分枝杆菌染色液
结核分枝杆菌、厌氧菌及其它微生物的检测
最终鉴定需要进行生化反应及终末代谢产物等检 查。
生化试验主要包括多种糖类发酵试验、吲哚试验 硝酸盐还原试验、触酶试验、卵磷脂酶试验、脂 酶试验、明胶液化试验、硫化氢试验等——厌氧 API条。
目前用于厌氧菌快速鉴定还有自动微生物鉴定系 统等。
实验内容
1、记录抗酸染色步骤。 2、油镜下观察抗酸杆菌涂片，并记
厌氧菌的分离与鉴定
（三）标本接种
标本接种3个血琼脂平板，分别置于有氧、 无氧和含5-10%CO2的环境中培养。若只 要求检测厌氧菌，只需接种1个厌氧血琼 脂平板。
厌氧菌的分离与鉴定
（四）耐氧试验
当厌氧血平板上有细菌生长时，为了确 定是否为厌氧菌，必须做耐氧试验。挑 取菌落分别转种2块需氧血琼脂平板和1 块厌氧血琼脂平板，然后将平板分别放 置在需氧、厌氧和CO2环境中培养。
荧光染色结果报告
—：观察70个视野未发现抗酸杆菌； ±：70个视野内发现1-2条抗酸杆菌； 1+：50个视野内发现2-18条抗酸杆菌； 2+：10个视野内发现4-36条抗酸杆菌； 3+：每个视野内发现4-36条抗酸杆菌； 4+：每个视野内发现36条以上抗酸杆菌。
厌氧菌的分离与鉴定
厌氧菌标本的采集 涂片与染色 标本接种 耐氧试验 鉴定试验
干后油镜下观察结果。
抗酸染色结果观察
油镜下观察涂片，在淡蓝色背景下可见染成红 色细长或分枝状杆菌，此为抗酸染色阳性细菌 。
抗酸染色结果报告
—：观察300个视野未发现抗酸杆菌； ±：300个视野内发现1-2条抗酸杆菌； 1+：100个视野内发现1-9条抗酸杆菌； 2+：10个视野内发现1-9条抗酸杆菌； 3+：每个视野内发现1-9条抗酸杆菌； 4+：每个视野内发现9条以上抗酸杆菌。
抗酸染色液(Ziehl-Neelsen热染法)
抗酸染色液(Ziehl-Neelsen 热染法)简介：分枝杆菌的细胞壁内含有大量脂质包围在肽聚糖的外面, 所以分枝杆菌一般不易着色。
分枝杆菌中的分枝菌酸与染料一旦结合后，就很难被酸性脱色液脱色，故名抗酸染色。
传统的染色方法要经过加热和延长染色时间来促使其着色，其中最具代表性的是结核杆菌Ziehl －Neelsen 染色法，该法是WHO 和中国结核病防治规划中推荐的热染方法。
Leagene 抗酸染色液(Ziehl －Neelsen 热染法)属于热染色液，其染色原理是在加热条件下，分枝菌酸与复红结合成复合物，经亚甲蓝复染后，分枝杆菌仍然为红色，而其他细菌及背景中的物质为蓝色。
该试剂盒更适用于冷染法效果不佳的情况。
组成：自备材料：1、 接种环2、 载玻片3、 蒸馏水4、 显微镜操作步骤(仅供参考)：1、 接种环挑取待检样本，涂布于载玻片上，涂片加热固定。
2、 滴加Ziehl －Neelsen 复红染色液，用火焰微热至出现蒸汽，一般该染色过程至少(必要时应补加染液、以防止染液蒸发)。
3、 蒸馏水冲洗。
4、 用Ziehl －Neelsen 脱色液脱色至无红色为止，即可。
5、 蒸馏水冲洗。
6、 用亚甲蓝染色液染色7、 蒸馏水冲洗。
8、 轻轻吸干水分，自然干燥。
9、 油镜镜检。
编号 名称DM0034 3×50mlDM0034 3×100mlStorage试剂(A): Ziehl －Neelsen 复红染色液 50ml 100ml RT 避光 试剂(B): Ziehl －Neelsen 脱色液 50ml 100ml RT 试剂(C): 亚甲蓝染色液 50ml100ml RT 避光使用说明书1份染色结果：抗酸菌红色背景及非抗酸菌蓝色注意事项：1、每次使用后盖紧试剂瓶，以防试剂挥发和污染。
2、上述试剂均对人体有刺激性，请注意适当防护。
3、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
有效期：12个月有效。
抗酸染色——标准操作
抗酸染色一、原理本试剂盒采用WHO推荐的Ziehl-Neelsen法分枝杆菌的细胞壁内含有大量的脂质，包围在肽聚糖的外面，所以分枝杆菌一般不易着色，要经过加热和延长染色时间来促使其着色。
但分枝杆菌中的分枝菌酸与染料结合后，就很难被酸性脱色剂脱色。
齐-尼氏抗酸染色法是在加热条件下使分枝菌酸与石炭酸复红牢固结合成复合物，用盐酸酒精处理也不脱色。
当再加碱性美兰复染后，分枝杆菌仍然为红色，而其他细菌及背景中的物质为蓝色。
二、试剂石碳酸复红染液、酸性酒精溶液、亚甲蓝溶液三、方法1.涂片：参见各标本操作程序涂片，涂片后在室温下自然干燥，也可在酒精灯上略加温，使之迅速干燥，但勿靠近火焰2.固定：常用高温进行固定。
即手持载玻片一端，标本面朝上，在灯的火焰外侧快速来回移动3~4次，共约3~4秒。
要求玻片温度不超过60℃，以玻片背面触及手背皮肤不觉过烫为宜，放置待冷后染色3.染色3.1 滴加石碳酸复红染液盖满玻片，染色10分钟或更久，无需加温3.2 流水自玻片一端轻缓冲洗，冲去染色液，沥去标本上剩余的水3.3 滴加酸性酒精溶液盖满玻片，脱色1-2分钟，如有必要，需流水冲去溶液后，再次脱色至痰膜无可视红色为止3.4 流水自玻片一端轻缓冲洗，冲去染色液，沥去标本上剩余的水3.5 滴加亚甲蓝溶液，染色30秒钟3.6 流水自玻片一端轻缓冲洗，冲去染色液，沥去标本上剩余的水，待玻片干燥后镜检3.7 一张染色合格的玻片，痰膜肉眼观察为亮蓝色，无红色斑块四、结果判定1.干燥后油镜观察300个视野（观察时间不少于4min），抗酸性细菌呈红色，其它细菌或细胞呈蓝色2. 报告方式2.1 未找到抗酸杆菌2.2 找到抗酸杆菌±：可疑，发现抗酸杆菌1-2条/300视野2.3 找到抗酸杆菌1+：发现抗酸杆菌3-9条/100视野2.4 找到抗酸杆菌2+：发现抗酸杆菌1-9条/10视野2.5 找到抗酸杆菌3+:发现抗酸杆菌1-9条/1视野2.6 找到抗酸杆菌4+：发现抗酸杆菌≥10条/1视野五、注意事项1.每一玻片只能涂一份标本，以防脱落混淆2. 脱色时间需根据涂片厚薄而定，厚片可适当延长，以无红色脱出为止3. 冬季室温过低时，染色时间要适当延长4. 有时同一个抗菌体上红色深浅也有不同，观察时应注意5. 每次试剂用完后，请迅速盖好，以免挥发，储存时应避免高、低温及阳光照射6. 在涂抹痰标本时，严禁对玻片加热7. 染色时勿使玻片上的染液干燥六、临床意义分支杆菌属（结核分支杆菌、麻风分枝杆菌、非典型分支杆菌）、放线菌抗酸染色阳性，可初步鉴定细菌。
结核分枝杆菌实验报告
一、实验目的1. 了解结核分枝杆菌的生物学特性及致病机理；2. 掌握结核分枝杆菌的培养、分离、鉴定及检测方法；3. 增强实验室操作技能，提高对结核病的防控能力。
二、实验原理结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）是一种革兰氏阳性细菌，是引起结核病的病原体。
本实验通过培养、分离、鉴定及检测结核分枝杆菌，了解其生物学特性及致病机理。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：（1）结核分枝杆菌菌种；（2）牛肉浸液；（3）鸡蛋；（4）石炭酸复红染液；（5）无菌生理盐水；（6）无菌试管；（7）酒精灯；（8）高压蒸汽灭菌器；（9）显微镜；（10）生物安全柜。
2. 实验仪器：（1）恒温培养箱；（2）电热恒温水浴锅；（3）无菌操作台；（4）超净工作台；（5）显微镜。
四、实验方法与步骤1. 菌种复苏（1）将冷冻保存的结核分枝杆菌菌种复苏于牛肉浸液中，37℃恒温培养24小时；（2）观察菌落生长情况，记录结果。
2. 分离纯化（1）将复苏后的菌液涂布于牛肉浸液琼脂平板上，37℃恒温培养24小时；（2）挑取单菌落进行纯化，重复涂布、培养，直至获得纯化菌落。
3. 鉴定（1）挑取纯化菌落，用无菌生理盐水洗涤，制成菌悬液；（2）将菌悬液滴加于石炭酸复红染液中，37℃恒温染色30分钟；（3）用无菌生理盐水冲洗，观察菌体形态及染色特性；（4）挑取染色阳性菌落，进行生化试验，如氧化酶试验、触酶试验等，以鉴定结核分枝杆菌。
4. 检测（1）挑取纯化菌落，制成菌悬液；（2）将菌悬液滴加于含有药物的琼脂平板上，37℃恒温培养24小时；（3）观察药物对菌落的抑制作用，判断药物对结核分枝杆菌的敏感性。
五、实验结果与分析1. 菌种复苏：复苏后的菌落呈白色，表面光滑，呈干燥状，有明显的溶血现象。
2. 分离纯化：纯化后的菌落呈白色，表面光滑，呈干燥状，有明显的溶血现象。
3. 鉴定：挑取染色阳性菌落，进行生化试验，结果显示氧化酶试验、触酶试验均为阳性，符合结核分枝杆菌的生物学特性。
结核分枝杆菌的抗酸染色原理
结核分枝杆菌的抗酸染色原理一、简介结核分枝杆菌是引起结核病的主要病原体，对其进行准确快速的检测具有重要意义。
抗酸染色是一种常用的方法，能够直接观察到结核分枝杆菌的存在和形态特征。
二、抗酸染色的原理抗酸染色是通过特殊的染色方法，使结核分枝杆菌在显微镜下呈现红色或紫色，而其他非酸酸杆菌则呈现蓝色。
2.1 理论基础结核分枝杆菌具有特殊的细胞壁结构，其细胞壁主要由脂质和脂酸构成，其中包含大量的酚类脂质，这种脂质能够抵抗常规染色方法中的酸性染料。
2.2 染色原理抗酸染色采用的是富尔曼-韦尔染色法，主要包括以下几个步骤：1.制备菌液：从患者的痰液或其他病变部位采集样本，制备结核分枝杆菌的菌液。
2.固定：将菌液涂在玻璃片上，用火焰烘烤使其固定。
3.酸性染料染色：将固定的菌液涂上红色的酸性染料，如碱性红或苏木精。
4.脱色：用酸醇溶液洗去多余的染料。
5.革兰染色：用紫色的革兰染料染色。
6.脱色：用醇洗去多余的染料。
7.固定：用盐酸醇固定染色。
8.洗净：用水洗净玻璃片。
9.干燥：让玻璃片自然干燥。
10.镜检：将染色好的玻璃片放在显微镜下观察，结核分枝杆菌呈现出红色或紫色。
三、抗酸染色的应用抗酸染色广泛应用于结核病的诊断和治疗过程中。
3.1 诊断结核病通过抗酸染色，医生可以直接观察到患者样本中是否存在结核分枝杆菌，从而判断是否患上结核病。
3.2 监测结核治疗效果在治疗结核病的过程中，通过定期进行抗酸染色检测，可以评估患者的结核菌负荷，判断治疗是否有效。
3.3 检测结核菌耐药性结核分枝杆菌的耐药性是结核病治疗的重要指标之一。
抗酸染色方法可以辅助判断结核菌对抗结核药物的敏感性，从而指导药物的选择和调整。
四、抗酸染色的优缺点抗酸染色方法虽然在结核病的检测中具有一定的优势，但也存在一些局限性。
4.1 优点•简单快速：整个染色过程只需几分钟，可以在短时间内完成。
•直观可靠：直接观察到红色或紫色的结核分枝杆菌，确保结果准确可靠。
抗酸染色液说明
抗酸染色液说明【产品名称】通用名称：抗酸染色液【包装规格】100ml*2/盒、250ml*2/盒、500ml*2/盒【预期用途】抗酸染色液用于分枝杆菌、诺卡菌等细菌抗酸染色，包括荧光染色。
【检验原理】结核菌、麻疯杆菌等抗酸性菌，因其菌体表面有一层类脂或脂质之皮膜而不易着色，但一经着色后，酸性酒精的作用亦是不容易把它脱色。
利用此特性并以增强的染色液予以染色，然后再以酸性酒精加以处理，使其脱色后再对比染色，此时抗酸性菌仍是固定着最初色素的颜色(红色)，也就易于鉴别。
【主要组成成份】试剂组成：抗酸染色液包括石碳酸复红染色液、亚甲基蓝染色液。
【贮存条件及有效期】有效期：未开封试剂有效期为24个月。
贮存条件：本试剂应贮存于相对湿度不大于80%，无腐蚀性气体和通风良好的5~30℃室温环境。
【样本要求】待检标本应为菌株或有菌株的标本。
【检验方法】涂片经固定水洗后或石蜡切片脱蜡水洗后：1、将石碳酸复红染色液滴加于切片上，然后在微火加热至有蒸汽出现，水洗；2、用0.5%盐酸酒精分化至无红色染料脱落，水洗；3、亚甲基蓝染色液作对比染色20～60秒，水洗；4、酒精脱水，二甲苯透明、中性胶封固、镜检。
【检验结果的解释】抗酸杆菌呈红色，其他组织呈浅蓝色。
【检验方法的局限性】有些细菌有染色嗜变性，不一定完全是染色原因，应根据菌体形态加以确定。
【注意事项】1.该该染色液仅用于体外诊断。
2.涂片厚薄要均匀，自然干燥后再加热固定。
3.试剂贮存时，尽量避免高温及光亮环境，以免影响品质和效果。
标示有效期过后，请不要使用。
4.本品应由专业人士使用及进行结果的判断。
5.所用标本应视为具有传染性物质。
结核分枝杆菌的微生物学诊断方法
结核分枝杆菌的微生物学诊断方法
1.痰液涂片染色：这是最常用的方法之一、将痰液制备成涂片，进行
酸性染色，如抗酸杆菌染色和耐酸染色。
结核分枝杆菌是抗酸杆菌，其细
胞壁富含脂质，可以抵抗酸性染料的脱色作用。
这种方法可以快速检测出
结核分枝杆菌的存在。
2.结核分枝杆菌的培养：这是鉴定结核分枝杆菌的“金标准”。
痰样
品通常会涂在含有富含营养物质的培养基上，并在适当的温度和湿度条件
下孵育。
结核分枝杆菌需要一个相对较长的孵育时间（通常需要数周）才
能生长和生成可见的菌落。
分枝杆菌的培养是确诊结核病的关键步骤，同
时还可以进行对特定抗结核药物的药敏试验。
3.伊红染色：这种方法旨在鉴定酸酒杆菌属分枝杆菌和其他酸杆菌的
超微结构。
伊红染色可使细胞壁和细胞内储存的色素显现为红色或粉红色。
该方法可以帮助确定分枝杆菌的类属。
4.PCR检测：聚合酶链反应（PCR）能够通过扩增目标基因片段来检
测和诊断结核分枝杆菌。
这种方法具有高度特异性和灵敏度，并可以通过
荧光标记的探针来定量检测。
5.蛋白质组学：蛋白质组学技术通过检测和分析结核分枝杆菌内部蛋
白质的组成和变化，可以为诊断和治疗提供信息。
质谱法是一种常用的蛋
白质组学技术，可以通过检测菌落样品中的特定蛋白质来鉴定结核分枝杆菌。
总的来说，微生物学诊断方法在结核分枝杆菌检测和鉴定中起着至关
重要的作用。
这些方法可以帮助医生确定结核病的诊断和治疗方案，并对
结核分枝杆菌的流行病学研究和控制提供重要的科学依据。
分枝杆菌罗氏培养操作
分枝杆菌罗氏培养操作材料仪器:Ⅱ级生物安全柜、37℃培养箱、涡旋震荡器、低速离心机、接种环加热灭菌器、一次性吸管、0.1ml接种环、容积为30ml的螺旋盖前处理管试剂：前处理液:4%NaOH溶液：取4克氢氧化钠加入80ml 蒸馏水中，完全溶解后补充蒸馏水至终体积100ml。
操作步骤6.1 标本前处理：在生物安全柜中进行操作。
6.1.1 碱处理----碱处理时间不能超过20min。
痰：一次性吸管取标本2ml，置于前处理管中，加入2～4ml 的4%NaOH溶液，室温15min，其间在震荡器上振荡，促标本匀化。
6.2 接种：采用碱处理的标本，应接种酸性罗氏培养基。
取前处理后的标本0.1ml，无菌操作，用接种环接种于罗氏培养基斜面上，每份痰标本接种两支培养基，接种毕，放37℃培养箱内培养。
6.3 培养过程观察接种后第3天、第7天观察，此后，每周观察一次菌落生长情况，直至满8周。
6.4 结果与报告接种后应按时观察细菌生长情况，阳性生长经涂片抗酸染色验证后，及时记录初生长日期，并发培养阳性报告（如菌量少，继续放置培养箱孵育生长）。
培养至8周未见细菌生长，报告培养阴性。
6.4.1 培养结果按下列标准报告：培养8周未见菌落生长，报告培养阴性(一)。
菌落生长不及斜面面积1/4时，报告实际菌落数菌落占斜面面积 1/4 报告培养阳性(1+)菌落占斜面面积1/2 报告培养阳性（2+)菌落占斜面面积3/4 报告培养阳性(3+)菌落布满培养基斜面报告培养阳性(4+)6.4.2 培养基污染情况报告如发现培养基污染，则报告污染菌生长，污染率高于5％时，提示培养基制备中灭菌处理不佳或消化液处理不良，应认真检查操作程序。
污染菌程度按下列标准报告：污染菌生长占培养基斜面1/4以下者，报告(C1＋)。
污染菌生长占培养基斜面1/2以下者，报告(C2＋)。
污染菌生长占培养基斜面3/4以下者，报告(C3＋)。
污染菌生长占培养基全斜面者，报告(C4＋)。
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抗酸染色液说明书
【产品名称】
抗酸染色液
【包装规格】
货号：DM0035
单瓶包装规格分别为：20ml、100ml、250ml、500ml、5000ml；
每套/盒包装规格分别为： 3×20ml/盒、3×100ml/盒、3×250ml/盒、3×500ml/盒。
【预期用途】
用于分枝杆菌、诺卡菌等抗酸性菌的涂片染色。
【检验原理】
本染色方法系在参照世界卫生组织(WHO)所推荐的标准Ziehl-Neelsen法进行改良的，主要用于对结核杆菌等抗酸性菌的化学染色，抗酸染色有两种常用方法：①碱性复红法又称萋-尼氏(Ziehl-Neelsen)法；
②荧光染料金胺O法(也称金胺罗丹明法)。
本染色液采用的是改良碱性复红法，可以不用加温，属于Kinyoun 冷染色法，无需加热，相对较抗酸热染液安全，其染色原理是在室温条件下分枝菌酸与复红结合成复合物，经亚甲蓝复染后分枝杆菌仍然为红色，而其他细菌及背景中的物质为蓝色。
结核菌、麻疯杆菌等抗酸性菌，因其菌体表面有一层类脂或脂质之皮膜而不易着色，但一经着色后经酸性乙醇的作用亦是不容易把它脱色，利用此特性并以增强的染色液予染色，然后再以酸性乙醇加以处理，使其脱色后再对比染色，此时抗酸性菌仍是固定着最初色素的颜色(红色),也就易于鉴别。
【主要组成成分】
试剂组成主要成分
1、石碳酸复红染色液苯酚、品红
2、酸性乙醇脱色液盐酸、乙醇
3、亚甲蓝染色液亚甲蓝
【储存条件及有效期】
5℃～35℃环境保存，原包装未开封染色液的有效期为24个月，在有效期内的已开封染色液应在开封后6个月内使用完，每次用后应及时拧紧瓶盖，以免挥发或变质。
【样本要求】
挑取痰标本中干酪样、脓样或可疑部份，于玻片正面均匀涂抹卵圆形痰膜，自然干燥，染色前加热固定。
【检验方法】
1、挑取待检样本，涂布于载玻片上，自然干燥或火焰固定；
2、滴加石碳酸复红染色液盖满玻片，染色；
3、无需加热，流水自玻片一端轻缓冲洗，冲去染色液，沥去标本上剩余的水；
4、自玻片边缘滴加酸性乙醇脱色液盖满玻片，脱色，如有必要，需流水洗去酸性乙醇脱色液，再次脱色至无红色为止；
5、流水自玻片一端轻缓冲洗，沥去玻片上剩余的水；
6、滴加亚甲蓝染色液，染色，流水自玻片一端轻轻冲洗，沥去玻片上剩余的水，待玻片干燥后镜检(一张染色合格的玻片，痰膜肉眼观察为亮蓝色，无红色斑块)。
【检验方法的局限性】
仅限用于抗酸性菌的染色。
【注意事项】
1、用油镜观察时，禁止使用香柏油，必须使用显微镜专用的镜油(Immersion oil)。
2、酸性乙醇脱色液不够用时，可自制5%盐酸乙醇溶液替代。
3、冬季室温过低时，染色时间要适当延长。
4、本产品仅用于体外诊断，应由专业人士使用及进行结果的判读。
5、使用前应详细阅读说明书，并做好个人卫生防护，在有效期内使用，生产日期、生产批号和失效日期见包装。
6、用后应按医院或环保部门要求处置废弃物。
【基本信息】
备案人/生产企业名称：安徽雷根生物技术有限公司
住所：淮北凤凰山经济开发区凤冠路三期标准化厂房三号厂房。