， ｄＴ ｈｎａｉ公
登革2型病毒E基因的表达及应用于血清学检测
登革2型病毒E基因的表达及应用于血清学检测张志珊;严延生;翁育伟【期刊名称】《中国人兽共患病学报》【年(卷),期】2012(028)005【摘要】To obtain dengue virus type 2 envelope glycoprotein used for serologic diagnosis of dengue virus infection, the truncated K protein deleting the carboxy-terminal - 100 aa of dengue virus type 2 was amplified by reverse transcription PCR. The products of PCR were ligated with plasmid pET-30a and transformed into Escherichia coli competent cells BL21 (DE3) to express recombinant protein. The expressed product was purified by electroelution. The purified recombinant protein was applied to test sera from patients infected with dengue virus type 2 by indirect ELISA. The results were compared with those tested by IFA or Panbio Dengue IgG capture ELISA. Results showed that the recombinant plasmid was successfully constructed and expressed in E. Colt. After the recombinant protein was used to detect sera from patients infected with dengue virus type 2, a sensitivity of 95. 6% and a specificity of 96. 8% were obtained by comparing with IFA. Furthermore, the results were in excellent agreement with those obtained by using a commercially available diagnostic kit, Dengue Duo rapid strip test from Panbio (P>0. 05). In conclusion, the truncated E protein of dengue virus type 2 was successfully expressed in E. Coli and the recombinant protein could be applied asantigens for dengue serum detection.%目的利用大肠杆菌表达登革病毒2型外膜蛋白,获得重组抗原应用于血清学检测.方法用RT-PCR法扩增登革2型病毒去除C端100个氨基酸的外膜蛋白基因片段,与表达载体pET-30a连接,构建重组表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,重组蛋白用电洗脱法进行纯化.纯化的重组蛋白用间接ELISA法检测登革2型感染者血清,检测结果与间接免疫荧光法、澳大利亚Panbio试剂进行比较.结果重组质粒构建成功,经IPTG诱导后在大肠杆菌中表达重组蛋白.纯化的重组蛋白用于检测登革2型感染者血清,以IFTA作为参照标准,其敏感性为95.6%,特异性为96.8%.与澳大利亚Panbio IgG捕获法ELISA试剂盒检测结果相比,两种方法对登革2型IgG的检出率无统计学意义(P>0.05).结论成功通过大肠杆菌表达登革2型去除C端疏水区的外膜蛋白,重组抗原可应用于血清学检测.【总页数】4页(P421-424)【作者】张志珊;严延生;翁育伟【作者单位】福建医科大学附属泉州第一医院检验科,泉州,362000;福建省疾病预防控制中心,福州,350001;福建省疾病预防控制中心,福州,350001【正文语种】中文【中图分类】R373.3【相关文献】1.登革2型病毒E蛋白结构域Ⅲ的表达及多克隆抗体制备 [J], 邹罡;青敏;蔡全信;袁志明2.我国3株登革2型病毒E基因序列测定及毒力基因位点分析 [J], 赵卫;胡志君;杨敬;杨佩英;秦鄂德;于曼;段鸿元;欧武3.登革2型病毒PrM基因的重组甲病毒RNA介导的抗病毒作用的研究 [J], 于曼;秦鄂德;赵卫;胡志君;苑锡同4.登革2型病毒NS3基因的酵母表达及其免疫反应性的测定 [J], 晏辉钧;江丽芳;方丹云;周经姣;郭辉玉5.登革2型PrM基因的重组病毒对不同型别登革病毒复制的阻断作用 [J], 于曼;秦鄂德;陈水平;赵月峨;范宝昌;段鸿元;姜涛;杨佩英;胡志君因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
【国家自然科学基金】_登革ⅱ型病毒_基金支持热词逐年推荐_【万方软件创新助手】_20140731
2011年 科研热词 登革病毒 登革热病毒 登革2型病毒 病毒样颗粒 毕赤酵母 重组质粒 酸性自噬泡 通透性 近交balbc 诊断方法 血小板 蔗糖密度梯度离心 荧光免疫测定 自噬 磷酸化 登革病毒感染 登革热 病毒包膜蛋白质类 病毒分离 特异性抗体 波形蛋白 整合素类 敏感性 抗原检测 抗体 小鼠 可检测 原核表达 单克隆抗体 包膜蛋白 分子生物学检测 免疫层析法 体液免疫应答 人脐静脉血管内皮细胞 ns1基因 e基因序列 ecv304细胞 eahy926 balb/c小鼠 推荐指数 5 2 2 2 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
科研热词 推荐指数 登革病毒 7 输入性流行 1 血管内皮细胞 1 细胞因子 1 细胞凋亡 1 细胞 1 线粒体膜电位 1 白纹伊蚊中肠 1 登革病毒2型 1 登革热 1 登革ⅱ型病毒 1 登革2型病毒 1 甘露糖受体(mr) 1 树突状细胞 1 极化 1 抗原表位 1 抗体依赖性感染增强作用(ade) 1 微中和实验 1 巨噬细胞 1 受体分子 1 受体 1 反向重复序列 1 包膜蛋白结构域ⅲ 1 前膜蛋白 1 分子流行病学 1 凋亡 1 中和抗体 1 中和作用 1 tlr7 1 rna干扰 1 raw264.7 1 prm蛋白 1 prm多克隆抗体 1 ns1蛋白 1 myd88 1 huvecs 1 fc受体 1 fas/fasl 1 denv-2 1 den2 1 c型凝集素结构域家族五成员a(clec5a) 1 c6/36细胞 1 bhk-21细胞 1
推荐指数 3 3 2 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
一株高病毒载量PCV2_毒株的基因组特征及序列分析
广东农业科学Guangdong Agricultural Sciences 2024，51（3）：124-135 DOI:10.16768/j.issn.1004-874X.2024.03.012常鑫，蒋智勇，卞志标，徐民生，杨冬霞，杨傲冰，翟少伦. 一株高病毒载量PCV2毒株的基因组特征及［J］. 广东农业科学，2024，51（3）：124-135. CHANG Xin, JIANG Zhiyong, BIAN Zhibiao, XU Minsheng, YANG Dongxia, YANG Aobing, ZHAI Shaolun. Genome characterization and sequence analysis of porcine circovirus type 2 isolated with high viral load［J］. Guangdong Agricultural Sciences, 2024，51（3）：124-135.一株高病毒载量PCV2毒株的基因组特征及序列分析常 鑫1,2，蒋智勇2，卞志标2，徐民生2，杨冬霞2，杨傲冰3，翟少伦2（1.仲恺农业工程学院动物科技学院，广东 广州 510305；2. 广东省农业科学院动物卫生研究所/广东省畜禽疫病防治研究重点实验室/农业农村部兽用药物与诊断技术广东科学观测实验站，广东 广州 510640；3.广东永顺生物制药股份有限公司，广东 广州 511356）摘 要：【目的】了解广东省某猪群中猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2，PCV2）流行毒株的遗传进化情况，丰富PCV2分子流行病学数据，为当地PCV2疫苗候选株的选用和研发提供参考。
【方法】使用qPCR方法对疑似PCV2的样品进行检测，发现1株具有高病毒载量的PCV2毒株，命名为GD222858。
通过PCR方法进行全基因组分子克隆及遗传进化分析。
登革2型病毒全长NS1基因真核表达载体的构建及序列分析
登革2型病毒全长NS1基因真核表达载体的构建及序列分析曾祥凤;江丽芳;邵焰;方丹云;魏惠永【期刊名称】《热带医学杂志》【年(卷),期】2004(4)6【摘要】目的克隆登革2型病毒(DEN2)全长NS1基因,构建NS1基因的真核表达重组质粒。
方法用RT-PCR技术扩增DEN2(NGC株)全长的NS1基因序列,并定向克隆入pPICZαB的KpnⅠ/XbalⅠ位点,构建真核表达载体pPICZαB-NS1,转化E.coliDH5a菌。
阳性重组质粒用PCR、酶切及序列测定等方法鉴定。
结果阳性质粒经PCR及KpnⅠ/XbaⅠ双酶切获得了一个核苷酸长度为1134bp的基因;序列测定证实该基因与DEN2(NGC株AF038403)NS1基因序列有99%同源。
结论成功构建了含有DEN2全长NS1基因的真核表达载体pPICZαB-NS1,为NS1的进一步酵母表达奠定了良好的基础。
【总页数】4页(P662-665)【关键词】登革病毒;NS1基因;克隆;测序;真核表达【作者】曾祥凤;江丽芳;邵焰;方丹云;魏惠永【作者单位】中山大学基础医学院微生物学教研室【正文语种】中文【中图分类】R373.33【相关文献】1.两株登革2型病毒NS1基因真核重组质粒免疫BALB/c小鼠产生特异性抗体水平的比较 [J], 任丽娟;左丽;朱海东;胡方芳2.两株登革2型病毒E、NS1蛋白基因序列测定及其系统发生分析 [J], 郝牧;左丽;舒莉萍;李永念3.云南登革4型病毒的鉴定及NS1和NS2a基因序列分析 [J], 王静林;张海林;孙肖红;付士红;米竹青;龚正达;翟友刚;唐青;梁国栋4.登革2型病毒NGC株NS1基因部分序列pcDNA3.1载体的构建 [J], 任丽娟;左丽;朱海东5.登革2型病毒NS1基因真核表达载体的构建及意义 [J], 何莉;易小芳;罗春华因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
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登革 2 型病毒浙江分离株的鉴定与分子流行病学研究登革病毒(Dengue virusQV)是黄病毒属的一个血清学亚群,它包括4个不同的血清型, 引起的登革热(Dengue fever,DF) 是一种急性发热性传染病, 这种疾病有时发展成登革出血热及登革休克综合征(Dengue hemorrhagic fever, DHF 或Dengue shock syndrome, DSS), 常可导致患者死亡。
登革热的流行是热带和亚热带地区一个严重的公共卫生问题, 亚热带地区至少基金项目: 浙江省科技厅重点项目(2001136) 作者单位:浙江省疾病预防控制中心(杭州310009) 作者简介: 夏时畅(1962 ), 男,浙江富阳人,副主任医师,中心副主任, 主要从事传染病流行病学研究。
有8 个国家流行该病。
登革出血热是引起儿童住院和死亡的十大原因之一,自1978年以来,我国南方就发生了7次流行,它严重危害着人们的健康。
浙江省在1929年发生过一次登革热流行〔1〕,间隔76年后,于2004 年7-10月又由泰国输入病例引起浙江省本地113 例登革热病例的局部流行。
2004 年10 月浙江省杭州市又报告了 1 例输入性疑似登革热病例。
为了对该病例及时做出实验室确诊, 分析毒株的基因变异和种系进化特征, 从分子水平追踪传染源, 我们采集了患者血清标本, 进行了登革热血清学、病原学和分子生物学特征研究。
1 材料与方法1.1 患者及标本来源周某某,2004年10月8日从马尔代夫归国,发病前曾在该国居住了1个月左右,10 月12日高热不退,在浙江大学医学院附属第一医院就诊,无法诊断,然后转至杭州市第六人民医院(传染病医院)就诊,主要临床表现为发热、头痛、肌痛伴淋巴结肿大。
从马尔代夫大使馆得知, 当时马尔代夫流行登革热。
10月12日采集患者第1份血清,10月17日采集第2份血清,带冰运送到实验室。
1.2 血清抗体测定登革热IgM和IgG抗体测定采用ELISA和间接免疫荧光试验(IFA),ELISA和IFA试剂分别购自广州市中山生物工程有限公司和中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所, 实验均按试剂盒说明书进行。
1.3 病毒分离采用C6/36和BHK-21细胞分离患者早期血清样本中登革病毒。
C6/36细胞株从广州市疾病预防控制中心获得,BHK-21细胞由本实验室液氮保存复苏。
病毒分离按常规方法进行〔1〕。
1.4 病毒RNA提取采用德国QIAGEN^司的RNeasy mini Kit, 按照试剂盒说明书进行,取血清标本或病毒分离阳性物200 ^1提取病毒RNA最终收集RNA提取液30卩I 。
1.5 病毒核酸检测和型别鉴定采用登革热型特异性荧光RT- PCF方法进行核酸检测和型别鉴定〔2〕,本实验室对荧光RT-PCR方法的特异性、敏感性和重复性均进行了验证。
引物和探针由上海博亚生物科技有限公司合成。
1.6 RT-PCR扩增E基因和NS1基因。
引物设计：参照GenBank登革2型病毒核苷酸序列设计引物。
E基因测序引物为:Den-2(E)F1:AAC ATG GAT GTC ATC AGA AGG; Den-2(E)R1:CCA ATC TTG TTA CTG AGC G扩增片段为1850 bp。
NS1 基因测序引物为:Den-2(NS1)F1:AGT GGG GTY TCA TGG ACT ATG; Den-2 (NS1) R1: TTA GGC TGC TAG TAG GGC AAG扩增片段为1440 bp。
引物由上海博亚生物科技有限公司合成。
RT-PCF采用Roche公司的Titan one tube RT- PCR Kit进行。
反应体系为50卩l,反应液组成：双蒸水19.5卩l、dNTPmix (10 mmol/L) 4 卩l、DTT (5 mnol/L)2.5 卩l、RNase inhibitor(5 U)1 卩l、上游和下游引物(20 卩mol/L)各1卩l、5X RT-PCR buffer 10 卩l、Emix 1 卩l、RNA S 取液10卩l。
反应条件为:50 C 40 min逆转录,94 C 2 min后,94 C 30 s、51C 30 s、68r 2 min,循环35 次，68 C延伸7 min,然后转入4C。
取RT-PCR 产物5卩l,用1.5%琼脂糖凝胶电泳，根据Marker位置确认反应产物。
1.7 DN/序列测定和分析采用PCR T增产物纯化后直接测序，委托上海博亚生物科技有限公司完成测序工作。
数据处理采用DNASTARMEGA等软件进行同源性和进化分析。
2 结果2.1 登革病毒抗体和核酸检测应用ELISA法和IFA分别检测疑似患者血清标本中登革病毒IgM和IgG抗体,结果第1份血清抗体均阴性，第2份血清中登革病毒IgM和IgG抗体均阳性(表1)。
IFA试验在荧光显微镜下可见明显的胞浆内黄绿色特异性荧光颗粒(图1)。
同时,用登革病毒型特异性荧光RT-PC肪法, 在第 1 份血清中检测到登革2型病毒核酸。
A. 疑似病人血清样本; B. 阴性对照图1疑似登革热患者血清标本IFA试验结果2.2 病毒分离用C6/36 和BHK-21 细胞对疑似患者第1 份血清标本进行登革病毒分离, 样本接种细胞后, 在第 1 代均出现细胞病变(CPE), 在C6/36 细胞上其特征为细胞膨大至融合，折光度增强，颗粒增多(图2);在BHK-21细胞上CPE出现较慢,至少在接种样本后 5 d 才能观察到局灶性病变,特征为细胞变小、变圆和聚集。
对C6/36细胞阳性分离物提取病毒RNA后采用登革病毒荧光RT-PCF方法鉴定,结果登革2型出现明显的“ S'型曲线峰图，登革1、3、4型、正常细胞对照和阴性对照均没有出峰, 型别鉴定为登革2型病毒。
2.3 核苷酸序列测定对C6/36细胞上分离的浙江省登革2型病毒分离株(ZJ/01/04)提取病毒RNA后,经RT-PCF扩增E基因和NS1基因，经测序获得E 基因全长1485 bp,NS1 基因全长1056 bp, 未发现有碱基的缺失和插入,2.4 进化树分析为了进一步分析浙江省登革2 型病毒分离株(ZJ/01/04) 与不同国家病毒分离株E基因和NS1基因的生物进化关系，采用邻位相连法构建进化树(图4,5)。
从图中可见，ZJ/01/04株E基因的氨基酸与Saudi/92株的同源性最高,亲缘关系最近，在进化树的同一分支上；NS1基因氨基酸进化树显示， ZJ/01/04 株与Fujian/10/99 株关系最近。
3 讨论浙江省输入性疑似登革热病例的主要临床表现为发热、头痛、肌痛、关节痛、皮疹伴淋巴结肿大。
对该病例采集不同发病日期的血清样本进行实验室检测,结果在第1份血清中检测到登革2型病毒核酸；在第2 份血清中检测到登革IgM 和IgG抗体；用C6/36和BHK-21细胞从第1份血清中均分离到登革2型病毒。
在血清学和病原学上均证实该输入病例是由登革2型病毒引起。
通过对这起输入病例的实验室检测,值得我们注意的是,对发病不同时期采集的样本,选择合适图 3 浙江省登革 2 型病毒分离株与国内外部分毒株 E 基因全长氨基酸序列比较蛋白系统进化树的检测方法是非常重要的。
发病早期的血清样本，IgM抗体阴性，且同时具有疑似疾病相应的临床症状和流行病史时,必须考虑用敏感特异的方法检测病毒核酸,这样可以达到早期诊断,并尽早对患者采取有效的隔离等控制措施,防止传染病2代病例的发生,甚至引起该地的局部流行。
登革病毒包膜蛋白E由E基因所编码，位于病毒毒粒表面〔3〕；构成毒粒的突起, 是主要结构蛋白, 决定着登革病毒的组织亲嗜性, 并介导病毒与细胞受体的结合〔4〕, 同时还是影响登革病毒毒力, 引起保护性免疫应答及免疫病理损伤的重要成分〔5,6〕,可诱导特异性的保护性中和抗体。
此外, N S 1蛋白含有群特异和型特异的抗原决定簇,在病毒分型上有重要意义,亦可刺激机体产生高滴度的保护性抗体。
因此,本研究对ZJ/01/04株进行E基因和NS1基因的核苷酸序列测定，并进行同源性和进化分析，结果显示浙江省登革2 型病毒分离株E基因和NS1基因与登革1、3、4型毒株E蛋白氨基酸的同源性分别为68.7%、66.9%和63.6%, 与登革2型国际标准株Jamaica 和Fujian/10/99 株的同源性分别为97.1 %和99.2%,而与Saudi/92 株的同源性最高,达99.6%。
ZJ/01/04株E蛋白和NS1蛋白均含有2个糖基化位点,与所比较的登革2型毒株糖基化位点相同。
目前所发现的登革病毒的毒力基因大多在E区。
据报道，登革2型病毒E蛋白相关毒力位点为E71(D)、E126(K)和E203(N)等〔7 9 :,浙江省的ZJ/01/04株E蛋白相关毒力位点分别为E71(A)、E126(E)和E203 (N), 这些位点与文献报道的有毒株不完全一致〔7 9〕, 其生物学意义有待进一步阐明。
此外，从E基因进化树显示，ZJ/01/04 株与Saudi/92株的亲缘关系最近，在进化树的同一分支上。
在NS1基因进化树上，ZJ/01/04株与Fujian/10/99 株具有很近的亲缘关系，由于GenBank中无近几年Saudi Arabia 登革2型株NS1 基因的登录,因此,无法与其比较。
从ZJ/01/04株E基因和NS1基因同源性和种系进化树分析显示, 该流行株最有可能来源于沙特阿拉伯。
登革病毒的传播在东南亚一带已有很久的历史,4 种血清型登革病毒引起的登革热疫情呈周期性暴发。
自20 世纪50 年代以来, 东南亚一带每年都有很多登革热和登革出血热的病例报告, 登革热疫情早已被证实在当地形成地方性流行〔10,11 〕。
目前, 在我国虽然尚未形成登革病毒的地方性流行区,但我国许多地区存在着适宜登革病毒生存和传播的条件, 也就是说存在着登革热由一种输入性传染病转变为地方性传染病的可能, 浙江省在2004年7- 10 月由从泰国输入病例引起该省登革热 1 型的局部流行就提示了这种可能性。
本次由马尔代夫输入的疑似登革热病例,由于报告及时和及时进行实验室确诊, 并采取有效的控制措施, 故未发生 2 代病例, 但由输入病例引起本地登革热局部流行的事件应引起我们的足够重视。