土壤重金属污染对蚯蚓的急性毒性效应研究

土壤重金属污染对蚯蚓的急性毒性效应研究3宋玉芳133　周启星1　许华夏1　任丽萍1　孙铁珩1　龚　平2(1中国科学院沈阳应用生态研究所陆地生态过程开放研究实验室,沈阳110016;2加拿大国家研究院生物技术研究所,安大略奎北克H4P 2R2)【摘要】　测定了草甸棕壤条件下,Cu 、Zn 、Pb 、Cd 单一/复合污染对蚯蚓的急性致死及亚致死效应.结果表明,Cu 、Pb 浓度与蚯蚓死亡率显著相关(α=0.05,R Cu =0.86,R Pb =0.87),Cu 浓度与生长抑制率显著相关(α=0.05,R Cu =0.84),其他供试重金属浓度与蚯蚓死亡率和生长抑制率相关性不显著.蚯蚓个体对重金属毒性的耐受程度差别较大.其毒性阈值(引起个体蚯蚓死亡浓度)分别为:Cu 300mg ・kg -1,Zn 1300mg ・kg -1,Pb 1700mg ・kg -1,Cd 300mg ・kg -1.LC 50分别为:Cu 400～450mg ・kg -1,Zn1500～1900mg ・kg -1,Pb 2350～2400mg ・kg -1,Cd 900mg ・kg -1.在Cu 、Zn 、Pb 、Cd 单一污染引起>10%蚯蚓死亡的浓度下,复合污染导致100%蚯蚓死亡,表明复合污染极强的协同效应.关键词　土壤　重金属　复合污染　蚯蚓　急性毒性文章编号　1001-9332(2002)02-0187-04　中图分类号　X174　文献标识码　AAcute toxicological effects of heavy metal pollution in soils on earthw orms.SON G Yufang 1,ZHOU Qixing 1,XU Huaxia 1,REN Liping 1,SUN Tieheng 1and G ON G Ping 2(1Open L aboratory of Terrest rial Ecological Pro 2cess ,Institute of A pplied Ecology ,Chinese Academy of Sciences ,S henyang 110016;2Biotechnology Research In 2stitute ,N ational Research Council of Canada ,6100Royal mount A venue ,Mont real ,Quebec H4P 2R2).2Chin.J.A ppl.Ecol .,2002,13(2):187～190.Acute and sub 2acute lethal effects of single and combined Cu ,Zn ,Pb and Cd on earthworm was determined usin g meadow brown soil.Results indicated that the mortality of earthworm was significantly related with the concen 2trations of Cu and Zn in the soil (α=0105,R Cu =0186,R Pb =0187),and the inhibition rate of earthworm growth was significantly related with the concentration of Cu in the soil (α=0105,R Cu =0184).There was no significant relation between the concentrations of other heav y metals tested and the death rate and the growth 2inhibition rate.The degree of individual earthworm enduring the toxicity of heavy metals varied greatly.The threshold con 2centration of toxicity defined by statistical method ,the level to conduce the death of individual earthworm was 300mg ・kg -1for Cu ,1300mg ・kg -1for Zn ,1700mg ・kg -1for Pb ,300mg ・kg -1for Cd.LC 50was 400～450mg ・kg -1for Cu ,1500～1900mg ・kg -1for Zn ,2350～2400mg ・kg -1for Pb and 900mg ・kg -1for bined ef 2fects of single Cu ,Zn ,Pb and Cd to conduce more than 10%of the death rate of earthworm could result in 100%of the death rate of earthworm ,thus showing the strong synergistic joint effect of the heavy metals.K ey w ords S oil ,Heavy metal ,Combined pollution ,Earthworm ,Acute toxicity.3中国科学院知识创新工程项目(KZCX2-401)、国家重点基础研究发展规划项目(973)、中国科学院“污染生态化学”百人计划项目和中国科学院沈阳生态实验站资助项目.33通讯联系人.2001-05-19收稿,2001-07-30接受.1　引 言蚯蚓是生态系统中的一个重要组成部分,是陆生生物与土壤生态传递的桥梁.当土壤被各类化学品污染后,必将对蚯蚓的生存、生长、繁殖产生不利影响,甚至死亡.因此,利用蚯蚓指示土壤污染状况,已被作为土壤污染生态毒理诊断的一项重要指标[4,6,9].有关蚯蚓生态毒性效应研究主要侧重于农药及杀虫剂等对蚯蚓的毒性.如蔡道基等[1]进行农药对蚯蚓的急性毒性作用.Spurgeon 等[8]研究了蚯蚓对Cu 污染毒害的耐受性.Chang 等[2]以蚯蚓进行了Pb 污染土壤毒性评价.王振中等[9]进行了重金属污染区对蚯蚓影响研究,郭永灿等[3]进行了24h 和48h 的重金属对蚯蚓的毒性研究.但有关以OECD 实验方法进行重金属单一与复合污染条件下蚯蚓急性毒性实验的研究报道较少[2～4,6,9,10～13].本研究选择赤子爱胜(Esisenia f oeli de )为供试蚯蚓,进行草甸棕壤中重金属Cu 、Zn 、Pb 、Cd 单一与复合污染条件下,蚯蚓的急性毒性效应实验研究,为揭示重金属对蚯蚓毒性的剂量2效应关系,以蚯蚓毒性实验作为污染土壤毒理诊断指标提供实验依据[12].2　材料与方法211　供试材料21111供试品CuSO 4・5H 2O ,ZnSO 4・7H 2O ,Pb (NO 3)2,Cd 2Cl 2・2.5H 2O ,均为分析纯.应用生态学报　2002年2月　第13卷　第2期 CHIN ESE JOURNAL OF APPL IED ECOLO GY ,Feb.2002,13(2)∶187～19021112供试土壤和蚯蚓　土壤为0～20cm表土,采自中国科学院沈阳生态实验站(表1).蚯蚓购自市场.实验开始前,将蚯蚓置于湿润的滤纸上3h,使蚯蚓排除畅道内的内含物,然后冲洗,滤纸吸干,备用.表1　供试土壤的理化性质T able1Physical and chemical properties of test soils土壤类型Soil type T2P3(%)T2K(%)K2N(%)p H有机质O2M(%)CEC(cmol・kg-1)T2Cu(mg・kg-1)T2Zn(mg・kg-1)T2Pb(mg・kg-1)T2Cd(mg・kg-1)草甸棕壤0.040.180.091 6.22 1.6512.2632.928.111.10.17 Meadow brown soil3T2P:总P Total P;T2K:全K Total K;K2N:凯氏氮K jedahl2nitrogen;O2M:有机质Organic matter;CEC:阳离子交换量Cation exchange capac2 ity;T2Cu,T2Zn,T2Pb,T2Cd:土壤中Cu、Zn、Pb、Cd背景值(总量)The background values of Cu,Zn,Pb and Cd(total amount).212　主要仪器设备　受控环境生长箱,硬质玻璃培养皿,1L 标本瓶.无灰定性滤纸.213　实验方法21311蚯蚓急性毒性实验　选用1～2月龄,体重200～300g的健康蚯蚓赤子爱胜为供试品[4].正式试验前,进行浓度范围选择试验.以几何级数系列设计至少5种浓度.分别将一定浓度的重金属水溶液与750g土壤混合.调节土壤水分含量为最大持水量的60%.平衡48h后,转移到1L冲洗干净的玻璃瓶中,加入10条已在人工条件中饲养24h蚯蚓.将玻璃瓶用纱布或塑料薄膜扎好瓶口,置于200℃±20℃,湿度为80%的条件下连续光照培养.实验期为14d.每个处理组和对照组设4个平行样.试验第7天时,将培养瓶内的土壤倒入玻璃皿上,检查蚯蚓前尾部对机械刺激的反应后,将土壤和蚯蚓重新置于培养瓶中继续培养直至14d实验结束时,测定蚯蚓的平均体重和数量.以重金属浓度2蚯蚓死亡率和蚯蚓体重增长抑制率绘制剂量2反应曲线[5]. 21312重金属测定　重金属全量采用HNO32KClO5(3∶1),常温常压提取2ICP光谱分析法,可溶性重金属采用0.1mol・L-1HCl提取2AAS法[8].3　结果与讨论311　Cu对蚯蚓的急性毒性效应由图1可见,Cu浓度240mg・kg-1以下时,对蚯蚓不产生任何毒性效应.蚯蚓死亡率和生长抑制率均与对照无差别.Cu浓度300mg・kg-1时,对蚯蚓产生毒性作用.个别蚯蚓死亡和个体体重下降.Cu浓度400mg・kg-1时,蚯蚓死亡率和个体体重下降的亚致死效应并未随浓度上升.Cu浓度450mg・kg-1时,蚯蚓致死率迅速上升至63%,480mg・kg-1为90%,直至Cu1000mg・kg-1时,全部供试组蚯蚓死亡,绝对致死率100%.以蚯蚓死亡率和生长抑制率对Cu浓度作图,进行回归分析,相关性显著(α= 0.05,R Cu=0.86,R Cu=0.84).结果表明,Cu也是蓄积性元素,Cu在蚯蚓机体内的富集是一个逐渐慢性中毒过程.从图1所给标准偏差也表明,蚯蚓个体对Cu毒性的耐受程度差别较大.例如,当Cu为450mg・kg-1时,蚯蚓死亡率63%,标准偏差2513%.图1　土壤中Cu与蚯蚓急性毒性的剂量2效应关系Fig.1A dose2effect relationship between Cu and its acute toxicity on earthworms in soils.Ⅰ1死亡率Death rate,Ⅱ1抑制率Inhibition rate.下同The same be2 low. 与植物根伸长抑制率相比,蚯蚓对Cu毒性的耐受性更强.此外,还有一点不同的是,引起50%蚯蚓死亡的LC50浓度不是一个固定的值,而是一个浓度区间.也就是说,由于蚯蚓个体对毒性感应程度的差别,以及Cu本身蓄积性毒性的限制,在实验上LC50浓度值具有不固定性.通过统计方法确定的浓度区间为400～450mg・kg-1.这一结果远低于有关报道的48h LC50值633mg・kg-1[2].除了实验土壤性质不同影响外,实验周期的长短影响Cu的蓄积性毒性效应.萝卜根伸长抑制率达50%的Cu浓度为50mg・kg-1.显然,重金属对植物根伸长抑制的毒性远大于对蚯蚓的毒性.但蚯蚓急性毒性实验是从土壤动物角度对土壤污染诊断的一个方面,是土壤污染诊断系列中不可缺少的环节[6].312　Zn对蚯蚓的急性毒性效应由图2可见,Zn浓度900mg・kg-1以下时,蚯蚓死亡率和生长抑制率均与对照无差别.Zn浓度1300mg・kg-1时,对蚯蚓产生毒性作用,死亡率20%,生长抑制率40%.随着Zn浓度增加,死亡率上升,1500mg・kg-1时为36.7%,但生长抑制率下降.Zn为1600mg・kg-1时,供试组蚯蚓全部死亡,绝对致死率100%,蚯蚓死亡率和生长抑制率与Zn浓881应　用　生　态　学　报 13卷度的相关性不显著(α=0.05,R Zn 死亡=0.79,R Zn 抑制=0.56,).以上结果说明,在供试蚯蚓中存在两种群体:一种可称为敏感群,它们对毒性的响应十分敏感,且响应的程度与重金属浓度存在明显剂量2效应关系.另一种为不敏感群,它们对重金属毒性具有很强的适应性或抗性.由于这两种群体的存在,导致蚯蚓个体对Zn 毒性耐受程度的显著差别.从图2可见,蚯蚓致死率随Zn浓度增加在较低浓度时是渐进的、缓慢的,而后是迅速的,表明重金属的蓄积性是毒性效应特征[2,7].图2　Zn 与蚯蚓急性毒性的剂量2效应关系Fig.2A dose 2effect relationship between Zn and its acute toxicity onearthworms in soils 蚯蚓对Zn 毒性的耐性也较植物强[11].例如,引起50%蚯蚓死亡的LC 50浓度>1500mg ・kg-1,而萝卜根伸长抑制率达50%的Zn 浓度为700mg ・kg -1.S purgeon 等[6]通过对冶炼厂土壤进行蚯蚓对Zn 污染毒性效应研究时也发现,蚯蚓能忍受高浓度的Zn.313　Pb 对蚯蚓的急性毒性效应由图3可见,Pb 浓度1500mg ・kg -1以下时,蚯蚓死亡率和生长抑制率与对照相当.当Pb 浓度1700mg ・kg -1时,开始对蚯蚓产生毒性.蚯蚓死亡率和生长抑制率分别为3.0%和5.0%.Pb 浓度2000mg ・kg -1时,蚯蚓致死率为零,但生长抑制率为24%,说明高浓度Pb 虽未造成蚯蚓死亡,但已经对蚯蚓产生了明显的亚致死效应.Pb 浓度2300mg ・kg -1时,蚯蚓死亡率和生长抑制率分别为13.3%和12.1%.以上数据说明,Pb 为1700～2300mg ・kg -1是蚯蚓毒害的阈值区.低于此浓度,Pb 对蚯蚓无任何毒害作用,在此浓度之间Pb 含量的增加或减少均未产生增强的毒害作用,高于此浓度,毒害作用随Pb 含量增加而增强,3000mg ・kg -1时,全部供试组蚯蚓死亡,致死率100%.蚯蚓死亡率与Pb 浓度之间显著相关(α=0.05,R Pb 死亡=0.87),与生长抑制率相关不显著(R Pb 抑制=0.60,).Pb 浓度2800mg ・kg -1所得的死亡率和生长抑制率两组数据可知(图3),供试蚯蚓对Pb 毒性反应的差别极大.例如,当一部分蚯蚓因耐受不了高浓度Pb 而中毒死亡时,另一部分蚯蚓确安然无恙,生长抑制率为-2%的结果说明,高浓度的Pb 没有对存活蚯蚓造成任何毒害作用.蚯蚓对Pb 毒性的耐受性同样较植物强[7].例如,引起50%蚯蚓死亡的LC50浓度>2300mg ・kg -1,而萝卜根伸长抑制率达50%的Pb 浓度为700mg ・kg -1.图3　Pb 与蚯蚓急性毒性的剂量2效应关系Fig.3A dose 2effect relationship between Pb and its acute toxicity onearthworms in soils. 由图3可见,Pb 剂量与蚯蚓死亡率相关性不及植物显著.其剂量2效应关系为线性相关.314　Cd 对蚯蚓的急性毒性效应由图4可见,Cd 浓度290mg ・kg -1以下时,蚯蚓死亡率和生长抑制率与对照相同.Cd 浓度300mg ・kg -1时,蚯蚓死亡率和生长抑制率分别为5.0%和16.0%.Cd 浓度800mg ・kg -1时,蚯蚓死亡率增加至20%,生长抑制率略有提高.但在Cd 浓度300～800mg ・kg -1的浓度范围内,蚯蚓致死率无明显变化.Cd 浓度900mg ・kg -1时,对蚯蚓致死与亚致死效应增强.此后,致死率和生长抑制率随Cd 浓度升高而增大.Cd 1000mg ・kg -1时,全部供试组蚯蚓死亡,致死率100%.由此确定了Cd 对蚯蚓毒害作用的几个阶段为:290mg ・kg -1为最大无害浓度,300～800mg ・kg -1为毒害阈值浓度,1000mg ・kg -1为绝对致死浓度.蚯蚓死亡率和生长抑制率与Cd 浓度相关性不显著(α=0.05,R Cd 死亡=0.78,R Cd 抑制=0175,).由图4致死率和亚致死率两组数据分析可见,Cd 在300～800mg ・kg -1浓度范围,对蚯蚓毒害的亚致死效应更加明显.例如,蚯蚓死亡率仅为1.7%、3.0%、5.0%和10%时,亚致死率分别达到9812期 宋玉芳等:土壤重金属污染对蚯蚓的急性毒性效应研究 17%、17.4%、16%和19.3%,说明在毒害浓度阈值区,Cd 对所有供试蚯蚓都产生了明显毒害作用.其中一部分死亡,另一部分生长受到明显抑制.这与Cu 、Zn 和Pb 的情况有所不同.蚯蚓对Cd 毒性的耐受性也较植物强[8].例如,引起50%蚯蚓死亡的LC 50浓度>900mg ・kg -1,而萝卜根伸长抑制率达50%的Cd 浓度为230mg ・kg -1.由图4可见,Cd 剂量与蚯蚓死亡率相关性不及植物显著.其剂量2效应关系为线性相关.图4　Cd 与蚯蚓急性毒性的剂量2效应关系Fig.4A dose 2effect relationship between Cd and its acute toxicity onearthworms in soils.315　重金属复合污染对蚯蚓的急性毒性效应实验以引起>10%蚯蚓死亡的重金属浓度为起点(Cu 400mg ・kg -1,Zn 1400mg ・kg -1,Pb 2300mg ・kg -1,Cd 700mg ・kg -1),进行4种重金属复合污染对蚯蚓的急性毒性实验.由图5可见,在此浓度下供试蚯蚓100%死亡.分别将上述土壤按比例稀释,使土壤中4种重金属浓度分别为原土浓度的1/2、1/3和1/4,由图5可见,蚯蚓死亡率分别为25%、8.3%和3.3%,抑制率分别为18.4%、6.4%、215%.显然,复合污染产生明显的协同作用,明显降低了蚯蚓急性致图5　重金属复合污染与蚯蚓急性毒性的剂量2效应关系Fig.5A dose 2effect relationship between combined pollution of the test 2ed heavy metals and their acute toxicity on earthworms in soils.死浓度.由图5可见,在同一污染浓度下,蚯蚓的亚致死效应与重金属浓度呈明显剂量2效应关系.亚致死效应是蚯蚓受害过程和受害程度的体现,是蚯蚓对污染条件的一种本能生理反应.它与个体蚯蚓因对污染环境敏感而导致死亡的结果比较,同样是反映蚯蚓群体对土壤整体质量的一种识别的一种方式[2].显然,蚯蚓对重金属复合污染的毒性响应远比单一污染条件下敏感.在自然界中,复合污染是一种普遍存在的现象,而污染土壤中的复合污染程度更加复杂,生物对此毒性响应也将更加敏感.Chang 等[2,9]用蚯蚓对处理前后的土壤进行毒理诊断时发现,它可明显指示不同处理土壤毒性的差别.参考文献1　Cai D 2M (蔡道基).1999.Study on environmental toxicology ofpesticides.Beijing :China Environmental Sciences Press.168～174(in Chinese )2　Chang L W ,Meier J R ,Smith M K.1997.Application of plant andearthworm bioassays to evaluate remediation of a lead 2contaminated soil.A rch Envi ron Toxicol ,32:166～1713　Guo Y 2C (郭永灿),Wang Z 2Z (王振中),Zhang Y 2M (张友梅),etal .1996.Studies on toxicity and 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