人类巴氏小体的制备及观察精品
实验五 人体细胞Barr氏小体的制备与观察
间期细胞核内侧靠近核膜处有约1微米大小的反光极强 的颗粒状亮点，即为巴氏小体。材料不同，观察结果 可能有不同，且必须和核仁区别开来（核仁往往离核 膜较远或接近核中央制备与观察
一、实验目的
掌握 X - 染色质鉴别方法，识别 X - 染色质的 形态特征及部位。
二、原理
巴氏小体，又叫巴尔体（Barr body），指雌性动物的体细胞在间期 时，在核膜内面的一块染色很深的染色质。巴氏小体实际上是浓缩 了的X染色体，其上的基因不转录。 哺乳动物的雌性细胞有两个X染色体，其中一条来自母方，另一条 来自父方，在胚胎发育的早期，这两个X染色体中的一条浓缩形成 巴氏小体，因此雌性哺乳动物的体细胞中都含有一个巴氏小体和一 个能转录的X染色体，而雄性哺乳动物的体细胞有一条可转录的X 染色体和一条Y染色体。随着细胞分裂，巴氏小体也要复制，但上 面的基因从不转录。如果这个动物是三倍体，体细胞中也只有一个 能转录的X染色体，其余的X染色体都会浓缩形成巴氏小体。 巴氏小体只有女性有，巴氏小体数=X染色体数-1。
三、材料
人口腔黏膜细胞
四、方法步骤——人体细胞Barr氏小体的制备与观察 用灭菌牙签刮取口腔黏膜细胞； 涂片与风干（涂抹一下，不要来回涂）； 染色及压片（滴卡宝品红压片）： 染色10min后，盖上盖玻片，一头蒸馏水冲 洗，另一头用滤纸吸干。
五、观察结果——Barr body
观察人不同形态的X-染色体，并绘图
试验八巴氏小体
雌性哺乳动 物的体细胞
雄性哺乳动 物的体细条X染色体为何失 活而凝缩成巴氏小体？
从X、Y染色体自身的特点来考虑……
理论解释
基因的剂量补偿效应【重点】
雌性xx两条染色体上基因 剂量有2份，失活1份，使x连 锁性状的表现在雌雄个体间无 差异。 在失活的x染色体上x染色 质并不缺失，其上的某些基因 如xg血型基因、类固醇硫酸酯 基因并不失活。
巴氏小体的研究历史
1949年 加拿大学者Barr在雌猫神经原细胞核 中发现。 1955年Barr在女性口腔细胞中发现Barr body。 1959年人们把性染色体异常造成的畸形与巴氏 小体的研究联系起来。 1971年Barr body被命名为x染色质。
最新研究进展
食管癌病人巴氏小体出现率低于10％； 正常人细胞出现率为20－45％。
巴氏小体的辨认标准：
选定的细胞，在高倍镜或油镜下进一步观察。 巴氏小体的形态表现为一结构致密浓染小体，轮 廓清楚，常附着于核膜边缘或靠近内侧。
七、作业：
1.分别观察50个男、女性可数的细胞，计算各 自的巴氏小体细胞所占的百分比。 2.在观察中画出 2～ 3个典型细胞，标明巴氏小体 的部位。
思考题：
两种方法的比较
直接涂片法操作简单，但口腔上皮细胞不易 分散，细胞常重叠，而且标本上涂大量细胞 才能满足计数的需要。 滴片法稍繁琐，离心收集细胞较难，但细胞 分散均匀，细胞经低渗后核膜膨胀，巴氏小 体增大，利于辨认。
细胞的理想状态：
⑴核质是网状或细颗粒状分布。
⑵核膜清晰，核无缺损。
⑶染色适度。 ⑷周围无杂菌。
Lyon假说【重点】
遗传学-巴氏小体观察
遗传学—人类性染色质体观察巴氏小体也被称为性染色质体或X染色质体。
在间期表现为浓缩致密的、深染的结构，在DNA复制期表现为晚复制。
女性细胞中观察到的频率为13～39％，正常男性0～2％。
研究发现巴氏小体的数目＝x染色体数-1Mary Lyon提出巴氏小体是通过异固缩形成异染色体而失活的X染色体，是达到雌雄两性X染色体上活性基因剂量平衡的一种补偿方式。
Lyon假说的要点：1. X染色体失活发生在胚胎发育的早期（受精后的16天左右，胚胎的细胞数达到5000～6000左右，植入子宫壁时），一旦失活，其上的大部分基因也失去表达活性；2. 每一体细胞中哪一条x染色体失活是随机的；3. X染色体的失活状态可以通过有丝分裂传递，即一旦某条X染色体失活，在其所有子细胞中都是同样一条X染色体失活。
修正：失活的X染色体上并非全部基因都呈莱昂化（失活）非莱昂化基因：③不完全的剂量补偿效应：。
31.生殖细胞中不发生X染色体失活。
2.失活的X染色体上有活性基因似乎是与失活基因相嵌存在。
1. 清洁口腔:细胞提供者需重复两三次用水漱口,以便去掉松动的上皮细胞和细菌。
用洁净的牙签在女性口腔颊部来回刮取粘膜细胞并涂在洁净干燥的载波片上。
涂片的范围与盖片大小相当。
静置10分钟晾干。
2. 滴加1 mol/L 的HCl水解10 min。
3. 从玻片反面用成45度角的流水冲洗。
晾干5-10 min。
4. 2％硫堇染色1-2 min。
5. 从玻片反面用成45度角的流水冲洗。
晾干。
6. 镜检，观察巴氏小体。
7. 若染色太深可用95％酒精成45度角流加在玻片正面染色区域脱色。
先在低倍镜下检出典型的可数细胞,其标准为:(1) 核质呈网状或细颗粒状分布;(2) 核膜清晰,核无缺损;(3) 染色适度;(4) 周围无杂物.选定细胞后再换高倍镜或油镜进一步观察.巴氏小体(直径大约为1μm) 具有典型的平凸的外形,其形态常表现为一结构致密的浓染小体, 轮廓清晰,常附着于核膜边缘或靠近内侧,其形状有三角形、球形、短棒状、卵形、微凸形等.。
实验八、巴氏小体
体细胞间期Barr是小体的检查
巴氏小体的临床意义有哪些？
临床意义在于： 1 胎儿性别鉴定：从胎儿羊水中取得脱落的细 胞检查，如有巴氏小体，胎儿为女性，如果 细胞中无巴氏小体，胎儿为男性。 2 成人性别鉴定：变性男运动员参加女子项目，可通 过检查其白细胞中有无巴氏小体而确定其性别。 3 性别畸形的判断：是否缺失或者多出巴氏小体。
一个巴氏小体 一条能转录的X染色体雌性哺乳动 物源自体细胞雄性哺乳动 物的体细胞
一条能转录的X染色体 一条能转录的Y染色体
雌性体细胞中1条X染色体为何失 活而凝缩成巴氏小体？
从X、Y染色体自身的特点来考虑……
理论解释
基因的剂量补偿效应【重点】
雌性xx两条染色体上基因 剂量有2份，失活1份，使x连 锁性状的表现在雌雄个体间无 差异。 在失活的x染色体上x染色 质并不缺失，其上的某些基因 如xg血型基因、类固醇硫酸酯 基因并不失活。
红色字体为注意事项！！！
2 固定：将涂片放入95％的乙醇中固定30 min，取出晾干。
3 水解：将涂片放入5 mol HCl中室温下水解10min，自来水缓缓冲 洗。
4 染色：用Gimsa染液染色8-10分钟，勿干燥，用水冲洗后晾干镜检。 5 镜检：从低倍镜到高倍镜依次观察。
漱 口
取 样 步 骤
刮取 涂布 晾干 固定
巴氏小体的辨认标准：
选定的细胞，在高倍镜或油镜下进一步观察。 巴氏小体的形态表现为一结构致密浓染小体，轮 廓清楚，常附着于核膜边缘或靠近内侧。
七、作业：
1.分别观察50个男、女性可数的细胞，计算各 自的巴氏小体细胞所占的百分比。 2.在观察中画出 2～ 3个典型细胞，标明巴氏小体 的部位。
思考题：
7巴氏小体
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XX
XY
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五 作业、思考题 1、绘制巴氏小体图片 2、掌握概念：巴氏小体、性染色质、X小体、
剂量补偿效应 3、巴氏小体一般位于核膜附近，为什么？ 4、请查阅相关文献指出巴氏小体研究的新进展。
4）多X个体的发现 无论有几个X，巴氏小体的数量是 N-1，也就是说只有一个X有活性。
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F/S型女人G-6PD的电泳检测
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5、研究进展
如在人类的X染色体上有大约1500万个碱基对。涉及 到几千个基因，究竟是如何调节表达的呢？进入90年代 以来取得了令人欢欣鼓舞的结果。
1）大多数X连锁的基因在胚胎发育早期的过程中表现为 稳定的失活，但是并非整条X染色体上的基因全部失活。 如xist基因，他的表达可以导致并维持它所在的染色体失 活。
XB和Xb随机失活，有活性的基因表现出相应的斑块，形 成黑黄相间的斑块。如为雄性，其基因型为XXY。
2）毛色镶嵌小鼠，黑白斑毛色镶嵌雌性小鼠 基因型为XBXb , B基因产生黑斑，b基因产生白斑。 XB和Xb随机失活，有活性的基因表现出相应的斑块，形 成黑白相间的斑块。
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毛 色 镶 嵌 小 鼠 的 成 因
生理盐水
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四 、实验步骤
（1） 取材用灭菌的牙签轻刮口腔上皮，（第一遍弃去 ，注意不要刮破上皮）涂3-4个玻片，晾干。（或刮取 发根毛囊置于载玻片上，晾干）。 （2） 加1N的盐酸水解10-15分钟。轻轻水洗，晾干。 （3） 硫瑾染色15-20分钟。 （4） 压片。 （5） 显微镜观察。巴氏小体靠近核膜边缘，染色较深 ，实际大小1-1.5μm，放大400x 后大约0.4-0.6mm 。
人类X染色质（巴氏小体）制备与观察
⼈类X染⾊质（巴⽒⼩体）制备与观察⼈类X染⾊质（巴⽒⼩体）的制备与观察摘要巴⽒⼩体是由雌性哺乳动物体细胞中失活的X染⾊体在间期细胞核中形成的呈异固缩状态，贴近于核膜边缘的染⾊⼩体，在遗传学、细胞观察⽅⾯有重要意义。
实验中作者取⼈⼝腔颊部上⽪细胞与发根⽑囊细胞进⾏硫瑾染⾊操作，通过显微观察对巴⽒⼩体进⾏识别与计数，描述巴⽒⼩体的形态，并统计其在不同性别⼈体细胞中的出现率。
引⾔在哺乳动物体细胞间期细胞核中，除⼀条X染⾊体外，其余的X染⾊体失活并呈异固缩状态，此即为巴⽒⼩体。
⼜称X⼩体、性染⾊质，直径约1µm，通常位于间期核膜边缘。
1949年，加拿⼤学者Barr在雌性猫的神经元细胞核中发现⼀种染⾊很深的⼩体，⽽在雄性猫中则极少出现[1]。
通常⼈类男性细胞核中很少或没有巴⽒⼩体，⽽⼥性有1个，性染⾊体异常的患者如XXY、XXYY、XXX、XXXY等，巴⽒⼩体的数量＝X染⾊体数量－1。
综合巴⽒⼩体与哺乳动物性染⾊体的剂量补偿效应，Lyon M．F 于1961年提出Lyon 假说，主要内容有：(1)正常的雌性哺乳动物两条X染⾊体只有⼀条在遗传上有活性，另外⼀条失活；(2)X染⾊体失活是随机的。
因此表达是随机的，结果在杂合⼦中会出现嵌合现象（mosaic）。
例外：有袋类失活的X染⾊体全部是⽗⽅的。
(3)失活发⽣在胚胎发育的早期，如⼈在受精后的16天（5000-6000个细胞时）。
⼀个细胞的⼀条染⾊体⼀旦失活，这个细胞的后代细胞中该染⾊体均失活。
Lyon假说虽然可以解释⼀些问题但不是全部，如⼈类中的44AXO型个体表现为Turner 综合症、44AXXY表现为Klinefelter综合症。
随着⽣物学和医学的发展⼈们已经认识到单条X染⾊体失活现象是普遍存在的，但失活的染⾊体上存在失活区和⾮失活的。
如⼈类中位于X染⾊体上的基因，G6PD（葡萄糖-6磷酸脱氢酶）、AHF（抗溶⾎第Ⅷ因⼦）等是⾮失活的，⽽Xg⾎型基因是失活的。
人类性染色质小体的制备和观察
箭头所示为巴氏小体（女性细胞[左]中存在，男性细胞[右]中没有）
六、注意事项
1．在实验中取材时应该注意安全； 2．如果用毛囊细胞进行试验，采样前应清 洗头发，因出油后拔漱口数次，用洁净牙签 从女性口腔两侧刮取粘膜，原位刮2～3次， 第1次舍去，第2，3次分别涂于干净载玻片 上。 固定：口腔粘膜细胞加入新配置的固定液 （95%乙醇:冰醋酸＝3:1），固定30min （固定液勿干）以上，空气干燥。
3）染色、制片 滴加染液，室温10min（勿干）； 在95%的酒精中分色1-3分钟； 在无水乙醇中继续分色两次，每次1分钟 用二甲苯透明两次，每次约3分钟； 加盖玻片，压片。
巴氏小体为女性细胞中所特有的染色体结构，是1条X染 色体呈异固缩状态所形成，各实验室所统计的观察率不尽 相同，从30％一50％不等，有些实验室中在男性的细胞 中发现X小体有2%的出现率，但小体结构不规范、典型。 巴氏小体常位于核膜内侧。直径为1μm左右，其形状有微 凸形、三角形、卵形、短棒形和双球形等。观察时需注意 巴氏小体与细胞的比例。 正常女性细胞中仅可观察到1个巴氏小体，而正常男性细 胞中无巴氏小体或仅在个别细胞中有不典型的巴氏小体存 在。
2）固定 口腔粘膜细胞加入新配置的固定液（95% 乙醇:冰醋酸＝3:1），固定30min以上，空 气干燥。
2）固定 毛囊细胞-拔取一根毛根比较大的毛发，在一张干 净的载玻片中央滴一滴45%的醋酸，静置约5分钟， 待毛根稍软后，用镊子尖把外层毛囊的组织细胞 轻轻刮下，弃去毛干。将细胞用解剖针在载玻片 上均匀摊平，并在空气中晾干。 实验改进意见：拿起上述发根的梢部，将其上毛 囊细胞轻轻蹭于另一干净载片上即可达到转移的 目的。（若用刀片或镊子将毛囊细胞刮下，可造 成细胞的堆积，同样会出现多层细胞的现象。1根 发根的毛囊细胞可以转移到3-4张载片上，以达到 充分利用实验材料的目的。观察时又可以看到清 晰的单层涂布细胞，便于观察统计。）
人类巴氏小体的观察
遗传学实验报告题目：人类巴氏小体的观察姓名：学号：班级：时间：一、实验目的：1.掌握人体性染色质的检测方法；2.观察人体性染色质的形态特征及存在部位，为进一步研究人体染色体的畸变与疾病提供参考条件；3.了解雌性哺乳动物X染色体失活假说和剂量补偿效应的机制。
二、实验原理：人类有23对染色体，其中22对为常染色体，另一对为性染色体。
女性为XX，男性为XY。
X与Y染色体有一部分是同源的，在减数分裂时可以相互配对，其余部分则不同源。
Y染色体含有很少的基因，而X染色体则含有大量的基因。
男性与女性的常染色体数目是一样的，所含有的基因数目也相等；但是女性含有两条X染色体，而男性一条X一条Y，因此女性性染色体所携带的基因剂量远高于男性，然而研究发现女性伴性遗传基因的表达剂量与男性是大体相同的，这是什么原因导致的呢？剂量补偿效应(dosage compensation effect)定义: 在XY性别决定机制的生物中，使性连锁基因在雌、雄性别中有相等或近乎相等的有效剂量的遗传效应。
也就是说，在雌性和雄性细胞里，由X染色体基因编码产生的酶或其它蛋白质产物在数量上相等或近乎相等。
剂量补偿存在两种情况，雌性哺乳动物一条X染色体异染色质化(失活)，只有一条X染色体具有活性，使雌雄动物虽然X染色体数目不同但基因产物的剂量是平衡的；另一种是X染色质的转录速率不同，如果蝇雌性细胞中两条X 染色体都有活性，但它们的转录速率低于雄性细胞X染色体的转录速率。
1949年M.L.Barr等研究发现雌猫神经元细胞核膜内有凝缩的深染小体，而雄性个体细胞中则没有，这一结构被称为巴氏小体(Barr body)。
进一步研究发现：所有哺乳类雌体细胞中都可以见到这一结构。
巴氏小体是由雌性哺乳动物体细胞中X染色质随机失活形成的，在间期细胞核中呈异固缩状态(染色质高度螺旋化),贴近于核膜边缘的染色小体。
莱昂假说(Lyon hypothesis)1961年,Mary Lyon 提出了阐明哺乳动物剂量补偿效应和形成巴氏小体的X染色体失活的假说。