实验六 聚合酶链式反应
生化试验教材实验九：聚合酶链式反应
避免使用过期的试剂和仪器，以免影 响实验结果和造成安全隐患。
对于高温、高压、易燃、易爆、有毒 有害等危险品，应严格按照规定进行 管理和操作。
实验操作规范
01
在实验前应仔细阅读实 验步骤和注意事项，确 保对实验过程有充分的四种脱氧核苷酸， 即dATP、dCTP、dGTP和dTTP。
Taq DNA聚合酶
一种热稳定性的DNA聚合酶，负责 催化DNA的合成。
实验设备准备
01
02
03
04
PCR仪
提供PCR反应所需的温度循环 ，包括变性、退火、延伸等步 骤的温度设置和时间控制。
离心机
用于分离和纯化DNA、RNA 等生物分子。
结果验证与结论
结果验证
通过重复实验、使用不同引物或对 PCR产物进行测序等方法，验证结果 的可靠性和准确性。
得出结论
根据实验结果，可以得出关于基因表 达、变异或物种鉴定的结论。同时， 应注意结果的适用范围和局限性，以 及与文献报道的比较。
05 注意事项与安全
实验安全注意事项
实验前应穿戴实验服和防护眼镜，确 保个人防护措施到位。
移液器
精确移取和混合各种试剂。
显微镜
观察细胞和组织样本，以及 PCR扩增产物的大小和形态。
实验试剂准备
01
02
03
Buffer
一种化学试剂，用于维持 溶液的酸碱度和离子浓度， 以稳定酶的活性和促进酶 促反应的进行。
MgCl2
提供PCR反应所需的镁离 子，镁离子是Taq DNA聚 合酶的激活剂。
去离子水
环境和人体造成危害。
聚合酶链式反应pcr实验报告 -回复
聚合酶链式反应pcr实验报告-回复聚合酶链式反应(PCR)实验报告引言：PCR，全称为聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)，是一种用于迅速扩增DNA序列的技术，由凯里穆利斯于1983年首次提出，并于1985年由Mullis和Faloona首次报道。
PCR具有高灵敏度、高特异性、高效率等优点，广泛应用于基因组学、医学诊断、法医学鉴定、分子进化等领域。
实验目的：本实验旨在通过PCR技术，对DNA序列进行扩增，并测试PCR反应的影响因素，如模板DNA浓度、引物浓度、反应体系中酶和核苷酸的用量等，以优化PCR反应条件。
实验材料和方法：1.实验材料：1.1 模板DNA：提供两个已知DNA序列的模板，标记为M1和M2。
1.2 引物：两对特异性引物，标记为F1/R1和F2/R2。
1.3 PCR试剂盒：包括酶、缓冲液、dNTPs等。
1.4 ddH2O：去离子水。
1.5 1.5琼脂糖凝胶：用于电泳分析。
2.实验操作：2.1 PCR反应体系的配制：- M1反应：加入4μL M1模板DNA、1μL F1引物（10μM）、1μL R1引物（10μM）、12.5μL PCR Master Mix和6.5μL ddH2O，总体积为25μL。
- M2反应：加入4μL M2模板DNA、1μL F2引物（10μM）、1μL R2引物（10μM）、12.5μL PCR Master Mix和6.5μL ddH2O，总体积为25μL。
2.2 PCR反应条件设置：- 初始变性：94，4分钟。
- 变性：94，30秒。
- 结合：56，30秒。
- 延伸：72，1分钟。
- 延伸终止：72，7分钟。
- 等待：4。
2.3 PCR扩增：连续重复步骤2.2中的变性、结合和延伸步骤30次。
2.4 电泳分析：将PCR产物与DNA量标Marker混合，用1.5琼脂糖凝胶电泳分析。
实验结果：1. PCR扩增结果：在实验过程中，通过PCR成功扩增了M1和M2的DNA序列。
聚合酶链式反应鉴定断裂基因实验报告
聚合酶链式反应鉴定断裂基因实验报告一、实验介绍聚合酶链式反应（PCR）是一种常用的分子生物学技术，能够在体外扩增DNA序列。
本实验旨在利用PCR技术鉴定断裂基因。
二、实验步骤1. DNA提取：从样本中提取DNA。
2. PCR反应：将DNA模板与引物、Taq聚合酶和dNTPs混合，进行PCR反应。
3. 凝胶电泳：将PCR产物进行凝胶电泳，观察结果。
三、实验材料和仪器1. 样本：含有待检测的断裂基因的组织或细胞。
2. DNA提取试剂盒：如TIANamp DNA纯化试剂盒。
3. PCR试剂盒：包含引物、Taq聚合酶和dNTPs等。
4. 凝胶电泳试剂盒：如TBE缓冲液、琼脂糖等。
5. 电泳仪：用于凝胶电泳。
四、实验结果经过PCR反应和凝胶电泳后，可以得到PCR产物带。
如果样品中存在目标基因，则可以在相应位置看到明显的带；如果不存在，则没有明显带出现。
根据带的大小还可以初步判断基因的大小。
五、实验注意事项1. 样品中的DNA应该纯度高，不能有杂质。
2. PCR反应条件要严格控制，包括反应温度、时间和引物浓度等。
3. 凝胶电泳时，电场强度不宜过大，以避免样品损伤。
六、实验意义PCR技术可以快速、准确地鉴定断裂基因，有助于诊断某些疾病。
此外，PCR技术还可以用于基因工程、遗传学研究等领域。
七、实验优化1. 引物设计：引物的选择和设计对PCR反应的成功与否至关重要。
合适的引物能够提高PCR反应的特异性和灵敏性。
2. PCR条件优化：反应温度、时间和引物浓度等条件都会影响PCR反应的结果。
通过不断调整这些条件，可以得到最佳的PCR产物。
3. 凝胶电泳优化：凝胶电泳时，电场强度和琼脂糖浓度也会影响结果。
根据需要进行相应调整即可。
八、总结本实验利用PCR技术鉴定断裂基因，通过DNA提取、PCR反应和凝胶电泳等步骤，得到PCR产物带。
实验过程中需要注意引物设计、PCR条件优化和凝胶电泳优化等方面。
PCR技术在生命科学研究中具有广泛的应用前景。
实时荧光定量聚合酶链式反应 qPCR Protocol
实时荧光定量聚合酶链式反应（qPCR，Quantitative PolymeraseChain Reaction）是一种在PCR反应体系中加入荧光基团，通过荧光信号的实时监测，实现对DNA模板定量分析的技术。
下面是qPCR 的原理、所需试剂和耗材、实验仪器、准备工作、实验方法、注意事项、常见问题及解决方法。
一、qPCR的原理qPCR的原理是在普通PCR反应体系中加入荧光基团，如荧光素、荧光胺等。
这些荧光基团在特定波长激发光的照射下会产生荧光信号。
在PCR反应过程中，每当DNA双链解开形成单链时，荧光基团暴露于激发光下，产生荧光信号。
随着反应的进行，荧光信号强度与PCR产物数量呈正比，通过实时监测荧光信号强度的变化，可以计算出起始模板DNA的数量和扩增产物浓度。
二、所需试剂和耗材1.引物：根据目标基因序列设计特异性引物。
2.DNA模板：待扩增的目标DNA片段或cDNA。
3.荧光染料：如SYBR Green I或特定探针染料，用于标记DNA。
4.dNTPs（脱氧核糖核苷三磷酸）：DNA合成的原材料，包括dATP、dTTP、dCTP、dGTP。
5.DNA聚合酶：如Taq DNA聚合酶或其它具有热稳定性的DNA聚合酶。
6.Mg2+离子：激活DNA聚合酶的辅助因子。
7.Buffer（缓冲液）：调节反应液的pH值，提供合适的反应环境。
8.DEPC水：用于制备无RNA酶的水。
9.封管器：用于将反应液分装到PCR管中。
三、实验仪器1.qPCR仪：具有荧光检测系统，可实时监测PCR产物的荧光信号强度。
2.微量移液器：用于精确添加PCR反应液。
3.离心管：用于混合和离心PCR反应液。
4.水浴锅：用于PCR反应液保温。
5.电泳仪和电泳槽：用于分析扩增的DNA片段。
6.分光光度计：用于测量DNA和RNA的浓度。
7.显微镜：观察细胞和组织样品。
四、准备工作1.了解qPCR的基本原理和步骤。
2.设计和制备引物：根据目的基因序列设计特异性引物。
聚合酶链式反应(PCR)
操作： 5份标本
Taq 酶 (5U/μl)： 0.2μl × 6 = 1.2μl 水： 共174μl，先用移液器 / 指弹混匀，后用离心机瞬时 混匀（管壁上液体沉至管底）。
2. 另取 5 支0.2ml Ep管，分别加入上述液体29μl。
3. 分别取标本模板各1μl，加入上述5支 Ep 管中，混 匀，分别加入2滴液体石蜡（防止加温过程中液体蒸 发影响反应体积），离心机瞬时离心，备用。
⑶ 延伸温度和时间：
一般位于Taq酶最适作用温度70 ～ 75 ℃之间。 引物小于16个核苷酸时，过高的延伸温度不利于引 物与模板的结合，可以缓慢升温到70 ～ 75 ℃。 延伸反应时间，可根据待扩增片段的长度而定， < 1Kb，1分钟足够；> 1Kb需加长延伸时间，10Kb 片段延伸时间可达15分钟。
0.2×30 / 10 = 0.6μl 0.4×30×2 / 10 = 2.4μl 1μl 30-3-1.8-0.6-2.4-0.2-1=21μl
Taq 酶(5U/μl)：1 / 5 = 0.2μl 模板： 水：
总体积 30μl ×6 = 180μl 1. 取一 0.5 ml Ep 管，依次加入下列试剂： 10×buffer： 3μl ×6 = 18μl MgCl2: 1.8μl×6 = 10.8μl dNTPs: 引物 P： 0.6μl×6 = 3.6μl 2.4μl ×6 = 14.4μl 21μl × 6 = 126μl
扩增的特异性取决于引物与模板DNA的特异 结合，基本反应步骤分三步： 1. 变性 (Denaturation)： 加热使模板DNA双链间的氢键断裂而形成两 条单链。94℃ 30″
2. 退火 (复性) (Annealling):
突然降温后模板DNA与引物按碱基配对原则 互补结合，也存在两条模板链之间的结合，但由 于引物的高浓度，结构简单的特点，主要的结合 发生在模板与引物之间。55 ℃ 30 ″
逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)
1． 随机六聚体引物：当特定 mRNA 由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝其全长 序列时，可采用随机六聚体引物这一丌特异的引物来拷贝全长 mRNA。用此种方法时，体 系中所有 RNA 分子全部充当了 cDNA 第一链模板，PCR 引物在扩增过程中赋予所需要的 特异性。通常用此引物合成的 cDNA 中 96%来源于 rRNA。 2． Oligo(dT)：是一种对 mRNA 特异的方法。因绝大多数真核细胞 mRNA 具有 3’端 Poly(A+)尾，此引物不其配对，仅 mRNA 可被转录。由于 Poly(A+)RNA 仅占总 RNA 的 1-4%，故此种引物合成的 cDNA 比随机六聚体作为引物和得到的 cDNA 在数量和复杂性 方面均要小。 3． 特异性引物：最特异的引发方法是用含目标 RNA 的互补序列的寡核苷酸作为引物， 若 PCR 反应用二种特异性引物，第一条链的合成可由不 mRNA 3’端最靠近的配对引物起 始。用此类引物仅产生所需要的 cDNA，导致更为特异的 PCR 扩增。 三、 试剂准备 1．RMA 提取试剂 2．第一链 cDNA 合成试剂盒 3．dNTPmix：含 dATP、dCTP、dGTP、dTTP 各 2mM 4．Taq DNA 聚合酶 四、操作步骤 1. 总 RNA 的提取：见相关内容。 2. cDNA 第一链的合成：目前试剂公司有多种 cDNA 第一链试剂盒出售，其原理基本相同， 但 操 作 步 骤 丌 一 。 现 以 GIBICOL 公 司 提 供 的 SuperScriptTM Preamplification System for First Strand cDNA Synthesis 试剂盒为例。
详细 实验方法
逆转录-聚合酶链反应实验方法 实验材料
组织或细胞样品 试剂、试剂盒
pcr实习报告
pcr实习报告PCR 实习报告一、引言PCR（聚合酶链式反应，Polymerase Chain Reaction）是一种基因分子生物学技术，通过扩增目标DNA序列，以在研究、诊断和治疗等领域中发挥重要作用。
本报告旨在总结我在PCR实习过程中的经验和收获，以及对PCR技术的理解和应用。
二、实习背景1. 实习时间和地点我在2021年7月至8月期间，在XXX实验室进行了为期六周的PCR实习。
2. 实习目的通过实习，我旨在学习和掌握PCR技术的操作流程和实验方法，提高实验操作技巧，并对PCR技术的原理和应用进行深入了解。
三、实习内容1. PCR反应体系准备在实习的第一周，我了解了PCR反应的基本原理，并学会了准备PCR反应所需的体系。
我们根据实验的需要，合理调配了引物、模板DNA、DNA聚合酶、dNTPs和缓冲液等成分，并掌握了合适的反应体系比例和浓度。
2. PCR仪使用及参数设置在第二周实习中，我学习了PCR仪的基本使用方法，并掌握了合理设置PCR反应的温度和时间参数。
通过调整PCR反应体系的温度控制和循环程序，我们能够实现DNA的变性、退火和延伸等步骤，从而实现DNA序列的扩增。
3. PCR实验操作技巧在实习的后几周，我逐渐掌握了PCR反应的实验操作技巧。
比如，我学会了如何进行组装反应体系、合理分装试剂和样品、装填样品到PCR管或板中，并且注意实验操作的无菌技巧和杂交污染的防控。
4. PCR产物分析与检测实习的最后一周，我学习了PCR产物的分析和检测方法。
我们运用凝胶电泳技术，对PCR产物进行了分离和检测，并通过比对DNA分子量标准，进行PCR产物的大小测定和验证。
四、实习心得和收获1. 对PCR技术的深入理解通过本次实习，我对PCR技术的原理和应用有了更深入的理解。
我明白PCR技术的基本原理是通过反复循环的热变性、退火和延伸步骤，在体系中扩增目标DNA序列。
并且我了解到PCR技术在遗传学研究、分子诊断和基因工程等领域中的广泛应用。
随机六聚体引物工作原理
随机六聚体引物工作原理引物（primer）是在DNA复制和PCR（聚合酶链式反应）等生物学实验中不可或缺的重要工具。
而随机六聚体引物则是一种常用的引物，其工作原理为随机引物法。
随机六聚体引物是由六个随机核苷酸组成的引物。
其工作原理是在DNA复制或PCR反应中，随机引物与DNA模板的单链部分进行互补配对，从而扩增目标序列。
随机六聚体引物可以与DNA模板的单链部分进行互补配对。
DNA 复制或PCR反应的起始步骤是在目标DNA的特定位置上，引物与目标序列互补配对形成DNA双链。
随机六聚体引物的六个随机核苷酸可以与DNA模板的单链部分的任意核苷酸互补配对。
随机六聚体引物的互补配对使得DNA复制酶或聚合酶能够沿着DNA模板进行扩增。
DNA复制或PCR反应需要DNA复制酶或聚合酶来合成新的DNA链。
引物与模板DNA的互补配对使得DNA 复制酶或聚合酶能够从引物的3'端开始合成新的DNA链。
随机六聚体引物的扩增作用使得目标序列得以复制。
在DNA复制或PCR反应中，DNA复制酶或聚合酶会沿着DNA模板进行扩增，合成新的DNA链。
随机六聚体引物的配对作用使得DNA复制或PCR反应能够在目标序列上进行扩增，从而得到大量的目标DNA。
总结起来，随机六聚体引物的工作原理是通过与DNA模板的单链部分进行互补配对，使得DNA复制酶或聚合酶能够沿着DNA模板进行扩增，从而得到大量的目标序列。
随机六聚体引物具有以下优点：1. 引物的随机性使得其能够适用于多种不同的目标序列，无需设计多个特异性引物。
2. 引物的长度较短，易于合成和使用。
3. 引物的扩增效率较高，能够在短时间内得到大量的目标序列。
然而，随机六聚体引物也存在一些局限性：1. 引物的随机性可能导致扩增的非特异性产物，影响实验结果的准确性。
2. 引物的长度较短，可能在某些情况下无法特异性地与目标序列配对，导致扩增失败。
在实际应用中，科研人员需要根据实验的具体要求选择合适的引物。
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学院：专业：姓名：学号：实验六聚合酶链式反应(PCR)和PCR产物纯化
实验目的
1、了解PCR反应的基本原理。
2、了解PCR反应的优化条件和PCR的应用。
3、掌握PCR产物纯化的方法。
实验原理
PCR是一种选择性体外扩增DNA或RNA的技术。
1990年，Kary B.Mullis 发明了PCR技术，并因此在1995年荣获诺贝尔化学奖。
PCR技术使分子生物学研究一下子获得了突破，并且随着PCR技术的日趋完善，PCR技术在人类生活中的应用也越来越广泛。
PCR、分子克隆和DNA序列分析构成了现代分子生物学实验工作的基础。
PCR反应包括三个基本步骤：①变性：目的双链DNA片段在94℃下解链；②退火：两中寡核苷酸引物在适当温度（50℃左右）下与模板上的目的序列通过氢键配对；③Tap DNA聚合酶在最适温度下（72℃），以目的DNA合成。
这三个基本步骤组成一轮循环，理论上每一轮循环将使目的DNA 扩增一倍。
这些经合成产生的DNA又可作为下一轮循环的模板，所以经25~35轮循环就可使目的DNA片段扩增达106倍。
实验步骤
1、PCR反应
⑴在EP管中依次下列试剂（50μl反应体系）
试剂用量/μl
灭菌H2O 35.5
PCR反应缓冲液 5
DNTP(4种，每种浓度10μmol/L) 2
上游引物 2
下游引物 2
模板DNA 1
Taq 0.5
⑵摇匀后稍离心，在放入PCR仪中
2、将PCR产物全部用1%的琼脂糖凝胶进行电泳分析。
3、用干净锋利的小刀将含有目的DNA片段的琼脂糖凝胶切下，并放入1.5ml
离心管中。
4、按1:3比例加入Extraction Buffer 中。
5、于恒温水浴中50℃温育，直到凝胶融化。
6、将融化后的混合液全部转移到Spin Column内，于6000g离心1分钟，并弃
去接液管内液体
7、将Spin Column内加入500μl Extraction Buffer,于12000g离心60s，并弃去
接液管内液体。
8、向Spin Column内加入750μl Wash Buffer于12000g离心60s，并弃去接液
管内液体。
9、再次于12000g离心1分钟，然后将Spin Column转移到无菌的1.5ml离心
管内。
10、向Spin Column内加入20μl Elution Buffer并于室温静置1分钟。
11、于12000g离心1分钟，微量离心管内溶液中含有目的DNA片段
12、取50μl进行琼脂糖凝胶电泳鉴定结果。
实验结果与分析
①
②
实验结果：通过PCR三个步骤，解链---退火---延伸，电泳后得到了DNA的片段，如图①，我的实验结果为10号所显示的图像；再经过DNA的纯化，电泳后得到了DNA的片段长度，如图②，我的实验结果为3号所显示的图像，DNA的长度在600bp上。
分析：图①中10号图像比较清晰，说明在操作过程无很大的失误，无污染，为后面的实验做了一个很好的基础。
图②中3号图像的DNA 的片段长度为600bp，可能在操作过程中因操作不当，有些被污染，导致在图像中有些模糊的亮线；。