配体垂钓和生物标记物筛选 - 生物无忧-生物视频网,实验视频
生物标记物的筛选和鉴定方法
生物标记物的筛选和鉴定方法生物标记物是指一种可以用来指示某种生物过程或病理状态的物质，如基因表达、蛋白质表达、代谢产物等。
生物标记物的筛选和鉴定方法对于研究生物学、医学和生物医学工程等领域具有重要意义。
本文将从生物标记物的筛选和鉴定方法两个方面进行探讨。
一、生物标记物的筛选方法生物标记物的筛选是指从多个候选标记物中筛选出与所研究的生物过程或病理状态密切相关的标记物。
生物标记物的筛选方法主要有以下几种。
1. 基于差异表达分析的筛选方法差异表达分析是指通过比较两个或多个不同状态的样本，寻找在这些状态之间存在差异表达的基因或蛋白质的方法。
这种方法可以使用高通量测序技术、芯片技术或蛋白质组学技术等手段进行实现。
2. 基于代谢组学的筛选方法代谢组学是指通过对生物样本中代谢产物的定量和鉴定，揭示生物过程或疾病状态的变化，并寻找与之相关的生物标记物的方法。
代谢组学可以使用质谱分析技术、核磁共振技术等手段进行实现。
3. 基于蛋白质组学的筛选方法蛋白质组学是指通过对生物样本中蛋白质的定量和鉴定，寻找与生物过程或疾病状态相关的生物标记物的方法。
蛋白质组学可以使用质谱分析技术、蛋白质芯片技术等手段进行实现。
二、生物标记物的鉴定方法生物标记物的鉴定是指验证生物标记物确实与所研究的生物过程或病理状态密切相关的过程。
生物标记物的鉴定方法主要有以下几种。
1. 基于动物实验的鉴定方法动物实验是指将候选标记物应用于动物模型中，观察其是否能够准确地反映所研究的生物过程或病理状态的方法。
这种方法可以使用小鼠、大鼠、猴子等动物作为研究对象，通过观察动物体内生理、病理等指标的变化，判断生物标记物的相关性。
2. 基于临床试验的鉴定方法临床试验是指将候选标记物应用于人体，观察其是否能够准确地反映所研究的生物过程或病理状态的方法。
这种方法可以使用随机对照试验、前瞻性队列研究等手段进行实现，通过观察患者的临床症状、生理指标等变化，判断生物标记物的相关性。
亲和阵列-色谱联用筛选中药活性成分新方法：钓鱼法
／★ 联 系人 ： ￣ 陈波 ， ， 教授 博士研 究生导师 ， 主要研 究方 向： 色谱联 用及 亲和分 离介质研 究及其在 中草 药和食品安全分析 中的应用 ，－ ａ ：ｒｅｅ— Ｅ ｍ ｉ ｄ ｈｎ ｌ －
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层次研究挖掘中药作用的真实物质基础。 药 物 高 通 量 筛 选 技 术 ，是 发 现 创 新 药 物 的重 要
技 术 手 段 之 一 ， 已成 为 新 药 研 发 必 不 可 少 的快 速 手
及生物大分子三大类 。 依赖这些化学成分起到有主次 的多靶点 、 有机 的整体协 同治疗作用 。 近年来 ， 国投入 大量经费及人力开展 了中药物 我
２０ 第十一卷 ０９
第一期 ★ｖ １ｌＮ ． ｏ１ ｏ ． １
结 果 和 特 色效 用 。分 子 水 平 和 细 胞 水 平 的实 验 方 法
（ 或称筛选模 型 ）是实 现药物 高通量筛选 的技术基 础， 根据其 生物学 特点 ， 可分 为 以下几类 ： 受体结合
分 析 法 ； 活性 测 定 法 ； 胞 分 子 测 定 法 ； 胞 活性 酶 细 细 测 定 法 ； 谢 物 质 测 定 法 ； 因 产 物 测 定 法 。这 些 实 代 基 验 方 法 ， 已广 泛 用 于药 物 高通 量 筛选 中 。 均
关键词 ： 亲和 阵列 色谱 联 用 快 速 筛选 钓 鱼 法
核酸适配体的体外筛选方法的最新研究进展
核酸适配体的体外筛选方法的最新研究进展李亚楠;赵洁;张傲哲;谭琰;华茜;张子剑【摘要】Aptamers are single-stranded oligonucleotides that are screened by systematic evolution of ligands by exponential enrichment (SELEX)in vitro,which can selectively bind to different target with high affinity and high specificity,including protein,small molecules, organiccompound,metal ions,drugs,etc. This technology has attracted more attentions for its advantages and thus it has been applied widely in many aspects such as biological sensor,gene chip,new drug development,nano technology,etc. However,the traditional SELEX method is cumbersome,which usually takes several months to screen out the targetof nucleic acid in high specificity. With the rapid development of SELEX,many novel screening methods have emerged in recent years. The screening cycle and the screening efficiency are improved with these new methods,and the application of aptamers is expanded. This review introduces several new screening methods in recent three years, including multiple GO-SELEX,SWCNTs-assisted cell-SELEX,on-chip Cell-SELEX,Sequence-constructive SELEX and High-Fidelity (HI FI)SELEX,It is helpful for us to know more about the latest progress on the methods forin vitro screening aptamers and to promote the application of aptamers in various fields..%核酸适配体是用配体指数富集系统进化技术(SELEX)在体外筛选得到的一小段寡核苷酸序列,能够选择性的与不同的靶标特异性的结合,包括蛋白质、小分子、有机物、金属离子、药物等,具有高亲和力和高特异性.这项技术的诸多优势,使其迅速得到重视,核酸适配体在生物传感器、基因芯片、新药开发、纳米技术等诸多方面应用广泛.但是传统的SELEX方法操作繁琐,筛选周期长,需要几个月的时间才能筛选出与靶标具有高特异性的核酸适配体.随着SELEX的快速发展,近年来出现了很多新型的筛选方法,这些新的方法大大提高了筛选周期,极大的提高了筛选效率,拓展了核酸适配体的应用.总结介绍了近三年来出现的几种新型的核酸适配体的筛选方法,包括氧化石墨烯SELEX(Multiple GO-SELEX)、单壁碳纳米管辅助细胞SELEX(SWCNTs-assisted cell-SELEX)、基于芯片的细胞SELEX(on-chip Cell-SELEX)、序列构造SELEX(Sequence-constructive SELEX)、高保真SELEX(High-Fidelity SELEX),有助于人们进一步了解、认识核酸适配体筛选技术的发展现状,更好促进核酸适体在各个领域中的应用前景.【期刊名称】《生物技术通报》【年(卷),期】2017(033)004【总页数】5页(P78-82)【关键词】核酸适配体;SELEX;筛选方法【作者】李亚楠;赵洁;张傲哲;谭琰;华茜;张子剑【作者单位】北京中医药大学基础医学院,北京 100029;北京中医药大学基础医学院,北京 100029;北京中医药大学基础医学院,北京 100029;北京中医药大学基础医学院,北京 100029;北京中医药大学基础医学院,北京 100029;北京中医药大学中医药研究院,北京 100029【正文语种】中文核酸适配体是能够与特定靶分子结合且具有高亲和力和高特异性的寡核苷酸［1］。
生物标志物的筛选和分类
生物标志物的筛选和分类生物标志物是指生物体内或者外部可检测的化学或者生理物质，这些物质可以反映生物体内发生的生理病理过程。
生物标志物在临床诊断、疾病预防等医疗领域中具有重要的应用价值。
因此生物标志物筛选和分类的工作也就具有了很高的价值。
一、生物标志物的筛选生物标志物的筛选需要经过严格的科学设计和实验操作，具体可以分为以下几个步骤：1.确定研究目的确定研究目的是筛选生物标志物研究的起点，首先需要确定研究想要解决的问题以及所面临的临床问题。
2.选择样本生物标志物的筛选需要较为完备的样本，通常需要在临床实践中选取有代表性的样本进行研究，比如在患病人群和正常人群中选择样本进行分析。
3.生物标志物的类型生物标志物类型有很多种，例如蛋白质、核酸、脂质、代谢物等。
在筛选时需要选择适当的生物标志物类型。
4.生物标志物的获取在获取生物标志物时需要注意生物标志物本身的稳定性，以及采集方法是否影响生物标志物的质量。
5.生物标志物的检测技术生物标志物检测技术也是生物标志物筛选的关键环节，目前常用的检测技术包括酶联免疫吸附试验、质谱分析、电化学检测等。
6.数据处理和分析数据处理和分析是生物标志物筛选的最后一步，通过对数据的处理和分析，可以对生物标志物进行筛选和评价，选出具有实际应用价值的生物标志物。
二、生物标志物的分类生物标志物较多，按其所代表的病理状态可分为如下几类：1.生理性指标类这类生物标志物是指生物体内正常代谢过程中形成的物质，如血红蛋白、尿素除积素等。
2.临床生化指标类这类生物标志物是指生物体内异常代谢过程中产生的物质，如血清谷丙转氨酶(ALT)、血尿素氮等。
3.代谢类指标这类生物标志物反映代谢状况的变化，如胆固醇、体重、身高、肌肉量等。
4.生化炎症类指标这类生物标志物主要反映体内炎症反应的状况，如白细胞计数、C反应蛋白等。
5.肿瘤标志物这类生物标志物主要反映肿瘤相关的代谢及分泌的物质，包括如PSA、AFP、染色体、癌基因等。
植物细胞悬浮培养与细胞突变体筛选
第八章植物细胞悬浮培养与细胞突变体筛选第一节植物细胞悬浮培养体系的建立和愈伤组织诱导与植株再生一、植物细胞悬浮培养的定义植物细胞悬浮培养（Plant cell suspension culture），是指将植物细胞或小的细胞团（包括含少数细胞的小的分生细胞团或细胞聚集体）放在液体培养基中于摇床上进行悬浮培养。
这些细胞或小的细胞团来自愈伤组织，或某个器官或组织，通过物理或化学的方法进行分离而获得。
二、建立一个良好细胞悬浮培养体系应具备的条件建立一个成功的细胞悬浮培养体系（简称悬浮细胞系）必须满足三个基本条件：①细胞或小的细胞团在液体中分散性良好，小细胞团在几十个细胞以下。
很少有完全由单细胞组成的悬浮细胞系。
②均一性好，即细胞形状、大小及细胞团大小均匀一致。
在倒置显微镜下观察，悬浮细胞系内的细胞团体积和形状比较一致。
③液体培养基中细胞分裂旺盛，细胞生长迅速，一般2〜3天生长量可增加一倍。
植物悬浮细胞系不仅为原生质体培养和人工种子的研制奠定良好基础，同时也为遗传转化提供良好受体，还可以用来生产植物次生代谢产物。
因此，植物细胞悬浮培养是植物细胞工程技术中很有价值的技术手段。
三、建立良好悬浮细胞系的技术关键影响建立良好悬浮细胞系的主要因素，见图6.1。
图6.1影响建立良好悬浮细胞系的主要因素1.选择合适的基因型和外植体（1）基因型基因型是影响植物细胞悬浮培养成功的重要因素。
有的基因型容易诱导形成愈伤组织，用其为外植体进行细胞悬浮培养，细胞可以进行分裂，并可持续分裂，进一步同步化后，获得悬浮培养细胞系。
但有的基因型则与之相反。
因此，要重视起始材料基因型的筛选。
（2）外植体选择合适的外植体是细胞悬浮培养成功的另一重要因素。
外植体的选择对以后愈伤组织的诱导十分重要，是愈伤组织诱导的重要条件。
合适的外植体诱导产生疏松易碎愈伤组织，对以后建立悬浮细胞系可以起到事半功倍的效果。
双子叶植物中常用的外植体为幼胚、成熟胚、下胚轴、子叶和叶片等；单子叶植物中常用的外植体为幼胚、成熟胚、幼穗和花药等。
适配体的筛选技术
适配体的筛选技术——SELEX[摘要] 适配体泛指具有抗体功能的单股寡核苷酸（RNA或DNA），其可形成的特殊的立体结构如以辨识特定的蛋白质。
在一定环境下, 单链DNA 或RNA能与某些物质形成多种热力学稳定的三维空间结构而成为各种功能分子。
在大多数情况下, 溶液中的单链DNA 或RNA 的空间构象是不确定的, 当有目标分子存在时, 在合适的环境下寡聚单链会发生适应性折叠, 形成发夹( hairpin) 、假结( pseudokno t ) 、凸环( bulg e) 、G-四分体( G-quar tet ) 等特殊结构, 通过氢键、疏水堆积作用、范德华力等与目标分子紧密结合。
这种结合不需要依靠通常的核糖磷酸骨架的亲和力, 而且靶物质既可以是蛋白质, 也可以是多肽及小分子物质。
这种寡核苷酸片段被称为适配体。
适配体的产生是借由一种指数富集配体的系统进化技术( systematic evolution of ligands by exponential enrichment, SELEX)。
SELEX是20世纪90年代发展起来的一项组合化学技术。
利用该技术可以从随机单链核酸序列库中筛选到特异性与靶物质高度亲和的核酸配体( ap tamer) , 其解离常数可以与单克隆抗体媲美。
经过十几年的发展, SELEX技术已经成为一种重要的研究手段和工具,被广泛应用到分子生物学、基因组学、临床医学等众多研究领域, 并且衍生出了混合靶SELEX、体内SELEX、基因组SELEX等各种子技术。
随着基因组学和蛋白质组学的深入开展, SELEX技术会有更广泛的应用前景。
[关键词]适配体；指数富集配体的系统进化; 配体;Aptamer screening technology - SELEX[Abstract] Aptamers function refers to a single-stranded antibody oligonucleotides (RNA or DNA), which can form three-dimensional structures such as special to identify specific proteins. In certain circumstances, asingle-stranded DNA or RNA can form a variety of substances with certain thermodynamically stable three-dimensional structure for a variety of functional molecules. In most cases, the solution of the single-stranded DNA or RNA conformational is uncertain, when the presence of target molecules in a suitable environment occurs adaptive single-stranded oligo folded forms a hairpin (hairpin) , fake knot (pseudokno t), convex ring (bulg e), G-tetrad (G-quar tet) and other special structure, through hydrogen bonding, hydrophobic stacking interactions, van der Waals and other closely integrated with the target molecule. This combination does not need to rely on the usual affinity ribose phosphate backbone and the target substance may be a protein, polypeptide can also be small molecules. This oligonucleotide is called aptamers. Aptamer is produced by means of ligands by exponential enrichment caused by a phylogenetic techniques (systematic evolution of ligands by exponential enrichment, SELEX). SELEX was in the 1990s developed a combinatorial chemistry techniques. This technology can be single-stranded nucleic acid sequence from a random library was screened with the target substance to a specific high affinity nucleic acid ligands (ap tamer), dissociation constant of the monoclonal antibody can be comparable. After ten years of development, SELEX technology has become an important research tool, and tools are widely applied to molecular biology, genomics, clinical research and many other fields, and derived from a mixed target SELEX, in vivo SELEX, genome SELEX various sub-technologies. Withgenomics and proteomics in depth, SELEX technology has wider applications. [key words]Aptamer,SELEX,ligand20世纪90年代初, 美国科罗拉多大学(University of Col2 orado)的Tuerk 和Gold 将翻译T4 DNA 聚合酶( gp43 ) 的mRNA 中一含有8个碱基的环状结构进行序列随机化(该区域为茎环结构, 含18 个碱基, 其中环的部分有8 个碱基,gp43本身可以结合该区域并对自身合成进行调节) , 得到一个含65 536种序列的核酸库, 经过几轮筛选从中得到了两种与gp43紧密结合的核酸配体: 一种为已知的野生型, 另一种变体与野生型相差4个碱基, 两者的解离常数接近(野生型Kd = 5 ×10 - 9 mol/L, 变异性Kd = 3. 2 ×10 - 7 mol/L ) 。
寡核苷酸适配体的筛选及在农兽药残留检测中的应用
寡核苷酸适配体的筛选及在农兽药残留检测中的应用作者：邹雪梅周佳伟宋尚红陈冠华来源：《分析化学》2019年第04期摘要适配体是一类从随机寡核苷酸文库中筛选出来的可对特定靶分子具有高亲和性和特异识别性的单链短脱氧核糖核酸或核糖核酸序列。
自从指数富集配体系统进化（SELEX）的筛选方法问世以来，相继出现了各种基于SELEX的改进筛选方法，以及基于毛细管电泳分离手段的SELEX或非SELEX筛选方法。
作为类似于抗体作用的分子识别元件，适配体在与食品和环境安全相关的农兽药残留检测领域中已得到一定的应用。
在这些应用中，适配体通常与其它可以产生信号的材料如纳米金、量子点等构成复合探针，或与电化学电极等构成传感器。
本文对适配体的筛选方法以及适配体在农兽药残留检测中的应用进行了概括和总结，以期为该研究提供有益的参考。
关键词适配体; 筛选; 农兽药残留; 检测; 评述1 引言食品安全和環境问题被发达国家和许多发展中国家高度重视，各国制定了严格的强制性法规来强化对包括农兽药残留在内的各种有害物质的监管。
例如，美国规定在牛奶中不可检测出抗生素残留，欧盟限定了鸡蛋中四环素类抗生素的最大残留限量（MRL）为200 μg/kg。
因此，对食品和环境样品中农兽药残留进行有效快速检测始终是相应领域的重要研究课题。
适配体是一类从人工构建的随机寡核苷酸文库中筛选出来的单链短脱氧核糖核酸（ssDNA）或核糖核酸（RNA）序列，通常由20～80个碱基组成，库中寡核苷酸序列数可达1013～1015个。
适配体可以与靶分子高特异性、高亲和性结合，适配体与各类靶分子的解离常数可低至nmol/L～pmol/L水平，而高特异性则体现为适配体可以区分仅有一个甲基区别的两种靶分子，可被适配体识别的靶分子范围十分广泛，大的分子或者颗粒等包括疟疾诊断蛋白恶性疟原虫乳酸脱氢酶（PFLDH）[1]、穿孔素蛋白[2]等蛋白质，甚至是产肠毒性大肠杆菌k88[3]、金黄色葡萄球菌[4]等微生物，以及HepG2肝癌细胞[5]、AGS胃癌细胞[6]等细胞，小分子可包括一般意义上的各种小分子化合物，如双酚A[7]、L-色氨酸[8]、黄曲霉毒素[9]等。
基于亲和力的靶点垂钓鉴定
基于亲和力的靶点垂钓鉴定1.引言1.1 概述概述亲和力的靶点垂钓是一种在药物研发中广泛应用的技术。
通过分析生物分子之间的相互作用，科学家可以找到适合用作药物靶点的蛋白质分子。
亲和力的靶点垂钓技术可以帮助药物研发人员更好地理解蛋白质的结构和功能，从而有效地设计出具有更高药物活性和选择性的药物。
在过去的几十年里，亲和力的靶点垂钓技术取得了长足的发展。
研究人员通过多种实验方法和计算模型，不断探索分子之间的相互作用，从而识别出与药物作用相关的蛋白质靶点。
通过这种方法，科学家们能够深入研究药物在蛋白质上的结合机制和作用方式，进而进行更加精准的药物设计和优化。
亲和力的靶点垂钓技术的应用前景广阔。
它不仅可以在早期药物发现阶段用于筛选候选化合物，还可以在药物研发中的各个阶段发挥重要作用。
通过对亲和力的研究，科学家们可以更好地理解蛋白质的结构和功能，进而发现新的药物靶点，为药物研发提供更多可能性。
然而，亲和力的靶点垂钓技术也面临一些挑战和限制。
首先，分子之间的相互作用非常复杂，需要综合运用实验和计算手段进行分析。
其次，亲和力的靶点垂钓技术在某些蛋白质靶点上的应用还存在一定的局限性。
因此，科学家们需要不断改进和完善这一技术，以提高其在药物研发中的应用价值。
综上所述，亲和力的靶点垂钓是一种重要的药物研发技术。
通过分析分子之间的相互作用，科学家们可以发现新的药物靶点，为药物研发带来更多机会。
虽然亲和力的靶点垂钓技术面临一些挑战和限制，但随着科技的不断进步，相信这一技术将在未来的药物研发中发挥更加重要的作用。
1.2文章结构文章结构部分的内容可以从以下几个方面进行描述：1.2 文章结构本文按照以下结构进行论述：第一部分：引言。
在这一部分，首先给出对亲和力的定义和原理进行介绍，然后介绍靶点垂钓的基本原理，最后说明本文的目的。
第二部分：亲和力的概念和原理。
在这一部分，详细介绍亲和力的概念和原理，包括亲和力的定义、亲和力与化学键的关系、亲和力与生物分子相互作用的机制等。
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8图6.与F l t4-F c特异结合的三种细胞条件培养基（CM）。
当CM与过量的Flt4-Fc（非人IgG或KIT-Fc）共注射时，该信号被抑制。
共注射
注射的条件培养基（注意位置对齐，谢谢！）
配体垂钓和生物标记物筛选
对基因组数据库的搜索正让很多新的潜在的细胞表面受体浮出水面，然而，要确认和理解它们的生物学功能，却只有在发现了与之结合的配体时方能实现，这通常限制了对很多新受体生物功能的研究。
配体垂钓，也称Ligand Fishing，正是通过对大量化合物或细胞提取物进行筛选，从而来寻找和确认可能与“孤儿”受体相互作用的配体分子。
从细胞条件培养基中鉴定与细胞表面受体相互作用的可能配体在Biacore系统上进行配体垂钓通常是为进行生物化学及功能鉴定而大量纯化蛋白前的第一步
•
将一个含细胞表面受体Flt4胞外域的Fc融合蛋白固定在传感芯片表面（7）。
将来自100种不同细胞系的浓缩培养基流经芯片表面（图6）。
当把这些培养基用生物学方法检测时，只有在Biacore实验中能与Flt4结合的培养基才能够诱导稳定转染的CHO细胞中的Flt4受体发生酪氨酸磷酸化。
随后，经过亲和层析柱的分离和SDS-PAGE电泳，三种与Flt4结合活性相关的多肽被收集。
由收集到的其中两种肽段中部分氨基酸序列合成变性PCR引物，扩增出一个65 bp的产物。
测序结果显示，该产物中含有一段和已知氨基酸序列完全匹配的序列。
这段cDNA被用来鉴定Flt4的配体，确认该蛋白在新转染细胞中的生物功能，同时还可以用于发现与其功能相关的生长因子的同源区域，从而研究这些配体的基因表达状态。
Reference
7. Fitz, L. J. et al.
Characterization of murine Flt4 ligand/VEGF-C.
Oncogene 15, 613–618 (1997).
9从临床样本中筛选生物标志物
Biacore 方法揭示出在ELISA 类似应用中出现的假阳性和假阴性结果
• 反复性动脉或静脉血栓与杂合型先天性蛋白S （Heterozygous congenital Protein S ，PS ）缺陷有关。
据报道，系统性红斑狼疮（Systemic lupus erythematosus ，SLE ）患者中约有20到30%的病人患有血栓，而血栓的形成又与抗PS 自身抗体的存在密切相关。
在一项研究中，Guermazi 等人将纯化的PS 固定在传感芯片表面（8）。
将从SLE 病人收集的血浆流经这个表面，然后注入抗人IgG （特异性识别Fc ）对血浆中存在的抗PS 抗体进行检测（图7）。
值得注意的是，Biacore 分析能够检测出相同样本在用ELISA 检测时存在的假阳性和假阴性结果（图8）。
在全部27个样品中，共发现有6个样品呈现抗PS 阳性。
本应用展示了如何将配体垂钓原理应用于临床实践。
其中，一种已知的自身抗原（纯化的靶标）被作为诱饵，可以从人血清复杂的蛋白混合物中寻找和鉴定出自身反应抗体。
图7.采用Fc 特异的羊抗人IgG 抗体检测病人血清中的与固
定于芯片的PS 抗原相结合的抗PS 抗体。
图8.抗PS 和PS 之间相互作用的实时模型。
其中抗PS 与PS 之
间特异相互作用所产生的信号可通过后续注射Fc 特异抗人
IgG 抗体（箭头所示）进行鉴定。
模型1=Biacore 阴性
模型2=Biacore 阳性
模型3=Biacore 阳性（ELISA 呈现假阴性结果）
模型4= Biacore 阴性（ELISA 呈现假阳性结果）
Reference
8. Guermazi, S. et al.
Further evidence for the presence of anti-protein S autoantibodies in patients with systemic lupus erythematosus. Blood Coagul. Fibrinolysis 11, 491–498 (2000).
IgG
S （PS ）
葡聚糖
金箔。