酵母RNA 的提取、鉴定和定量测定实验十
生物化学实验-- 酵母RNA的提取及
2.鉴定：取上述RNA约0.5g，加10%硫酸5ml,加热至沸1—2分钟， 将RNA水解。
1)水解液2ml，加入氨水2ml和5%硝酸银溶液1ml，观察是否产生 絮状嘌呤银化合物,有时沉淀出现比较慢,需要静止10几分钟。
2)取水解液0.5mL,加苔黑酚-三氯化铁试剂1mL，加热至沸1min,观
察颜色变化。
注意事项：离心的时候，要两两对称放置，且离心管中溶液的量基 本一样。否则会遭成离心机转子的损坏。
下次试验：DNA定量测定（二苯胺法）
实验十、酵母RNA的提取及鉴定
一、原理
酵母核酸中RNA含量较多，DNA含量则少于
2%。 RNA可溶于碱性溶液，当碱被中和后，可加 乙醇使其沉淀，有此可得粗RNA制品。
1. 2. 3. 4. 5.
二、实验仪器 离心机 水浴锅 电炉 烧杯 量筒
三、实验试剂
1. 2. 3.
干酵母粉 0.2%氢氧化钠溶液：2g氢氧化钠溶于蒸馏水并稀释至1000ml。 乙酸
4.
5. 6. 7. 8.
95%乙醇
无水乙醚 10%硫酸
氨水
5%硝酸银溶液：5g硝酸银溶于蒸馏水并稀释至100：称取2g干酵母粉于100ml烧杯中，加入0.2%氢氧化钠 溶液10ml，沸水浴加热30分钟，经常搅拌（如沸水浴过程中溶液蒸 干可再加5~10ml氢氧化钠）。然后加入乙酸数滴，使提取液呈酸性 （pH试纸检验），离心10-15分钟（4000r.p.m）。
酵母RNA的提取实验报告
酵母RNA的提取实验报告实验报告：酵母RNA的提取一、实验目的1.学习和掌握酵母RNA的提取基本原理和方法。
2.了解RNA在生物体内的生物功能及其重要性。
3.培养实验技巧和操作能力，提高实验素养。
二、实验原理RNA（核糖核酸）是生物体内的重要生物分子之一，它参与蛋白质合成、基因表达等重要生命活动。
酵母是一种常用的真核生物模型，其RNA提取方法与人体、植物等真核生物类似。
本实验采用氯仿-异戊醇法提取酵母RNA。
主要步骤包括细胞破碎、离心分离、有机溶剂抽提、乙醇沉淀等。
三、实验步骤1.准备试剂和器材（1）试剂：氯仿、异戊醇、无水乙醇、DEPC水、RNA酶。
（2）器材：研钵、离心管、移液器、玻璃棒、氮气吹干器、分光光度计等。
2.酵母细胞破碎（1）在冰上用研钵将酵母细胞研磨成粉末。
（2）加入适量DEPC水，搅拌均匀。
（3）用玻璃棒将细胞碎片挑出，弃去上清液。
（4）加入适量DEPC水，搅拌均匀，重复上述步骤，直到细胞完全破碎。
3.离心分离（1）将破碎的酵母细胞溶液转移到离心管中。
（2）在4℃下，以12000rpm的转速离心15分钟。
4.有机溶剂抽提（1）用移液器将上清液小心地转移到另一个离心管中。
（2）加入等体积的氯仿-异戊醇混合液（氯仿：异戊醇=24：1），用玻璃棒搅拌均匀。
（3）在4℃下，以12000rpm的转速离心15分钟。
5.乙醇沉淀（1）将上清液转移到新的离心管中，并加入等体积的无水乙醇，用玻璃棒搅拌均匀。
（2）在4℃下，以12000rpm的转速离心15分钟。
6.洗涤和干燥（1）用移液器小心地将上清液吸出，留下沉淀物。
（2）加入适量75%乙醇，用玻璃棒搅拌均匀，去除残留的乙醇和水分。
（3）在氮气吹干器下将沉淀物吹干约5分钟。
7.RNA溶解与定量（1）加入适量DEPC水，将沉淀物溶解。
（2）用分光光度计测定RNA溶液的吸光度值（A260nm），计算RNA浓度。
四、实验结果与分析表1：酵母RNA提取结果本实验通过氯仿-异戊醇法成功地提取出了高浓度的酵母RNA。
酵母RNA 的提取(浓盐法)及成分鉴定
酵母RNA的提取（浓盐法）及成分鉴定一、实验目的：1、掌握浓盐法提取RNA的原理和方法。
2、理解等电点沉淀分离两性物质的原理和基本操作。
3、掌握钼蓝反应的原理，了解戊糖和嘌呤检验的原理。
二、实验原理：1、浓盐法提取酵母RNA：酵母中RNA含量特别多，约占干重的3～10％，DNA含量很少，约占干重的0.5％或更少，且菌体容易收集（即可利用发酵工业的下脚料），因此多采用酵母来提取RNA。
；本实验采用工业上常用的浓盐法，其基本原理是在浓盐加热的条件下酵母细胞壁通透性增加或发生破损，且加热又可使酵母中蛋白质变性沉淀，使RNA以可溶性钠盐的形式游离析出。
离心去除菌体，将上清液调至RNA的等电点（pH2～2.5），使RNA沉淀析出，离心收集沉淀。
2、RNA成分鉴定:RNA酸解，其水解产物含有碱基+核糖+磷酸；碱基（嘌呤）：磷酸：核糖：戊糖在约12％的盐酸中可以发生脱水缩合成为糠醛，糠醛可与5-甲基间苯二酚(又称苔黑酚、地衣酚)缩合生成蓝绿色的物质。
该反应用于检验戊糖的存在。
三、实验步骤：1.浓盐法提取酵母RNA（1）RNA的提取：取干酵母一包（约1～2g）放入100mL锥形瓶内，加入10％NaCl溶液30mL，搅匀后将锥形瓶固定在水浴锅内，于沸水浴中加热40分钟。
（2）RNA的离心分离：将上述锥形瓶从沸水浴中取出，立即用自来水冷却至室温。
然后将锥形瓶内溶液倒入离心管，平衡后3000转／分离心10分钟,收集上清液。
（3）RNA的收集：将上清液小心倾入50mL烧杯内，在冰浴中冷却。
用6mol/LHCl溶液调pH值至RNA的等电点2.0～2.5（一滴一滴的加入，边加边搅拌，随着pH下降，白色RNA沉淀逐渐增加，至等电点时沉淀最多）。
静置冰浴中5分钟使沉淀完全，颗粒变大。
再经3000转／分离心10分钟，收集沉淀。
2.RNA成分鉴定（1）溶解RNA：在离心所得的含RNA的离心管中加入1滴蒸馏水，用玻棒把RNA搅成糊状，再加入蒸馏水至mL，然后一边搅拌一边加入5%氨水1滴，将溶液调至pH=6，使白色RNA沉淀完全溶解，成为RNA溶液。
酵母rna的提取实验报告
酵母rna的提取实验报告酵母RNA的提取实验报告引言：RNA是一种重要的生物分子，它在细胞内承担着转录和翻译的重要功能。
在分子生物学研究中，提取RNA是一项常见的实验操作。
本实验旨在通过提取酵母细胞中的RNA，探究RNA的提取方法和应用。
材料与方法：1. 实验材料：酵母细胞、细胞裂解缓冲液、RNA提取试剂盒、异丙醇、氯仿、异丁醇、乙醇、载玻片、显微镜等。
2. 实验步骤：a. 酵母细胞的培养与收获：将酵母细胞培养于培养基中，通过离心将细胞收获。
b. 细胞裂解：将收获的细胞用细胞裂解缓冲液裂解，以释放RNA。
c. RNA提取：使用RNA提取试剂盒，按照说明书中的步骤进行RNA提取。
d. 纯化RNA：通过异丙醇沉淀和氯仿萃取，去除DNA和蛋白质等杂质。
e. 洗涤与干燥：使用异丁醇和乙醇进行洗涤，最后将RNA干燥。
f. 检测RNA：将提取得到的RNA溶解于适当的缓冲液中，使用紫外可见光谱仪或显微镜观察RNA的浓度和纯度。
结果与讨论：通过上述实验步骤，我们成功地提取到了酵母细胞中的RNA。
在实验过程中，我们注意到以下几点：1. 细胞裂解的缓冲液选择：细胞裂解缓冲液的选择对RNA提取至关重要。
合适的缓冲液可以有效地破坏细胞膜，释放细胞内的RNA。
在本实验中，我们选择了一种经充分验证的缓冲液，以确保细胞能够完全裂解。
2. RNA提取试剂盒的使用：RNA提取试剂盒是一种常用的RNA提取方法。
它通过特定的试剂和离心步骤，将RNA从细胞裂解物中分离出来。
在本实验中，我们按照试剂盒的说明书进行操作，成功地提取到了RNA。
3. RNA的纯化：RNA的纯化是为了去除细胞裂解物中的杂质，如DNA和蛋白质。
在本实验中，我们使用了异丙醇沉淀和氯仿萃取的方法，成功地纯化了RNA。
这些方法可以有效地去除DNA和蛋白质，提高RNA的纯度。
4. RNA的检测：在实验中，我们使用紫外可见光谱仪或显微镜对提取得到的RNA进行检测。
通过观察RNA的浓度和纯度，我们可以评估提取的RNA是否适用于后续的实验操作。
酵母RNA分离和定量测定(“鉴定”相关文档)共10张
➢ 量取上清，缓缓加入2倍体积的95%乙醇，边倒边搅，待沉淀完全 （静置片刻），再离心，3000r，3min，弃上清。向沉淀中加适量95% 乙醇（10mL）搅散转移到布氏漏斗抽干，重复一次。用乙醚洗沉淀2次。 干滤渣即RNA粗制品，称量并记录总量（M）。
➢ 准确称量50mg干滤渣（M2）用于苔黑酚法测RNA含量，其余的干 滤渣用于以下鉴定
五、实验操作
2. 鉴定
将用于鉴定的干滤渣转移到锥形瓶中，加入10%H2SO4 5mL，煮沸 （ （（用用1232））试）试mi核嘌磷 管管n后糖呤酸取取鉴1碱1mm定LL水水组解解分液液。，，加加入入2m1Lm氨L定水磷，试再剂加，沸入水1m浴L ，Ag观NO察，观察 p嘌干利掌干磷核用核6向稀准嘌R分学称 p布嘌嘌分布R掌 R稀62%H7H7NNN呤滤用握滤酸糖试糖沉碱确呤光会8氏呤呤光氏握碱--试 试AAAN11g与 渣 等 R渣 与 在 管 在 淀 法 称 与 光 用 漏 与 与 光 漏 R法00水干 水水a纸纸%%NNO硝即电即钼浓取浓中提量硝度苔斗硝硝度斗提解酵 解解（（AA））H酸R点R酸盐1盐加取5酸计黑及酸酸计及取提 产 母产 提产55，，4m0NN--银控铵酸酸适的银（酚抽银银（抽的0取生于 生取 生m77LAARRm））g水共制试中中量共法滤共共滤R66R的的的的 的粗粗2NNL干775NNAA解热剂，，热测装热热装R9沸原核核原 核制制000AA滤5可可nnN液产作与与产定置产产置水m理糖糖理 糖为为品品%mmA渣溶溶L，生用苔苔生生生R乙浴））及、、及 、析 变 变，，锥（于于N加嘌产黑黑嘌嘌嘌醇3比比方嘌嘌方 嘌出性性称称A形M0碱碱入呤生酚酚呤呤呤（色色法呤呤法 呤R含Rm时量量2瓶性性NN）i2盐磷（（盐盐盐1皿皿。碱碱。 碱量，并并n，mAA溶溶0，用基钼基基基3344和和和。应记记m，，L加,,液液00常55于氨L银酸银银银磷磷磷严录录个个可可--入），，搅二二苔水化，化化化酸酸酸格总总用用0搅再再拌羟羟黑，合后合合合.可可可控量量于于散用用。甲甲酚再物者物物物用用用制（（RR转乙乙苯苯法加NN的在的的的下下下MpM移醇醇AAH））测入））白还白白白述述述组组。到沉沉及及R1。。色原色色色方方方分分m布淀淀N高高絮剂絮絮絮法法法L鉴鉴A氏得得铁铁状抗状状状A含鉴鉴鉴定定漏到到g盐盐沉坏沉沉沉量定定定N及及斗RR酸酸O淀血淀淀淀，：：：NN单单抽3试试。酸。。。AA其，核核干粗粗剂剂（余观苷苷，制制共共或的察酸酸重品品热热硫干制制复。。产产酸滤备备一生生亚渣，，次特特铁用不不。殊殊）于能能的的的以作作绿绿作下为为色色用鉴RR（（下定NN66AA形77生生00成nn物物mm蓝活活定定色性性量量的实实））钼验验。。蓝材材（料料6。。603nm定量）。
酵母rna的提取实验报告
酵母rna的提取实验报告酵母RNA的提取实验报告。
实验目的，通过实验研究酵母RNA的提取方法，为后续的基因表达调控研究提供技术支持。
实验材料与方法：1. 实验材料，酵母细胞培养物、TRIzol试剂、异丙醇、氯仿、乙醇、DEPC水等。
2. 样品制备，取酵母培养物，离心收集酵母细胞，冰上洗涤去除培养基。
3. 细胞破碎，向酵母细胞中加入TRIzol试剂，用离心管摇匀，静置离心管5分钟。
4. RNA提取，加入氯仿，摇匀，离心分离上清液，上清液转移至新离心管中，加入异丙醇沉淀RNA。
5. RNA沉淀，离心沉淀RNA，弃上清液，加入乙醇洗涤RNA，再次离心沉淀RNA。
6. RNA溶解，用DEPC水溶解RNA，测定纯度和浓度。
实验结果：1. 细胞破碎，经过加入TRIzol试剂处理后，酵母细胞成功破碎，形成混浊的混合液。
2. RNA提取，通过氯仿萃取法，成功分离出上清液中的RNA，得到透明的上清液。
3. RNA沉淀，加入异丙醇后，观察到RNA在离心管底部形成白色沉淀。
4. RNA溶解，最终得到溶解度较高的RNA样品，纯度和浓度符合实验要求。
实验分析：本次实验采用的酵母RNA提取方法较为简单，通过TRIzol试剂的使用，成功实现了酵母细胞的破碎和RNA的提取。
氯仿的加入有效分离出RNA，异丙醇的沉淀步骤也取得了良好的效果。
最终得到的RNA样品纯度高，浓度适宜，可以用于后续的实验研究。
实验结论：本实验成功建立了一种适用于酵母细胞的RNA提取方法，为后续的基因表达调控研究提供了可靠的技术支持。
该方法操作简便，提取效果良好，适用于大规模样品的提取工作。
参考文献：1. Chomczynski P, Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem. 1987Apr;162(1):156-9.2. Schmitt ME, Brown TA, Trumpower BL. A rapid and simple method for preparation of RNA from Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Res. 1990 Jan25;18(10):3091-2.。
酵母RNA 的提取、鉴定和定量测定实验
用蒸馏水定容到刻度，混匀。取1.0 ml样品液稀释40
倍后，分别取2份2.0 ml的稀释液，加入2.0 ml的地衣 酚试剂，混匀，与标准曲线的各管同时臵沸水浴中加 热45分钟，冷却，测定O.D 670。
（3）RNA含量的计算 根据测得的O.D值，从标准曲线上查出相对应的 RNA含量，按下式计算出制品中RNA的百分含量：
核酸的分布
DNA：细胞核（95%） 细胞器（5%） RNA：细胞质（75%) 细胞核(10%) 细胞器(15%)
RNA以rRNA的数量最多（80％-85%)
核酸提取的主要步骤
破碎细胞
去除与核酸结合的蛋白质以及多糖、脂类等
生物大分子
去除其它不需要的核酸分子
沉淀核酸，去除盐类，有机溶剂等杂质
管号
试剂 标准RNA溶液 （ml） (100g/ml) 蒸馏水（ml） 地衣酚试剂 （ml） 0 1 2 3 4 5
0
2.0
0.4
1.6
0.8
1.2
1.2
0.8
1.6
0.4
2.0
0
2.0
2.0
2.0
2.0
2.0
2.0
（2）样品的测定 准确称取0.1 g提取的酵母RNA，放入小烧杯中，加少 量蒸馏水调成糊状，溶解，若不溶，则滴入少量5%-6% 氨水助溶，调pH至7.0，小心转移到25 ml容量瓶中，
醋酸纤维薄膜电泳装臵示意图
1. 滤纸桥 2. 电泳槽 3. 醋酸纤维素薄膜 4. 电泳槽膜支架 5. 电极室中央隔板
3．电泳
将点样后的膜条臵于电泳槽架上，放臵时， 无光泽面(即点样面)向下，点样端臵于负极，槽 架上以双层滤纸作桥垫，滤纸的一端与支架的前 沿对齐，另一端浸入电极槽的缓冲液中。用缓冲 液将滤纸全部浸润并驱除气泡。膜条与滤纸需贴 紧，待平衡5 min后通电，电压为160 V，电流为 0.4～0.7 mA/cm，通电30 分钟左右关闭电源。
酵母rna提取实验报告
酵母rna提取实验报告酵母RNA提取实验报告引言RNA提取是分子生物学研究中的重要步骤，它可以用于分析基因表达、克隆和测序等多种应用。
酵母RNA作为一种常见的模式生物体，在研究中也经常需要进行RNA提取实验。
本实验旨在通过酵母细胞提取RNA的方法，探索酵母RNA的纯化和分析技术。
材料和方法1. 酵母细胞培养液2. 离心管3. 离心机4. 细胞破碎液5. 氯仿6. 异丙醇7. 乙醇8. DEPC水9. 热盖式混合器10. 磁珠11. 离心管架12. 离心管架13. 紫外可见分光光度计实验步骤1. 收集酵母细胞并离心2. 加入细胞破碎液并用热盖式混合器破碎细胞3. 加入氯仿并离心，收集上清液4. 加入异丙醇和磁珠，混合悬浮5. 使用离心管架将磁珠沉淀，去除上清液6. 加入乙醇洗涤磁珠7. 用DEPC水溶解RNA8. 使用紫外可见分光光度计检测RNA浓度和纯度结果通过本实验方法，成功提取了酵母细胞中的RNA，并且得到了较高的纯度和浓度。
实验结果表明，所提取的RNA可用于后续的实验分析和研究。
讨论本实验采用了经典的酵母RNA提取方法，通过破碎细胞、沉淀RNA、洗涤和溶解等步骤，成功地提取了酵母细胞中的RNA。
实验结果表明，所提取的RNA具有较高的纯度和浓度，可以满足后续实验的需要。
然而，也需要注意到在实验过程中可能存在的污染和损失，需要进一步优化实验条件和技术。
结论通过本次实验，我们成功地提取了酵母细胞中的RNA，并得到了较高的纯度和浓度。
这为我们进一步研究酵母基因表达和调控提供了重要的实验基础。
同时，也为其他研究人员在酵母RNA提取方面提供了一种可靠的实验方法和参考。
总结酵母RNA提取实验是分子生物学研究中的重要步骤，通过本次实验，我们成功地提取了酵母细胞中的RNA，并得到了较高的纯度和浓度。
这为我们的研究提供了重要的实验基础和技术支持。
希望通过我们的努力，能够为相关领域的研究工作做出一定的贡献。
酵母rna的提取实验报告
酵母rna的提取实验报告实验目的：本实验旨在通过提取酵母细胞中的RNA，研究酵母细胞的基因表达情况。
实验步骤：1. 准备工作：将所需试剂及设备准备好。
包括酵母细胞培养液、收集酵母细胞的离心管、琼脂糖、Rnase-free水、DTE溶液、Tris-HCl缓冲液、氯仿、异丙醇、盐溶液等。
2. 收集酵母细胞：将酵母培养液离心，将细胞沉淀至离心管中。
使用离心机将细胞沉淀。
3. 细胞破碎：向离心管中加入30μL DTE溶液，充分混合。
将离心管置于冰上，加入等体积的琼脂糖。
轻轻翻转管子，使细胞与琼脂糖充分混合。
继续在冰上离心。
4. 分层：将离心管放入冰上15分钟，离心10000g，4°C，15分钟，将上清转移至新离心管中。
5. 分液：加入等体积的Tris-HCl缓冲液，混合均匀。
加入等体积的氯仿，轻轻翻转混合。
在冰上离心15分钟，以分离上层水相和下层有机相。
6. 收集RNA：将上层水相转移至新离心管中，加入等体积的异丙醇，充分混合。
在-20°C放置30分钟，使RNA充分沉淀。
离心12000g，4°C，15分钟，将上清抽离。
7. 洗涤：加入70%乙醇洗涤一次，离心12000g，4°C，5分钟，弃上清。
重复此步骤一次。
8. 干燥：将离心管开盖，室温下干燥15分钟。
加入Rnase-free水，重悬RNA。
实验结果：完成实验后，得到1μg/μL浓度的酵母RNA。
使用NanoDrop 光度计检测RNA纯度，A260/A280比值为2.0，显示RNA被成功提取。
使用琼脂糖凝胶电泳分析酵母RNA，显示主要为2个明显的条带，符合预期。
实验结论：本实验成功地提取了酵母细胞中的RNA，并证实RNA的纯度和完整性。
这为进一步研究酵母细胞的基因表达提供了基础。
酵母RNA的提取及组份鉴定与核酸的定量测定
酵母RNA的提取及组份鉴定与核酸的定量测定————————————————————————————————作者：————————————————————————————————日期：实验酵母RNA的提取及组份鉴定与核酸的定量测定【课前预习】1. 为什么用稀碱溶液可以使酵母细胞裂解？2．如何从酵母中提取到较纯的RNA?3．干扰RNA的提取的物质有哪些并设计排除这些干扰的实验。
4．干扰紫外线（UV）吸收法测定核酸浓度实验的物质有哪些？【目的要求】1. 了解并掌握稀碱法提取RNA的原理和方法。
2. 了解核酸的组分并掌握其鉴定方法。
3. 学习紫外线（UV）吸收法测定核酸浓度的原理。
【基本原理】由于RNA的来源和种类很多，因而提取制备方法也很各异。
一般有苯酚法、去污剂法和盐酸胍法。
其中苯酚法又是实验是最常用的。
组织匀浆用苯酚处理并离心后，RNA即溶于上层被酚饱和的水相中，DNA和蛋白质则留在酚层中。
向水层加入乙醇后，RNA即以白色絮状沉淀析出，此法能较好的除去DNA和蛋白质。
上述方法提取的RNA具有生物活性。
工业上常用稀碱法和浓盐法提取RNA，用这两种方法所提取的核酸均为变性的RNA，主要用作制备核苷酸的原料，其工艺比较简单。
浓盐法使用10%左右氯化钠溶液，90℃提取3-4h，迅速冷却，提取液经离心后, 上清液用乙醇沉淀RNA。
稀碱法使用稀碱使酵母细胞裂解，然后用酸中和，除去蛋白质和菌体后的上清液用乙醇沉淀RNA或调pH2.5利用等电点沉淀。
酵母含RNA达2. 67-10.0%，而DNA含量仅为0.03-0.516%，为此，提取RNA多以酵母为原料。
RNA含有核糖、嘌呤碱、嘧啶碱和磷酸各组分。
加硫酸煮可使RNA水解，从水解液中可用定糖，定磷和加银沉淀等方法测出上述组份的存在。
核酸及其衍生物，核苷酸、核苷、嘌呤和嘧啶有吸收UV的性质，其吸收高峰在260nm波长处。
核酸的摩尔消光系数（或称吸收系数）用来表示。
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2、器材
（1）电子天平 （2）电热套 （3）三角烧瓶 （4）烧杯 （5）高速冷冻离心机 （6）滴管 （7）抽滤瓶 （8）离心管 （9）恒温水浴箱 （10）吸量管 （11）紫外分光光度计 （12）表面皿 （13）量筒 (14）容量瓶 （15）擦镜纸 （16）比色皿 （17）玻棒 （18）定量滤纸 （19）试管 （20）布氏漏斗 （21）真空泵 （22）电泳仪 （23）紫外检测仪（24）可见光分光光度计 （25）托盘天平 （26）电泳槽 (27)0.5-5.0精密pH试纸
RNA的定量分析之二：
紫外吸收法测定核酸浓度
操作方法
用分析天平准确称取待测的样品RNA0.150g，
加入少量的蒸馏水调成糊状，再加入少量的水稀 释。用5%---6%的氨水调至pH值为7.0，定容到10 ml(RNA的鉴定三和四皆用该溶液,不过要稀释200 倍)。
取两支离心管，向第一支管中加入2 ml 样品溶液和2 ml蒸馏水。第二支管中加入2 ml样品溶液和2 ml沉淀剂。混匀。
稀碱法是用氢氧化钠使酵母细胞壁变性、 裂解，然后用酸中和，除去蛋白质和菌体 后的上清液用乙醇沉淀RNA或调pH2.5利用 等电点沉淀。提取的RNA有不同程度的降解。
浓盐法是用高浓度盐溶液处理，同时加 热，以改变细胞壁的通透性，使核酸从细 胞内释放出来。
RNA提取方法方法与分类
稀碱法( 0.2% NaOH ) 10% NaCl )
四、实验方法
RNA的提取的操作
3、 RNA提取方法(浓盐法)
提取方案： ①取 12 g活性干酵母,臵150 ml锥形瓶中， 加入60 ml蒸馏水，混匀； ②倒入7 g NaCl，溶解后，沸水浴1 h；
③3500 rpm离心8 min，将上清倒入50 ml 烧杯中， 4)用HCl调节pH，至2.0～2.5；
倍,取3 ml于比色皿中分别在260nm、280nm处测定其光吸 收值（OD1、OD2） 根据测得的OD值判断提取的RNA的纯度。
1、推入黑体遮光预热
剂 i ]
UV-2000
2、 在 “T” 位置调 “0”
4、按到 “A” 位置测定
3、在 “T” 位置调 “100”
RNA的鉴定之二：
醋酸纤维素薄膜电泳分离鉴定
倍后，分别取2份2.0 ml的稀释液，加入2.0 ml的地衣 酚试剂，混匀，与标准曲线的各管同时臵沸水浴中加 热45分钟，冷却，测定O.D 670。
（3）RNA含量的计算 根据测得的O.D值，从标准曲线上查出相对应的 RNA含量，按下式计算出制品中RNA的百分含量：
RNA%=
待测液中测得的浓度g / ml 100 待测液中制品的浓度g / ml
浓盐法(
苯酚法 氯仿-异戊醇法 去污剂法 盐酸胍法
三、试剂和器材
1、试剂 （1）干酵母粉 （2） RNA标准溶液（100微克/毫升） （8） 5%硝酸银溶液 （9）钼酸铵试剂2克钼酸铵溶解在100毫升10% 硫酸中。 （10）地衣酚试剂：100毫升浓盐酸加入100毫克三氯化铁，摇匀， 贮存备用，使用前加入100毫克地衣酚。 （11） NaCl （12） 95%乙醇 （13） 6 mol/l HCl （14）高氯酸 （15）氯化锂 （16）硼酸缓冲液（pH-3.5） （17）磷酸缓冲液（pH-7.5）
RNA鉴定之一：组成基团的鉴定
RNA含有核糖、嘌呤碱、嘧啶碱和磷酸组分，
加硫酸煮沸可使其水解，用硝酸银、地衣酚
和定磷试剂可分别鉴定嘌呤碱、核糖和磷酸
组分。 A、嘌呤鉴定：
RNA H2SO4 100℃
嘌呤
AgNO3
嘌呤银化物
（白色或红棕色）
实验步骤: 取适量0.05 g提取的RNA，加10%硫酸液3 ml， 放在沸水浴中加热5分钟，制成RNA水解，做 以下鉴定
A、核糖鉴定：
RNA H2SO4 100℃
λmax=670 nm
（1）标准曲线的制作 取6支试管，7按下表编号及加入试剂，加毕混匀，臵沸水浴 中加热45 min，取出冷却，于670nm波长处测定光密度值。
管号
试剂 标准RNA溶液 （ml） (100g/ml) 蒸馏水（ml） 地衣酚试剂 （ml） 0 1 2 3 4 5
1、RNA的碱水解： 称取0.15克RNA，溶于5 mL 0.3 mol/L 氢氧化钾溶液中，使RNA的浓度达到20-30 mg/ml。沸水浴30 min 或者在37℃水解18 个小时。将水解液转移到椎形瓶中。冰浴 中用高氯酸溶液将水解液滴定到pH3.5。 2000r/min 离心10 min，上清液即是样品 液。
均匀可用于电泳。 （2）醋酸纤维素薄膜电泳常选用pH8.6巴比妥－巴比 妥钠缓冲液，其浓度为0.05－0.09mol/L。选择何种浓 度与样品和薄膜的厚薄有关。缓冲液浓度过低，则区
带泳动速度快，区带扩散变宽；缓冲液浓度过高，则
区带泳动速度慢，区带分布过于集中，不易分辨。
（3）点样时，应将薄膜表面多余的缓冲液用 滤纸吸去，以免引起样品扩散。但不宜太 干，否则样品不易进入膜内，造成点样起 始点参差不起，影响分离效果。 （4）点样时，动作要轻、稳，用力不能太大，
核酸的分布
DNA：细胞核（95%） 细胞器（5%） RNA：细胞质（75%) 细胞核(10%) 细胞器(15%)
RNA以rRNA的数量最多（80％-85%)
核酸提取的主要步骤
破碎细胞
去除与核酸结合的蛋白质以及多糖、脂类等
生物大分子
去除其它不需要的核酸分子
沉淀核酸，去除盐类，有机溶剂等杂质
综合实验 酵母RNA的提纯及其定
性鉴定 与定量测定
实验目的
1、学习RNA提取的几种常用方法并掌握浓盐法提
取RNA的原理和方法。
3、掌握几种定性鉴定所得RNA的原理与方法。
4、掌握两种定量测定所得RNA的原理和方法。
5、学习电泳技术的基本原理及其分类以及相关的
应用。
Ⅰ 提纯部分
浓盐法提取酵母RNA
２、准备与点样
(1)将薄膜切成2.5 cm×8 cm的小片。在薄膜无光 泽面(正面)的一端约2 cm处用硬铅笔划一点样线。
(2)将薄膜无光泽面向下，臵PH 3.5,0.02 mol/L的 柠檬酸缓冲液中浸湿。
(3)将充分浸透的膜条取出，用滤纸吸去多余的缓冲 液，把膜条臵洁净玻璃板上，无光泽面朝上。用点 样器在距膜条一端2-3cm处点样。
些？
3、简述浓盐法提取RNA过程中的关键步骤及注 意事项。
RNA含量测定之一：地衣酚法
RNA的地衣酚法定量测定原理
RNA含量测定之一：地衣酚法测定。
反应原理：当RNA与浓盐酸共热时，即发生降解，
形成的核糖继而转变成糠醛，后者与3，5-二
羟基甲苯（地衣酚 orcinol）反应，在Fe3+或
Cu2+催化下，生成鲜绿色复合物。反应产物在 670 nm处有最大吸收。RNA浓度在20250μg/ml范围内，光密度与RNA浓度成正比。
在冰浴中放臵30分钟，然后离心10分钟， 3000转/分钟。 从各管中取出0.25 ml上清液，用蒸馏 水定容到25 ml。 于260nm处测定其光吸收值（OD1、OD2）
将样品放于紫外分光光度计上测定260nm, 计算核酸浓度。
OD1—OD2 RNA% =
0.022
×100
样品浓度
式中：OD260为260nm波长处光密度读数；L 为比色杯的厚度；0.022为每毫升溶液内含 1微克RNA的光密度。
4．记录结果
通电完毕后用镊子将薄膜取出，于紫外灯
下观察，用铅笔将吸收紫外光的暗斑圈出。 在实验报告上绘出RNA水解液的醋酸纤维素 薄膜电泳图谱，并分析确定各斑点代表那种核 苷酸。
注意事项
（1）市售醋酸纤维素薄膜均为干膜片，薄膜的浸润与
选膜是电泳成败的关键之一。若飘浮于液面的薄膜在
15－30s内迅速润湿，整条薄膜色泽深浅一致，则此膜
核酸分离纯化原则
保证核酸一级结构的完整性 排除其它分子的污染 简化操作，缩短时间，以减少各种有害因素对 核酸的破坏
减少化学因素对核酸的降解(pH4-10) 减少物理因素对核酸的降解(机械剪切力 、 高
温)
防止核酸的生物降解(DNA酶 、 RNA酶)
实验原理
由于RNA的来源和种类很多，因而提取制备方法也各异， 一般有苯酚法、去污剂法和盐酸胍法。其中苯酚法又是实 验室最常用的。组织匀浆用苯酚处理并离心后，RNA即溶 于上层被苯酚饱和的水相中，DNA和蛋白质则留在苯酚层 中，向水层加入乙醇后，RNA即以白色絮状沉淀析出。此 法能较好地除去DNA和蛋白质，提取的RNA具有生物活性。 酵母细胞富含核酸，且核酸主要是RNA，含量为干菌体 的2.67%-10.0%，而DNA含量较少，仅为0.03%-0.516%。为 此提取RNA多以酵母为原料。工业上制备RNA多选用低成本、 适于大规模操作的稀碱法或浓盐法。这两种方法所提取的 核酸均为变性的RNA，主要用作制备单核苷酸的原料，其 工艺比较简单。
醋酸纤维薄膜电泳装臵示意图
1. 滤纸桥 2. 电泳槽 3. 醋酸纤维素薄膜 4. 电泳槽膜支架 5. 电极室中央隔板
3．电泳
将点样后的膜条臵于电泳槽架上，放臵时， 无光泽面(即点样面)向下，点样端臵于负极，槽 架上以双层滤纸作桥垫，滤纸的一端与支架的前 沿对齐，另一端浸入电极槽的缓冲液中。用缓冲 液将滤纸全部浸润并驱除气泡。膜条与滤纸需贴 紧，待平衡5 min后通电，电压为160 V，电流为 0.4～0.7 mA/cm，通电30 分钟左右关闭电源。
310 nm)下的OD值,以不同波长为横坐标, OD值为纵坐标绘制