基因工程期末复习总结
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思考题第二章分子克隆工具酶1简述基因工程研究用的工具酶的类型和作用特点。
常用的工具酶硝基序列内部进庁切割DrU逵接癖DT⅛A 1 i HaSe将两条以上的纯性HA方子咸序喪傕化昭成磷酸二酣键逢接战一6盘傢DNAJSt 合BBl DNA PDIytoeraSe 1通⅛u≡ιg'掰遥一蝎如械昔≡κ⅛<⅛■补双链小心子上的单俺毅口，WP5* *^,D∖AΛ⅛-βfc i⅛÷ΦfX⅛.Γ*5⅛5*-3*外切a⅞渚性¾κ⅛⅛⅛e一J t'碳6⅛z⅛w子初»1多棱甘IHU⅛的I)NA Polynlerase k i πc∣isc F-DH半螭上r,<3ve rs e t. ran sc ri IH rise咲R∖A或DMt¾Λ⅛樓核合总互⅜b⅛∣DNA f⅛I)MAJK 却fr 移B⅜DhlA terminal DeOXyrLUC ICatidy transferase 44^LM4⅛⅛ 巴加到了进性双K或*ι⅛DNΛ⅛ 子⅛⅛3'- Oll 卓娴减IΛA⅛⅛Y-来姗减性辑酸酶BΛP Or ClP 核酸外⅛^b⅛III CXOnUCICaSe TrTF⅜j⅛⅞ħ⅛Slnucl p^ιse S I核酸酶RHl 31IiuulcastJ Ikil.31Taq DNA M⅛i⅛Iaq DNA p∩IynlCrrLSC核摘核瞋隔Rλcise脱氧4⅛4⅛⅛⅛aifi⅛DvISe去除［Γ⅛ KK九dNTF j⅛⅛5,⅞⅛ι⅛^≡lF^MIΛA3,-0HX⅛⅛的孩昔酸⅛也移解单链加A或R∖A,产生带亍璘酸的单械甘酸或專聚才茫昔百罠，祠时电可切害J J空t⅛棱酸分子的单1⅛ 护琳双ι⅛l)∖A, RKΛ⅛⅛5f及3'末端.高专—性单健核昔酸能在高温(72C ) -F⅛⅛⅛MDλA>⅛⅛板.从3'方向令咸新生的互补谜专一懺降解RMA内切械肢晦.4⅛M4tl⅛或双1⅛DNA2•说明限制性内切核酸酶命名原则(举例)ECORl属毛种类 株系 编号3. 限制内切核酸酶的星活性是指什么？在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列， 这个改变的特殊性称星星活性。
第3章 基因工程 期末复习知识点总结【新教材】人教版高中生物选择性必修三
第3章基因工程1、什么是基因工程：基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。
基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，又叫做DNA重组技术。
2、基因工程的诞生（三个理论和三个技术）：基因工程是在生物化学、分子生物学和微生物学等学科基础上发展起来的，正是这些学科的基础理论和相关技术的发展催生了基因工程，具体有三大理论发现和三个技术突破。
1)理论基础：DNA是遗传物质；DNA分子的双螺旋结构和半保留复制；遗传密码的通用性和遗传信息传递的方式；2)技术基础：限制性核酸内切酶的发现与DNA的切割；DNA连接酶的发现与DNA片段的连接；基因工程载体的构建与应用●理论上的三大发现⑴、发现了遗传物质——DNA1944年，艾弗里（O.T.Avery）的肺炎双球菌转化实验⑵、揭示了遗传物质的分子机制：DNA分子的双螺旋结构和半保留复制1953年，沃森（J.D.Watson）和克里克（F.Crick）的DNA双螺旋结构模型、半保留复制图，获1958年诺贝尔奖。
⑶、确立了遗传信息的传递方式：以密码形式传递1963年，美国尼伦伯格（M.W.Nirenberg）和马太（H.Matthaei）确立了遗传信息以密码形式传递，破译了编码氨基酸的遗传密码(3个核苷酸=1个密码子=1个aa)。
●技术上的三大突破⑴、世界上第一个重组DNA实验：实现不同来源DNA的体外重组1972年斯坦福大学化学家伯格（P.Berg）借助内切酶和连接酶将猴病毒SV40的DNA 和大肠杆菌λ噬菌体的DNA在试管中连接在了一起，第一次成功地实现了DNA的体外重组。
⑵、第一个基因克隆实验：重组DNA表达实验，是世界上第一个基因工程实验1973年美国斯坦福大学医学院遗传学家科恩（S.Cohen）将体外构建的含有四环素和卡那霉素抗性基因的重组质粒导入大肠杆菌，获得了具有双抗性的大肠杆菌转化子，成功完成了第一个基因克隆实验。
基因工程知识点总结
基因工程知识点总结基因工程是一门现代生物学领域的重要学科，它通过改造生物体的遗传物质，实现对生物体基因的精确操控和改良。
下面将对基因工程的相关知识点进行总结，以帮助读者更好地了解该领域的基本概念和技术应用。
一、基因工程的基本概念和原理基因工程是指通过人为手段修改生物体的基因组，以改变其性状和功能的技术。
其实现的基本原理包括基因定位、基因克隆和基因传递。
1. 基因定位：基因定位是指确定感兴趣的基因在基因组中的位置。
常用的方法有FISH（荧光原位杂交）和PCR（聚合酶链反应）等。
2. 基因克隆：基因克隆是指将感兴趣的基因从一个生物体中复制到另一个生物体中，使其在目标生物体中表达。
常用的方法有限制酶切、连接酶切和DNA合成等。
3. 基因传递：基因传递是指将经过克隆的基因导入到目标生物体中，并使其在目标生物体中稳定遗传。
常用的方法有基因枪、电穿孔和冷冻贮存等。
二、基因工程的应用领域基因工程技术在农业、医学和工业等领域有着广泛的应用，下面将分别介绍其主要应用领域。
1. 农业应用：基因工程技术在农业领域的应用主要包括转基因作物的培育和遗传改良。
通过导入特定基因，转基因作物可以获得抗病虫害、耐逆性或提高产量等特点，从而增加农作物的产量和质量。
2. 医学应用：基因工程技术在医学领域的应用主要包括基因诊断、基因治疗和生物药物的生产。
通过基因诊断，可以准确检测遗传病的基因突变，为疾病的早期预测和治疗提供依据。
基因治疗则通过修复或替代患者体内的异常基因，治疗遗传性疾病。
此外，基因工程技术还被用于生产重组蛋白和抗体等生物药物。
3. 工业应用：基因工程技术在工业领域的应用主要包括酶的生产和环境修复。
通过基因工程技术，可以大量生产具有特定功能的酶，用于工业生产和制药领域。
此外，基因工程技术还可以改造微生物，使其能够降解有机物污染物，用于环境修复和生物能源开发。
三、基因工程的伦理和安全问题尽管基因工程技术具有重要的应用前景，但也带来了一些伦理和安全问题。
基因工程期末复习整理
动物基因工程名词解释：1、体细胞克隆：以体细胞(包括动物成体体细胞、胎儿成纤维细胞等) 为受体，将目的基因以DNA 转染的方式导入能进展传代培养的动物体细胞，再以这些体细胞为核供体，进展动物克隆。
2、显微注射：：在显微操作仪下，将DNA用微吸管注射到处于原核时期受精卵的原核中，外源基因在受精卵繁殖过程过DNA复制而整合到基因组，然后将转化后的胚胎移植到受体子宫中继续发育，得到转基因动物。
3、ES细胞：4、基因打靶：是指外源DNA通过与受体细胞染色体DNA上的同源序列之间发生重组, 整合到预定位点, 从而改变细胞遗传特性的方法。
5、基因敲除：将一个结构但功能不祥的基因去除，从DNA水平上设计实验，彻底破坏该基因的功能或消除表达机制，从而推测该基因的生物学功能。
6、乳腺生物反响器：通过转基因技术将外源基因在动物乳腺中高效表达，在乳汁中生产目的产品。
问题：1、常用动物转基因的方法有哪些？比拟优缺点显微注射法、逆转录病毒法、胚胎干细胞法、基因打靶法、精子载体法体、细胞核移植法、磷酸钙共沉淀法。
其中，常用动物转基因的方法有显微注射法、逆转录病毒法、胚胎干细胞介导法。
〔1〕显微注射法的优点：操作技术性很强显微注射法的缺点：设备昂贵，胚胎死亡率高〔2〕逆转录病毒法的优点：操作简便，可大量感染细胞，形成单拷贝，转化率高逆转录病毒法的缺点：没有包装蛋白，不能形成完整的病毒颗粒2、谈谈如何获得转基因小鼠？显微注射法：书118页逆转录病毒法：书123页胚胎干细胞法：书123页3、转基因动物有哪些重要的应用？〔书138-143页〕〔1〕研究基因的结构与功能，了解动物生命现象的在本质〔2〕建立多种疾病的动物模型，研究发病机理与治疗方法〔3〕改善动物生产性能，提高动物育种效率〔4〕作为医用或食用蛋白的生物反响器，可以通过家畜乳腺分泌大量安全、高效、廉价的人体药用蛋白。
4、比拟在细菌、真核细胞和动物个体中表达外源基因的优缺点？动物：优点：目的基因在哺乳动物细胞中表达的蛋白与天然蛋白的结构、糖基化类型和方式几乎一样且能正确组装成多亚基蛋白，哺乳动物细胞能以悬浮培养或在无血清的培养基中达到高密度且培养体积能达到1000L 以上缺点：A、哺乳动物细胞的表达水平低B、高表达细胞株构建复杂C、细胞大规模培养工艺复杂D、哺乳动物细胞生产的蛋白质类药物的本钱较高第三章基因工程常规技术一、名词解释1．klenow fragment：DNA聚合酶被枯草杆菌蛋白酶水解后产生的大片段，具5’ → 3’聚合酶活性和3’ → 5’外切酶活性，是分子生物学中的重要工具。
基因工程要点总结
一、名词解释1、基因工程，是指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序，也称为分子克隆技术。
2、载体：是指携带目的基因进入宿主细胞进行扩增和表达的工具。
即指运载外源DNA有效的进入受体细胞内的工具。
3、LacZ’基因：编码b-半乳糖酶的a-肽链，即氨基末端。
4、多克隆位点区域片段：DNA载体序列上人工合成的一段序列，含有多个限制内切酶识别位点。
可以定向克隆防止载体自我连接。
5、溶菌周期：噬菌体吸附到寄主细胞表面之后，注入DNA，噬菌体的DNA进行复制及蛋白质的合成，并组装成噬菌体颗粒，最后使寄主细胞裂解，释放出子代噬菌体颗粒的过程6、杂交技术：将存在于凝胶中的生物大分子转移（印迹）于固定化介质上并加以检测分析的技术。
目前主要应用于DNA，RNA，蛋白质的检测。
7、生物芯片：将细胞、蛋白质、DNA及其他生物组分，通过微加工技术及微电子技术集中点在一个小的固体芯片表面，以实现对它们的准确、快速、大信息量检测分析。
8、蛋白质融合表达：是指外源基因与载体已有的担体蛋白的编码基因拼接在一起，并作为一个新的开放阅读框进行表达。
9、植物生物反应器是指通过基因工程途径，以常见的农作物作为“化学工厂”，通过大规模种植生产具有高经济附加值的医用蛋白、农业用酶、特殊碳水化合物、生物可降解塑料、脂类及其它一些次生代谢产物等生物制剂的方法。
10、基因治疗：经典的基因治疗：指正常的基因整合入细胞基因组以校正或置换致病基因的一种治疗方法。
广义的基因治疗：将某种遗传物质转移到患者细胞内，使其在体内发挥作用，以达到治疗疾病目的的方法。
10、转基因动物（transgenic animals．．．．．．．．．．．．．．．．．）：通过基因转移技术获得的整合有外源基因的动物个体。
二、填空题1、质粒的存在形式有超螺旋、开环双螺旋和线状双螺旋三种。
基因工程期末复习资料
一、基因工程的三大关键要素（元件）基因：目的基因（Vs用途,interesting/targetgene）、外源基因（Vs宿主,foreigngene）载体：能将外源基因带入受体细胞，并能维持的DNA分子。
受体：宿主，能摄取外源DNA、并能使其稳定维持的细胞（组织、器官或个体）二、基因工程的基本过程依据定义，基因工程的整个过程由工程菌(细胞)的设计构建和基因产物的生产两大部分组成，基本过程如下：(1)从供体细胞分离出基因组dna。
用限制性核酸内切酶分别将外源dNA(包括外源基因或目的基因)和载体分子切开(简称“切”)：(2)用dna连接酶将含有外源基因的DNA片段接到载体分子上，形成dna重组分子(简称“接”)。
(3)借助细胞转化手段将DNA重组分子导人受体细胞中(简称转”)。
(4)短时间培养转化细胞．以扩增dna重组分子或使其整合到受体细胞的基因组中(简称增”)。
（5）筛选和鉴定经转化处理的细胞。
获得外源基因高效稳定表达的基因工程菌或细胞（简称检）由此此可见．基因工程的上游操作过程可简化为；切、接、转、增、检：三、质粒载体pBR322系列有哪些特征？BR322质粒载体优点主要表现在以下几个方面：第一，具有较小的分子量。
pBR322质粒DNA分子为4363bp。
第二，具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的选择记号。
pBR322DNA分子内具有多个限制酶识别位点，外源DNA的插入某些位点会导致抗菌素抗性基因失活，利用质粒DNA编码的抗菌素抗性基因的插入失活效应（图4-15），可以有效的检测重组体质粒。
第三，具较高的拷贝数，通常有大约15个左右的拷贝，在氯霉素存在下，每个细胞中可累积1000～3000个拷贝。
这就为重组DNA的制备提供了极大的方便四、M13系列载体具有哪些优缺点?答：M13克隆系统具有很多优点：(1)克隆的片段大：M13噬菌体的DNA在包装时不受体积的限制，所以容载能力大。
有报道，有些噬菌体颗粒可以包装比野生型丝状噬菌体DNA长6～7倍的DNA(插入片段可达40kb)。
基因工程期末考试复习资料
1.1972年，美国Berg和Jackso等人将猿猴病毒SV40基因组DNA，λ噬菌体基因以及大肠杆菌半乳糖操纵子在体外重组获得成功。
1973年，美国斯坦福大学的Cohen和Boyer等人在体外构建出含有四环素和链霉素，两个抗性基因的重组质粒分子，将之导入大肠杆菌后，该重组质粒得以稳定复制，并赋予受体细胞相应的抗生素抗性，由此宣告了基因工程的成立。
2.基因工程的三大要素：供体、受体、载体。
3.基因工程操作的基本步骤：（1）切：从供体细胞中分离出基因组DNA，用限制性核酸内切酶分别将外源DNA（包括外源基因或目的基因）和载体分子切开。
（2）接：用DNA连接酶将含有外源基因的DNA片段接到载体分子上，构成DNA重组分子。
（3）转：借助于细胞转化手段将DNA重组分子导入受体细胞（4）增：短时间培养转化细胞，以扩增DNA重组分子或使其整合到受体细胞的基因组中（5）检：筛选和鉴定经转化处理的细胞，获得外源基因高效稳定表达的基因工程菌或细胞4.基因工程的主体战略思想是外源基因的稳定高效表达5.绝大多数分子克隆实验所使用的载体是DNA双键分子，其功能是：（1）为外源基因提供进入受体细胞的转移能力（2）为外源基因提供在受体细胞中的复制能力或整合能力（3）为外源基因提供在受体细胞中的扩增和表达能力6.野生型质粒具有下列基本特征：自助复制性，可扩增性，可转移性，不相容性7.人工构建的载体质粒根据其功能和用途可分为下列几类：（1）克隆质粒：用于克隆和扩增外源基因（2）测序质粒：高拷贝复制，并含有多酶切口的接头片段，便于各种DNA片段的克隆与扩增（3）整合质粒：含有整合酶编码基因以及整合特异性的位点序列，克隆在这种质粒上的外源基因进入受体细胞后，能准确地重组整合在受体染色体DNA的特定位点上（4）穿梭质粒：能在两种不同种属的受体细胞中复制及检测（5）探针质粒：用来筛选克隆基因的表达调控元件（6）表达质粒：使得克隆在合适位点上的任何外源基因均能在受体细胞中高效表达8.野生型质粒改造的指导思想是：（1）删除不必要的DNA区域（2）灭活某些质粒的编码基因，同时灭活那些对质粒复制产生负调控效应的基因，以提高质粒的拷贝数（3）加入易于识别的选择标记基因，便于检测含有重组质粒的受体细胞（4）在选择性标记基因内引入具有多种限制性内切酶识别及切割位点的DNA 序列，同时删除重复的酶切位点（5）根据外源基因克隆的不同要求，分别加装特殊的基因表达调控元件或用于表达产物亲和层析分离的标签编码序列9.λ噬菌体是大肠杆菌的温和型噬菌体，由外壳蛋白与一个48.5kb长的双链线状DNA分子组成。
基因工程复习总结
a.侵染菌应避免在液体培养基中连续继代培养
b.应用贮存于-70℃,重组phａge M1３感染细菌后铺板，再从噬菌斑中央部分挑取细菌后进行小规模培养
ｃ.培养时间应尽可能短(通常4-8h)
ｄ.收获噬菌体的培养液不能再做为原液继续培养(因在重组子和野生型噬菌体共培养中，野生型具有选择优势，几代培养后可消除重组子）。
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思考题
第二章分子克隆工具酶
1简述基因工程研究用的工具酶的类型和作用特点。
２.说明限制性内切核酸酶命名原则（举例)。
3.限制内切核酸酶的星活性是指什么?
在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列,这个改变的特殊性称星星活性。星星活性是限制性内切酶的一般性质,任何一种限制酶在极端非标准条件下都能切割非典型位点。
引起星星活性的因素:甘油浓度高（>５％）,酶过量（>1０0U/ｍl)，离子强度低(＜2５mmoｌ／Ｌ），pH值过高(>8.0），或是加了有机溶剂如DMSO（二甲基亚砜)、乙醇、乙二醇、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺,或是用其它2价阳离子如Mn2+、Cu2+、Co2＋或Zn2＋代替了Mｇ2+。
ＫｌｅｎｏｗＤNA聚合酶是从全酶中除去5′―3′外切活性的肽段后的大片段肽段，而聚合活性和3′―5′外切活性不受影响。也称为Klｅｎow片段（Kleｎowfｒgｍｅnｔ），或E．coliＤNＡ聚合酶Ⅰ大片段（E．ｃoｌiDＮＡpolymeｒａseⅠlarge fragmenｔ)。
它也可以通过基因工程得到，分子量为７６ｋDa。由于没有5′―3′外切活性,使用范围进一步扩大。
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一、单选1、第一个实现DNA重组的实验:1972年，美国斯坦福大学医学中心的P.Berg在世界上第一次成功地实现了DNA的体外重组。
2、第一次实现重组体转化成功的实验：1973年，科恩（Coher）和博耶（Boyer）建立的基因工程基本模式。
3、基因工程研究的主要内容：切接转增检。
4、基因工程研究的基本要素：基因、工具酶、载体、受体细胞。
5、DNA在生物体内的存在状态：染色体DNA、病毒DNA（噬菌体DNA）、质粒DNA、线粒体DNA和叶绿体DNA，有的以线型存在，有的以环状存在。
6、天然DNA提取的步骤：生物材料的准备、裂解细胞、分离抽提DNA。
7、DNA的分离抽提法：酚-氯仿抽提法（常用、经典）。
8、DNA的保存：温度越低越好，同等条件下，温度越低越不容易降解。
9、为了消除在制备RNA过程中RNA酶的污染，应用0.1% DEPC处理过的水配制试剂。
10、人工合成DNA片段的方法有化学合成法和聚合酶链式反应扩增法。
11、紫外分光光度法检测核酸样品的纯度（常用），纯净的核酸溶液的0D260/OD280值应为 1.7~2.0，0D260/OD230值应大于 2.0，如果0D260/OD280小于1.7，可能有蛋白质污染，如果0D260/OD280大于2.0或0D260/OD230小于2.0时，核酸溶液中可能存在其他干扰物质。
12、工具酶就其用途而言可分为三大类：限制性内切酶、连接酶和修饰酶。
13、14、通常提到的限制性核酸内切酶主要指Ⅱ类酶而言，限制性核酸内切酶的命名：属名+种名。
例如：B acillus am ylolique faciens H、H aemophilus in fluenzae dⅠ→Bam H、Hind15、限制性内切核酸酶的本质：细菌细胞的限制—修饰系统。
17、常用的酶切方法：单酶切、双酶切和部分酶切。
18、承载外源DNA的大小排序：质粒（<20kb）<噬菌体（20-30kb）<cosmid载体（40-50kb）<人工染色体载体（100-1000kb）。
19、受体细胞的种类:1）原核生物细胞例：大肠杆菌；枯草芽孢杆菌；蓝细菌；2）真核生物细胞包含酵母细胞、植物细胞、动物细胞。
19、常用于分子杂交的探针标记物可分为放射性及非放射性两大类，非放射性探针包括生物素标记探针、地高辛标记探针、荧光素标记探针。
20、根据待测核酸的来源以及将其分子结合到固相支持物上的方法的不同，核酸分子杂交检测法可分为菌落印迹原位杂交、斑点印迹杂交、Southern印迹杂交（DNA）和Nothern印迹杂交（RNA）四类。
（PS:如果只要检测克隆菌株、动植物细胞株或转基因个体、器官、组织提取的总DNA或RNA样品中是否含有目的基因，则可采用斑点印迹杂交(dot blotting)或狭线印迹杂交(slot blotting)进行检测。
菌落（或噬菌斑）原位杂交是直接把菌落或噬菌斑印迹转移到用于杂交的膜上，经溶菌和变性处理后使DNA暴露出来并与滤膜原位结合，再用DNA探针与其杂交。
）21、重组子筛选的方法：1）遗传表型直接筛选2）依赖于重组子结构特征分析筛选3）核酸分子杂交分析4）免疫化学分析检测5）PCR 筛选法。
22、重组基因导入受体细胞的方法：Ca2+（诱导大肠杆菌）转化法、电激穿孔、基因枪法、显微注射法、病毒转染法二、名词解释1、多克隆位点（MCS）：是包含多个（最多20个）限制性酶切位点的一段人工DNA序列。
2、衔接头：化学合成的寡核苷酸，含有一种以上的限制性核酸内切酶识别序列。
其一端或两端具有一种或两种内切酶切割产生的黏性末端。
3、限制性内切核酸酶：识别双链DNA中特定的核苷酸序列（识别序列），并在识别序列上使每条链的一个磷酸二酯键断开的一类酶，简称限制酶。
4、回文序列：DNA 片段上的一段所具有的反向互补序列，常是限制性酶切位点。
5、同裂酶：识别相同序列的限制性内切酶称为同裂酶。
它们的切割位点可能不同6、同尾酶：切割不同的DNA片段，但产生相同的粘性末端的一类限制性内切酶。
7、星性活性：在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，又称Star活性。
8、克隆载体：一种能携带外源DNA片段进入受体细胞，并在受体细胞中得以维持或表达的DNA分子。
9、（质粒的）不亲和性：在没有选择压力的情况下，两种亲源关系密切的不同质粒，不能够在同一个寄主细胞系中稳定地共存的现象。
10、显性质粒（表达型质粒）：指携带除与自身复制和转移相关的基因，还携带一些使宿主细胞呈现新性状基因的质粒。
11、隐蔽质粒：不能使宿主细胞呈现新性状的质粒。
12、基因组文库：指贮存了某种生物全部基因信息的一个受体菌群体。
13、cDNA 基因文库：某种生物材料的基因转录产物mRNA经反转录形成不同的cDNA片段，与克隆载体重组后贮存在受体菌群体中，这样的群体称为cDNA 基因文库。
14、受体细胞：又称为宿主细胞或寄主细胞等，从实验技术上讲，是能摄取外源DNA并使其稳定维持的细胞；从实验目的上讲，是有应用价值和理论研究价值的细胞。
15、感受态细胞：指处于能吸收周围环境中DNA分子的生理状态的细胞。
16、分子探针：指具有同特异性目标分子产生很强的相互作用并可对其相互作用的产物进行有效检测的DNA分子、RNA分子和蛋白质分子。
三、简答题1、简述聚合酶链式反应的基本原理、步骤和所需物质（反应物）。
原理：模仿细胞内发生的DNA半保留复制过程，在体外由酶催化合成特异性DNA片段。
步骤：1）变性:目的双链DNA片段在94℃下解链;2）退火:两种寡核苷酸引物在适当温度(50℃左右)下与模板上的目的序列通过氢键配对;3）延伸: DNA模板—引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。
物质：DNA Taq聚合酶、Buffer 、MgCl2 、dNTP 、上下游引物、模板DNA、ddH2O。
2、简述琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳的区别。
琼脂糖凝胶的凝胶孔径大,适合大分子DNA电泳和需要快速简单分析的DNA电泳,电泳方式一般采用水平潜水电泳.优点是快速简单,但分辨率不是很高,对于差异较小的DNA片段难以分辨.聚丙烯酰胺凝胶电泳适宜分离鉴定低分子量蛋白质、小于1Kb的DNA片段和DNA序列分析.其装载的样品量大,灵敏度高分离鉴定6bp~1kb个核苷酸的核酸片段用聚丙烯酰胺电泳,分离鉴定70bp~80kb的DNA片段可用琼脂糖凝胶电泳.3、怎样避免星性活性/引起星性活性的因素？星性活性：在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，又称Star活性。
控制反应条件，避免引起星性活性因素引起星性活性因素：高浓度限制酶高浓度的甘油低离子强度高PH用Mn2+取代Mg2+4、简述常用的DNA连接酶及其比较和原理。
常用的DNA连接酶有E. coli DNA连接酶和T4 DNA连接酶。
E. coli DNA连接酶催化片段互补黏性末端之间的连接，以NAD+作为辅助因子；T4 DNA连接酶不仅能催化片段互补黏性末端之间的连接，也能催化双链DNA平末端之间的连接，但连接平末端的效率较低，以ATP 作为辅助因子。
原理：借助ATP或NAD水解提供的能量催化DNA链5'-PO4与另一DNA链的3'-OH生成磷酸二酯键。
5、按构建克隆载体DNA的来源分类及按克隆载体的用途分类。
来源分类：①质粒载体②噬菌体载体③病毒载体④质粒与病毒或噬菌体DNA 组成的载体⑤质粒与染色体DNA片段组成的载体⑥其它克隆载体用途分类：①cDNA克隆载体②转录载体③表达载体④普通载体6、理想的克隆载体具备的基本条件（特性）。
①针对受体细胞的可转移性②自主复制功能③多种且单一的限制性内切酶切点④容易检测的筛选标记⑤载体的分子量适当⑥在细胞内稳定性高7、质粒克隆载体构建的基本策略。
1）能在受体细胞中进行有效的复制，并有较多的拷贝数。
含有能在受体细胞内有效复制的质粒复制起始位点。
2）含有外源DNA片段的克隆位点，且越多越好（可组装一个多克隆位点（MCS）连杆）。
3）含有选择标记基因——抗性基因，Lac Z’基因。
4）载体DNA分子尽可能小（转化率高），＞15kb，转化率降低。
5）根据需要组装各种“元件”，如启动子、终止子等。
8、简述基因组文库构建的基本步骤及基因组文库的大小的计算公式。
基本步骤①制备基因组DNA并片段化②DNA片段与载体重组连接③重组DNA导入受体菌细胞并扩增④筛选鉴定基因组文库计算公式：N=ln（1-P）/ ln（1-f）N 为所需的重组子的数目；f 为单个重组体中插入片段平均大小与基因组DNA总量之比；P 为选出某一基因的概率（通常期望为99%）。
（PS：基因组DNA总量=3*109）9、简述cDNA基因文库的构建步骤。
1)分离总RNA，并从中分离纯化出mRNA2)以mRNA为模版，合成cDNA第一链3)合成双链cDNA(将mRNA-DNA杂交分子转变为双链cDN分子)4)将双链cDNA与载体重组，导入大肠杆菌宿主细胞增殖10、基因组文库与cDNA文库的特点比较。
11、简述目的基因的基本分离制备方法。
1）直接分离法（包括限制性核酸内切酶酶切分离法、基因分离的物理化学法、“鸟枪法”）2）构建基因组文库分离法3）构建cDNA基因文库分离法4）聚合酶链式反应技术扩增目的基因5）基因的化学合成12、简述作为基因工程的宿主细胞必须具备的特性。
1）便于重组DNA分子的导入；2）能使重组DNA分子稳定存在于细胞中；3）便于重组体的筛选；4）遗传性稳定高，易于扩大培养或发酵生长；5）安全性高，无致病性，不会对外界环境造成生物污染；6）有利于外源基因蛋白表达产物在细胞内的积累，或促进外源基因的高效分泌表达。
7）在遗传密码的应用上无明显偏倚性；8）具有较好的翻译后加工机制，便于真核目的基因的高效表达；9）在理论研究和生产实践上有较高的应用价值。
13、基因工程的应用及安全伦理性。
医学，农业，国防，能源环境。
可正可反。
四、设计题转基因植物和动物的制备。
A.转基因小鼠的制备（显微注射法）：⑴准备假孕母鼠A：将可育雌鼠与输精管结扎后绝育的雄鼠交配，剌激雌鼠发生一系列妊娠变化，而得到假孕母鼠，作为受精卵转基因后的养母；⑵受精卵的准备：可育雌鼠注射促性腺激素（hcg）促使超排卵。
处理后与可育雄鼠交配。
次日从输卵管内收集受精卵备用；⑶基因导入：用显微注射装置将目的基因溶液导入受精卵雄性原核内；⑷胚胎移植：将已转入基因的受精卵植入假孕母鼠的输卵管内，使胚胎在养母体内发育成熟；⑸对幼鼠的鉴定：提取幼鼠DNA，与目的基因探针作分子杂交，鉴定外源基因是否整合B.转基因植物的制备（农杆菌转化法）：1.农杆菌制备：（1）用限制酶切下目的基因。