灭活剂、保护剂和免疫佐剂
04第四章 灭活剂、保护剂和免疫佐剂(兽医生物制品学)
温度越高，灭活越快，灭活作用随温度上升而加速。在低温时，温 度每上升10C，细菌死亡率可成倍增加。每升高10C，金属盐类的灭菌 作用增加2-5倍，石炭酸的杀菌作用增加5-8倍。但是，如果温度超过 40C 或更高，对微生物的抗原性将有不利影响。
(五)pH
在微酸性时灭活速度慢，抗原性保持较好，在碱性时灭活速度快，但 抗原性易受破坏。灭活初期损失较快，以后逐渐减慢，尤其甲醛溶液浓度 高时，在碱性溶液中抗原性损失更大。
附：
用乙烯亚胺衍生物对病毒进行灭活，当灭活结束时，应中止灭活并 除去其残存物，以免继续作用而损害疫苗的免疫原性。采用的方法是： 在乙烯亚胺衍生物灭活的病毒液中加入过量的硫代硫酸钠或亚硫酸钠， 不论是0.05%AEI或0.02%BEI，病毒液中硫代硫酸钠最终浓度均为2%， 以中断灭活剂灭活作用。
此外，-丙内脂（-propiolactone）也是一种良好的病毒灭活剂， 它是一种不稳定的液体，于37C 2h后能自行水解为无毒物质。
注意：这里指的是甲醛的浓度，并非福尔马林的浓度！
(二) 苯酚
酚类是以羟基取代苯环上的氢而形成一类化合物。苯酚(phenolum)， 又称石炭酸(acidum carbolicum)，为具有特殊气味的无色结晶，易潮解， 溶于水及有机溶剂，见光则颜色变深，置于空气中易被氧化，颜色也变深， 所以应避光保存。
三、影响灭活作用的因素
(一) 灭活剂的特异性
某些灭活剂只对一部分微生物有明显的灭活作用，而对另一些微生物 则效力很差。如酚类能抑制和杀灭大部分细菌的繁殖体，5%石炭酸溶液 于数小时内能杀死细菌的芽胞。阳离子表面活性剂抗菌谱广，效力快，对 组织无刺激性，能杀死多种革兰氏阳性菌和阴性菌，但对绿脓杆菌和细菌 芽胞作用弱。
兽用疫苗保护剂和佐剂
兽医生物制品常用的保护剂
1．5%蔗糖（乳糖）脱脂乳保护剂
蔗糖（或乳糖） 5g，加脱脂乳至 100ml，充分溶解后，110~116℃高压灭菌 30~40 min。
2．明胶蔗糖保护剂
明胶 2%~3%（g/m1）、蔗糖5%（g/m1）、硫脲 1%~2%（g/m1）。先 将 12%~18%明胶液、 30%蔗糖液和 6%~12%硫脲液加热溶解， 116℃高压 灭菌30~40min；
1. 营养液： • 可修复因冻干而受损的细胞，使冻干制品含有一定量水分；
• 可促进高分子物质形成骨架，使冻干制品呈多孔的海绵状，
增加溶解度 2. 赋形剂： • 防止低分子物质的碳化和氧化，保护活性物质不受加热影响 • 使冻干制品形成多孔性、疏松的海绵状物，增加溶解度 3. 抗氧化剂： • 抑制冻干制品中的酶作用，增加生物活性物质在冻干后贮存
7．脂质分子类佐剂：脂多糖、Vit A和Vit E等脂溶性维生素
8．其他：霍乱毒素（CT）、百日咳毒素（PT）和破伤风类 毒素（TT）等；脂磷壁酸（LTA）；维生素B12等。
氢氧化铝胶 (铝胶）
合成方法:
（1）用铝粉加烧碱合成法
2Al(OH)3+12H2O+3H2SO4→Al2(SO4)3· 18H2O
兽用疫苗冻干保护剂 和佐剂
冻干保护剂（稳定剂）
保护剂：又称稳定剂（stabilizer） ，是指一类能防止生 物活性物质在冷冻真空干燥时受到破坏的物质。（指对疫 苗生产、血清制备等） 保护剂用途（不同用途加不同保护剂, 主要针对活的微生 物或细胞） ① 菌种或毒种保存：常用甘油作保护剂 ② 细胞株保存：常用二甲基亚砜(DMSO) DMSO:二甲基亚砜，一种细胞的保护剂 ③ 疫苗冷冻真空干燥制备时：加脱脂乳（或二甲基亚 砜）和蔗糖等（不同国家有不同配方） ④ 干扰素类生物活性物质的保存：加葡聚糖
兽用免疫佐剂浅谈
山东畜牧兽医2016年第37卷兽用免疫佐剂浅谈李宁王应玉（山东省威海市文登区张家产畜牧兽医工作站 264407）王亮（山东省威海市文登区畜牧兽医局）中图分类号：S851.33 文献标识码：C 文章编号：1007-1733(2016)11-0048-02免疫佐剂具有增强免疫效应的作用，与疫苗配合使用，延长免疫时间，减少免疫次数，提高免疫效果，在畜牧生产上有重要意义。
1 油乳佐剂油乳佐剂是用矿物油、乳化剂(如span-80，Tween-80)及稳定剂(如硬脂酸铝)、水按一定比例混合制备而成。
有油包水型(W/O)和水包油型(O/W)。
油乳佐剂作为储存库，抗原被包藏其中，注射体内后起到缓释作用，免疫持久。
油乳佐剂在灭活疫苗生产中用广泛。
1.1 弗氏佐剂分为弗氏不完全佐剂(FIA)和弗氏完全佐剂(FCA)。
弗氏不完全佐剂(FIA)是将矿物油(石蜡油)和乳化剂(羊毛脂、Tween-80)混合制成油包水型(W/O)佐剂，弗氏完全佐剂(FCA)是在弗氏不完全佐剂(FIA)的基础上加入灭活的分枝杆菌或卡介苗。
1.2 其它油乳佐剂 除了FCA和FIA，基于矿物油的佐剂还有白油Span佐剂、Specol佐剂、MontanideISA50、ISA 206等。
除了矿物油，其他油脂也可以制成油乳佐剂，比较常用的有植物油(如花生油)、角鲨烯和角鲨烷等。
2 矿物质类佐剂矿物质佐剂属于传统佐剂之一，主要指铝盐和钙盐佐剂，包括氢氧化铝胶、硫酸铝钾胶、磷酸铝、磷酸钙等，矿物质类佐剂能吸附和沉淀抗原，与抗原形成复合物，形成凝胶状态，注入动物体内后形成抗原储存库，缓慢释放抗原，较长时间刺激免疫系统，主要增强机体的体液免疫应答。
铝盐佐剂已有70多年的应用历史，在人用生物制品广泛应用。
3 微生物佐剂某些微生物菌体、组分、代谢产物能够活化免疫细胞，加强免疫效应，对特异性和非特异性免疫都有明显的增强作用。
3.1 微生物菌体 分枝杆菌、乳酸菌类、短小棒状杆菌、葡萄球菌、链球菌、百日咳杆菌。
生物制品的灭活剂、佐剂及保护剂
第四章兽医生物制品的灭活剂、佐剂及保护剂【知识目标】·熟悉兽医生物制品生产中常用的灭活剂、佐剂及保护剂；·理解灭活剂、佐剂及保护剂在兽医生物制品生产中的作用；·掌握·灭活剂、佐刺、保护剂的概念；·影响灭活剂作用的因素；·影响保护剂效能的因素。
·了解·佐剂的基本要求及类型；·保护剂的组成、效能。
【能力目标】·能进行白油佐剂的乳化。
第一节灭活与灭活剂为了提高兽医生物制品的安全性、防止散毒，许多疫苗通常通过灭活制成无毒力和无感染性的制品，灭活乃是兽医生物制品中的一项基本技术。
一、灭活及灭活剂的概念灭活(inanimation)，是指破坏微生物的生物学活性、繁殖能力及致病性，但尽可能不影响其免疫原性，用以制备灭活疫苗。
广义的灭活尚包含灭能(inactivation)，即使一些活性物质(微生物及其代谢产物、激素、酶、血清因子和抗体等)丧失活力的过程。
各种灭活疫苗、诊断抗原等的制造过程均属于灭活；血清经56℃加热30min处理，使补体丧失活性、破坏某些抑制因子的过程，以及破伤风毒素经甲醛处理后即失去致病性成为类毒素的过程均为灭能。
用来灭活的药物称为灭活剂，又称化学灭活剂。
化学灭活是制备灭活苗最重要的手段。
二、灭活的类型按其灭活作用的性质可将灭活分为物理灭活和化学灭活两类，尤以化学灭活法效果确实、方法简便而最为常用。
但不同的微生物、活性物物质采取灭活方法、灭活剂也不尽相同，因此，选择合适的灭活剂和灭活方法对研制灭活兽医生物制品十分重要。
(一)物理灭活一般常用热灭活、超声波灭活、紫外线灭活和γ射线灭活等方法杀死微生物或消除其毒性。
热灭活最早由Smith等研制猪霍乱灭活菌苗时提出，后来发现热灭括容易发生菌体蛋白质变性。
过去用加热灭活方法者较多。
该法简单易行，但加热杀死微生物的方法比较粗糙，容易造成菌体蛋白质变性，凶而免疫原性受到明显影响。
05生物制品的佐剂保护剂灭活剂
B细胞的作用 某些佐剂可以直接作用于B细胞，如细菌脂多糖，以B细胞为主要靶细
胞，使之多克隆增殖，并诱导B细胞对T细胞的敏感性，从而增强对TD抗 原的免疫应答，提高抗体水平。
非特异性免疫增强作用 佐剂效应，除加强抗原引起免疫应答能力以外，还能对各种感染和
肿瘤具有非特异性免疫增强作用，主要是加强NK细胞和K细胞的活性。 这种非特异性的免疫作用，至少有一部分是通过诱导干扰素生成而造成 的。香菇多糖、葡聚糖、云芝多糖、果聚糖等多糖在体内都能诱生干扰 素。
广义的讲，凡是可以增强抗原特异性免疫应答的物质均 可称为佐剂。
对佐剂的基本要求
因为几乎所有畜禽及其产品都是直接或间 接人类食品，所以佐剂作为一些生物制品的 成分，必须考虑其安全性和副作用，既要考 虑对动物的安全性，也必须考虑对人的安全 性。
世界卫生组织及一些专家认为：生物制品的佐剂， 在考虑其免疫增强效应的同时，必须具有以下条件
存
化十八烷基三甲铵。
型
胺及其类似物：癸胺、癸胍及其他。
核酸及类似物：DNA、RNA、低核苷酸、多聚核苷
酸、环磷酸腺苷等。
药物：左旋咪唑及蜂胶等
佐剂的作用机理
各种佐剂的作用机理不尽相同，但概括起来有如下方面
1．对抗原的作用
(1) 增加抗原分子的表面积 某些佐剂颗粒表面可以吸附许多抗原，使抗原表面积明显
增加，特别是可溶性抗原或半抗原，经胶体颗粒吸附后，抗 原性增强，抗体滴度明显提高。
(2) 延长抗原在体内的存留时间 抗原与某些佐剂混合后形成凝胶状，延长抗原在体内的
贮存时间，使其徐徐释放，因而提高抗原物质的免疫原性。
2．对机体的作用
对单核巨噬细胞的作用 佐剂能引起细胞浸润，出现巨噬细胞、淋巴细胞及浆细胞聚集，促进
兽医生物制品名词解释重点
兽大夫物成品：依据免疫学道理,运用微生物.寄生虫及其代谢产品或免疫应答物制备的一类物资.作为诊断.治疗.预防特定传染病或其它疾病的制剂.通俗成品：运用一般临盆办法制备的,未经浓缩.纯化处理所制成的.精成品：将原材料用物理或化学办法去除无效成分,并进行恰当浓缩所制成的.单价制剂：只运用一种微生物的单一血清型多价制剂：运用一种微生物的若干血清型多联苗：一次打针可以预防多种疾病的疫苗.疫苗：由病原微生物.寄生虫及其组分或代谢产品制成,接种动物后能产生主动免疫,从而预防疾病的一类生物制剂.传统疫苗：运用微生物或寄生虫或代谢产品等完全个别制成的疫苗.逝世疫苗又称灭活苗：是将病原体司理化办法灭活后,损掉沾染性保持其免疫原性制成的疫苗.弱毒苗：将微生物的天然强毒株经由过程化学.物理或生物学办法,使其对原宿主动物致病力损掉或只引起亚临床沾染 ,但仍保管优越抗原性 ;以此人工整弱的毒株制备的疫苗.类毒素：是用细菌产生的外毒素经甲醛处理,去除毒性感化,保存抗原性后精制而成.亚单位疫苗：是指提取微生物有用抗原部分,运用一种或几种亚单位结构成分制成的疫苗.基因工程亚单位疫苗：是指它只含有病原体的一种或几种抗原基因,经由过程基因重组技巧转入恰当的细菌.酵母菌或哺乳动物细胞,以获得的表达产品作为免疫原制成的疫苗.基因工程活疫苗：病原微生物经由过程基因工程技巧删除其致病基因或部分片断从而获得毒力损掉或下降的毒株而制成的疫苗.基因缺掉疫苗：运用基因工程技巧,使致病的病原体基因组中某个或某些与致病性相干的基因或非须要糖蛋白缺掉构建而成.重组载体疫苗：将目标病原呵护性抗原的基因序列拔出到另一种微生物的无毒株或弱毒株基因组中,并让拔出的外源性基因正常表达,构建成重组载体疫苗株.核酸疫苗：是将一种或多种抗原编码基因克隆到真核表达质粒载体上,将构建的重组质粒直接注入到体内而激活机体免疫体系.合成肽疫苗：用人工办法按天然蛋白的氨基酸次序合成呵护性短肽,然后与载体蛋白衔接后加佐剂所制成的疫苗.转基因植物可食疫苗：运用分子生物学技巧,将病原微生物的抗原基因导入植物,并在植物中表达出活性蛋白.抗奇特型疫苗：以抗病原体的中和抗体为免疫原,制备针对该中和抗体奇特型表位的抗体.尺度菌株或参考菌株：在研讨或特别问题检定方面须要.必须的参考菌种和毒种,其实不直接用于临盆.杂交减毒：将两种遗传性状不合的毒株,在传代培养中进行杂交,从而育成有运用价值的弱毒株.概况造就：将细菌种子液平均地接种于固体造就基概况,平放静置造就,然后收集菌苔.深层造就：将细菌种子液接种于液体造就基进行造就.透析造就：依据小分子能透过半透膜集中,而将不合分子量的物资分别道理设计的一种细菌造就装配进行细菌造就.原代细胞：由新颖组织经由剪碎.胰酶消化制备的细胞.原代细胞传代 1次后的细胞称为次代细胞细胞株：自继代造就的细胞中选育的具有特别生物学性质和标识表记标帜的细胞.细胞系：能在体外无穷传代,多半起源于癌细胞.静置造就：将细胞悬液接入造就瓶或造就板中,置于恒温箱内静置造就,细胞发展滋生成单层.转瓶造就：将细胞悬液接入转瓶后放在恒温箱的转鼓上,转速多为10~20转/h,使贴壁细胞不老是浸于造就液中,有利于细胞呼吸和物资交换悬浮造就：经由过程振荡或迁移转变装配使细胞始终疏散悬浮于造就液内的造就办法,重要用于一些在振荡或搅拌下能发展滋生的细胞.微载体造就：用渺小的颗粒作为细胞载体,经由过程搅拌悬浮在造就液内,使细胞在载体概况滋生成单层的一种细胞造就技巧.免疫血清：动物在接收抗原刺激或天然沾染康复后,其血清中平日含有针对特定抗原的高效价特异性抗体,该动物的血清即称为免疫血清.外毒素：是微生物在性命运动进程中产生并释放或排泄到四周情况中的毒素.内毒素：只有在微生物逝世亡后细胞决裂时,才干释放出来的毒素.抗毒素：以类毒素作为抗原免疫动物,刺激机体响应的B细胞活化增殖为浆细胞后,产生的特异性抗体.卵黄抗体：是在卵黄中含有针对某种病原微生物的特异性抗体.微生态制剂：是指依据微生态理论,在微生态学理论指点下,用正常微生物群成员,经特别工艺制成的只含有活菌或包含细菌菌体及其代谢产品的重要用于动物的活菌制剂.益生素：一种可经由过程转变肠道菌群均衡而对动物施加有利影响的活微生物饲料添加剂益生元：它是一类非消化性物资,能选择性的促进一种或几种定植于结肠内常住菌的活性或发展滋生,从而促进宿主健康.合生元：益生素和益生元结合运用,既可施展益生菌的活性,又可选择性地进步这些菌的数目,使益生感化更明显持久.乳酸菌：是一种可以分化糖类产生乳酸的革兰氏阳性菌,厌氧或者兼性厌氧发展.芽孢杆菌：用于益生素的芽孢杆菌是肠道的过路菌,不克不及定植于肠道中.养分感化：益生菌（如乳杆菌,双歧杆菌等）可以或许合成多种维生素如叶酸.烟酸.维生素B1.维生素B2等,促进机体对蛋白质.钙.铁和维生素D的消化接收,从而起到促进畜禽发展和进步临盆机能的感化.基因重组技巧：也称重组 DNA或分子克隆,是一种在分子程度上按照人们设计的蓝图对基因进行人工操纵的技巧.灭活剂：指用来灭活生物成品活性的化学物资,又称化学灭活剂.佐剂：是指与抗原物资混杂或先于抗原或同时注入动物体内,能非特异性地加强机体反抗原物资的免疫应答的一类物资.弗氏不完全佐剂：是由低引力和低粘度的矿物油及乳化剂构成的一种贮藏性佐剂.弗氏完全佐剂：在不完全佐剂的基本上加必定量的分支杆菌而成.乳化剂：指油乳剂中内相与外相间的界面活性物资,具有促进和稳固两种互不相溶物形成乳剂.冻干呵护剂：又称稳固剂,是指在冻干进程中及冻干后使生物成品的生物活性免受损坏的一种物资.GMP：优越功课规范,是一种特别重视在临盆进程中实行对产品德量与卫生安然的自立性治理轨制.载体：将一个外源基因送入受体细胞的运输对象.免疫接种：是用人工办法将免疫原或免疫效应物资输入到机体内,使机体经由过程人工主动免疫某人工主动免疫的办法获得防治某种传染病的才能.预防接种：在经常产生某些传染病的地区,或有某些潜在传染病的地区,或受到某些临近地区传染病威逼的地区,为了防患于未然,在日常平凡有筹划地给健康畜禽进行的免疫接种称为预防接种.紧迫接种：是在产生传染病时,为了敏捷息灭疫病的风行,而对疫区和受威逼地区尚未发病的畜禽进行的免疫接种.带虫免疫：沾染引起的免疫反响与机体少量寄生虫的消失相干,例如血吸虫病和旋毛虫病.在原虫,带虫免疫现象被称为传染免疫,人.猴.鸡的很多原虫就引起这种免疫.无虫免疫：体内寄生虫被完全消除,并对再沾染(或进击)消失特异性的毕生免疫,这种免疫在动物种比较多见,在人可见于皮肤利什曼氏病.SPF动物：指动物体内无特定病原体微生物,但许可消失除特定病原微生物外的其他微生物.基因免疫：由外源性基因直接刺激机体所产生的免疫反响.国度尺度品：是指用国标尺度品标定的,用于权衡某一成品效价或毒性的特定物资,其生物活性以国标单位暗示.。
项目四 灭活剂、保护剂与免疫佐剂
三、影响灭活作用的因素
⒈灭活剂特异性：石炭酸对真菌和病毒效果差，甲醛 最常用。 ⒉微生物的种类和特性：一般含氮量越高，甲醛等灭 活剂的消耗量就越大，灭活脱毒速度越慢。 ⒊灭活剂浓度（一定要合适） ⒋灭活温度（具体不同病原体和或毒素，其灭活时间 和温度不一致）。 ⒌灭活时间：随灭活剂浓度及温度升高，灭活时间则 缩短。 ⒍PH：微酸时灭活速度慢，抗原性保持较好。 ⒎有机物的存在：被灭活的病毒或细菌液中，如果含 有血清或其它有机物质，会影响灭活剂的灭活能力。
当以水为分散相，以加有乳化剂的油为连续相时，制
成的乳剂为油包水型乳剂（水／油或W／O），是生物 制品采用的主要剂型。
白油佐剂
一种好的乳剂苗，应该是W／O或O／W型，粘度较低， 颗粒大小均匀，稳定性良好，呈乳白色。
（四） 蜂胶佐剂 （五）ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ生物佐剂
三、新型免疫佐剂
1、细胞因子类 2、免疫刺激复合物
二、常用灭活剂的应用
⒈甲醛溶液：最常用 2.苯酚（石炭酸）：用于防腐，很少用于疫苗研制。 3.结晶紫：蛋白质变性。（溶于有机溶剂）用于诊断抗原 的制备：鸡白痢抗原 4.β-丙内酯 狂犬病灭活苗制备所用 5 烷化剂 乙酰基乙烯亚胺 二乙烯亚胺 缩水甘油醛 6 硫柳汞 用于生物制品的防腐和消毒。 7 缩水甘油醛 注意：灭活剂对人有害，有时对皮肤黏膜有强烈刺激性。
④干扰素类生物活性物质的保存：加葡聚糖。
二、冻干保护剂的组成
⒈低分子物质（营养液）：
营养液：脱脂乳、蛋白胨、氨基酸、和糖类 等 ⒉赋形剂(高分子物质）骨架
赋形剂：蔗糖、山梨醇、乳糖、PVP、葡聚 糖等 ⒊抗氧化剂 抗氧化剂：Vit.C、Vit.E和硫代硫酸钠等
免疫佐剂的作用和发展
免疫佐剂的作用和发展免疫佐剂（Adjuvants）是指能够增强疫苗免疫效果的物质。
疫苗是预防疾病的有效手段，但有些病原体或疫苗成分自身不足以激发充分的免疫反应，这时需要通过加入免疫佐剂来提高疫苗的效果。
下面将详细介绍免疫佐剂的作用和发展。
1.增强免疫原性：免疫佐剂能够增强疫苗的免疫原性，提高人体对疫苗中免疫原的免疫反应。
免疫佐剂可以通过多种方式增强免疫原性，如促进抗原递呈细胞的摄取和处理、增强抗原的稳定性和持续性释放、刺激免疫细胞的活化和增殖等。
2.调节免疫反应类型：不同的免疫佐剂可以调节免疫反应的类型和程度。
免疫佐剂可以使体内产生更多的特异性细胞免疫或体液免疫反应，对于不同类型的疾病和不同人群的免疫需求，可以选择不同的免疫佐剂来达到最佳的免疫效果。
3.延长免疫保护：免疫佐剂可以延长疫苗对疾病的免疫保护时间。
疫苗免疫效果的持续时间是一个重要的指标，免疫佐剂可以通过增强免疫记忆细胞的产生和存活，延长疫苗的免疫保护效果。
4.提高免疫强度：免疫佐剂可以提高疫苗接种后的抗体水平和免疫强度。
对于不易激发强免疫反应的人群，例如老年人和免疫功能低下者，免疫佐剂的使用可以提高疫苗的免疫效果。
免疫佐剂的发展历程可以追溯到19世纪。
最早的免疫佐剂使用的是表皮刺激剂，例如用火烫伤的方法来增强疫苗效果。
20世纪初，世界各国开始研究和开发化学免疫佐剂，如氢氧化铝（aluminum hydroxide）和石墨烯（graphene）等。
这些化学免疫佐剂主要通过吸附抗原，增加其免疫原性。
近年来，随着免疫学和生物技术的不断发展，越来越多的新型免疫佐剂被研发出来。
例如，油乳剂佐剂（例如MF59）和脂质体佐剂（例如liposomes）等，可以提高疫苗的免疫原性和免疫强度。
肽佐剂（例如TLR agonists）和核酸佐剂（例如CpG oligodeoxynucleotides）等，可以调节免疫反应类型和持续时间。
纳米技术佐剂（例如nanoparticles）可以提高抗原递呈效率和稳定性。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
1、乙酰基乙烯亚胺（N-acetyl ethylenimine，AEI） •淡黄色澄明液体，有轻微氨臭味，能与水或醇任意混合。 •0～4℃可保存1年，在-20℃可保存2年 •AEI功能基团是乙烯亚胺基，可用于口蹄疫灭活苗。 •口蹄疫病毒液: 终浓度0.05％，30℃8h, 加2％硫代硫酸钠阻断
4、-丙酰内酯（－propiolactone）又名羟基丙酸--内酯 •无色有刺激气味的液体，水溶液应密封于玻璃瓶中5℃保存 •水中溶解度37％，能与丙酮、醚和氯仿任意混合 •对皮肤、粘膜及眼有强刺激性，对动物有致癌性。 •病毒灭活后，能保持良好的免疫原性 •主要用于狂犬病灭活疫苗的制备。
三、影响灭活作用的因素
2、二乙烯亚胺（binary ethylenimine，BEI） •市购商品为0.2％的BEI溶液，在0～4℃可保存1个月; •终浓度0.02%, 加入2％硫代硫酸钠中断灭活。
3、缩水甘油醛（glycidaldchyde，GDA） •大肠杆菌、噬菌体、新城疫病毒灭活效果优于甲醛。 •本品易挥发，水溶液含量为15～31mg/ml。 •0～4℃ 3个月含量渐下降，约半年失效；20℃只能保存10d。
物理方法（不用） 化学方法（常用） 3、灭活剂：用于灭活微生物的化学试剂或药物称为灭活 剂
二、常用灭活剂的灭活机理与应用
(一) 灭活剂种类 1、甲醛溶液：
①蛋白质 ②核酸烷基化（不加中断剂）
2、烷化剂
乙酰基乙烯亚胺（AEI） 二乙烯亚胺(BEI) 缩水甘油醛 （使微生物核酸烷基化,灭活后加2%硫代 硫酸钠中断灭活） 3、苯酚（石炭酸）：用于防腐， 很少用于疫苗研制 4、结晶紫：蛋白质变性。（溶于有机溶剂） 用于诊断抗原的制备：鸡白痢抗原 5、β-丙酰内酯 病毒灭活剂，为狂犬病灭活苗制备所用. 注意：灭活剂对人有害， 有时对皮肤粘膜有强烈刺
疫苗冻干保护剂组成
1. 营养液： • 可修复因冻干而受损的细胞，使冻干制品含有一定量水分； • 可促进高分子物质形成骨架，使冻干制品呈多孔的海绵状， 增加溶解度 2. 赋形剂： • 防止低分子物质的碳化和氧化，保护活性物质不受加热影响 • 使冻干制品形成多孔性、疏松的海绵状物，增加溶解度 3. 抗氧化剂： • 抑制冻干制品中的酶作用，增加生物活性物质在冻干后贮存 期间的稳定性，如维生素C、维生素E和硫代硫酸钠等。
一些常用的冷冻干燥保护剂
分类
保护剂
复合物 糖类 盐类 醇类 酸类 聚合物
脱脂乳、明胶、蛋白质、蛋白胨、糊精、血清、甲基纤维素等 蔗糖、乳糖、麦芽糖、葡萄糖、果糖等 乳酸钙、谷氨酸钠、氯化钠、氯化钾、醋酸铵、硫代硫酸钠等 山梨醇、甘油、甘露醇、肌醇、木糖醇等 柠檬酸、酒石酸、氨基酸等 葡聚糖、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)等
2．明胶蔗糖保护剂
明胶 2%~3%（g/m1）、蔗糖5%（g/m1）、硫脲 1%~2%（g/m1）。先 将12%~18%明胶液、30%蔗糖液和6%~12%硫脲液加热溶解，116℃高压 灭菌30~40min；
3．SPGA保护剂
蔗糖 76.62g、磷酸二氢钾0.52g、磷酸氢二钾1.64g、谷氨酸钠0.83g、牛血 清白蛋白10g、加去离子水至1000ml，混合溶解，过滤除菌。
第三章 灭活剂、保护剂和免疫佐剂
第一节 灭活剂 一、灭活与灭活剂 1、灭活概念
是指破坏微生物的生物学活性、繁殖能力和致病性， 但尽可能不影响其免疫原性，被灭活的微生物主要用于生 产灭活疫苗；或指破坏 诊断血清或待检血清中的补体活性， 以避免补体对诊断试验的干扰作用。
微生物毒力的灭活或毒素毒性灭活或补体活性灭活 2、灭活方法
（二）病毒的保护剂 ① 5%蔗糖 脱脂乳； ② 马立克814活细胞疫苗:保存液氮.稳定剂为10%二 甲基亚砜和50%犊牛血清的199液。 注意: 微生物保护剂缓冲液的组成比例，不同厂家有 不同的配方。
兽医生物制品常用的保护剂
1．5%蔗糖（乳糖）脱脂乳保护剂
蔗糖（或乳糖）5g，加脱脂乳至100ml，充分溶解后，110~116℃高压灭菌 30~40 min。
２、保护剂浓度：严格按照配方执行。 ３、保护剂配制方法：糖类不能用121℃高压灭菌处理。 ４、保护剂酸碱度（PH值）：主要对M的影响。
三、常用的冻干保护剂（稳定剂） 明确不同种类微生物需要添加不同保护剂
（一）细菌的保护剂 ① 需氧或兼氧厌氧菌：５％蔗糖脱脂乳或５％蔗糖、 1.5％明胶； ② 厌氧性细菌：含1.5％谷氨酸钠的１％乳糖或10％脱 脂乳或7.5％葡糖血清。 注：脱脂乳：20％脱脂奶粉溶于水配制而成。
① 菌种或毒种保存：常用甘油作保护剂 ② 细胞株保存：常用二甲基亚砜(DMSO)
DMSO:二甲基亚砜，一种细胞的保护剂 ③ 疫苗冷冻真空干燥制备时：加脱脂乳（或二甲基亚
砜）和蔗糖等（不同国家有不同配方） ④ 干扰素类生物活性物质的保存：加葡聚糖
保护剂（protector）的分类
分类： •（根据其作用机理） ——渗透剂：如二甲基亚砜（DMSO）、甘油和蔗糖等 ——非渗透剂：如聚乙烯吡咯啶酮(PVP)和蛋白质等 •（根据其分子量大小） ——高分子物质、低分子物质。 •（按其化学性质） ——ຫໍສະໝຸດ 合物、糖类、盐类、醇类、酸类和聚合物
1、灭活剂特异性：石炭酸对真菌和病毒效果差，甲醛 最常用。 2、微生物种类和特性 3、灭活剂浓度（一定要适合） 4、灭活温度（具体不同病原体或毒素，其灭活时间和 温度不一致） 5、灭活时间 6、灭活PH值 7、有机物存在
第二节 保护剂（稳定剂）
保护剂：又称稳定剂（stabilizer） ，是指一类能防止生 物活性物质在冷冻真空干燥时受到破坏的物质。（指对疫 苗生产、血清制备等） 保护剂用途（不同用途加不同保护剂, 主要针对活的微生 物或细胞）
冻干保护剂作用机制
① 防止活性物质失去结构水及阻止结构水形成结晶而导致生 物活性物质的损伤；
② 降低细胞内外的渗透压差、防止细胞内结构水结晶，以保 持细胞的活力；
③ 保护或提供细胞复苏所需的营养物质，有利于生活力的复 苏和迅速修复自身。
二、影响保护剂效能的因素
1、保护剂种类: 根据微生物种类或者用途来添加不同种 类保护剂。