标准曲线的绘制ppt课件
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标准曲线制作、检验、使用知识大全
每个标准点至少重复2次，这个重复是指从稀释开始。
标准曲线的截距检验和斜率检验分别考察 Y=a+bX中a和b与0的统计学差异，a与0有差 别说明有试剂空白或系统误差，而b若与0没差 别说明仪器的灵敏度根本达不到分析要求。日 常工作中我们通常用相关系数来作为标准曲线 好坏的标准，这点有一定道理，但并不全面。
每个标准点至少重复2次，这个重复010《基于标准样 品的线性校准》中关于失拟检验的问题，这 里的失拟检验是要看曲线拟合后剩下残差与 实验数据本身随机误差（变异）之间的差别， 同样采用F检验，此时失拟检验P应该>0.05， 也就是说残差应该跟实验测定中的随机误差 （变异）没有差别，你要看每次测定的随机 误差（变异）就必须多次测定同一浓度，因 此失拟检验要求每个浓度点至少重复2次。
标准曲线需要减掉试剂空白来 做吗？
先从原理上讲：判断两条或多条 标准曲线的差异，须检验残差， 截距和斜率三项，分别有不同的 统计学参数，残差用F检验，截 距和斜率采用较为复杂的统计量。
从实际操作讲：多用协方差分析检验截距和斜率的差异，以 SPSS为例：
一．先重新整理数据,将y2数据列加到y1下面,变成一个变量y;将x2数据列加到x1下面,变成一个变量x; 然后再设定一个新的分组变量group,原来第1组值为1,第2组值为2。 二．
决定系数是相关系数的平方，就是我们经常在 仪器软件中看到的R2或Fit，它提示的是我建立 的回归方程所解释X对Y变化占Y变量的比值， 比如决定系数是0.99也就是说我这个回归方程 可以解释Y变化的99%，剩下的1%就是残差。 前面提到的精密度（线性检验）就是用这两部 分的变化做F检验，由于统计检验的临界值比 较大，通常0.90以上的相关系数都会通过这个 F检验，当然还与实验点数（自由度）有关。
化学实验基础知识PPT课件
表格法
适用于大量数据的整理和表达， 能清晰展示各组数据间的对比关
系。
图形法
直观展示数据间的变化趋势和规 律，便于分析和理解。常用图形 包括柱状图、折线图、散点图等。
文字描述法
对实验结果进行概括性描述和分 析，阐述实验结论和意义。应结 合图表进行解释和说明，增强表
达效果。
THANK YOU
根据实验需求选择合适的搅拌器，如玻璃棒、磁力搅拌器等。
根据实验需求控制搅拌速度，避免产生过多的气泡或溅出。
搅拌、过滤和蒸发操作要点
选择合适的滤纸
根据实验需求选择合适的滤纸，如慢速滤纸、中速滤纸等。
折叠滤纸
将滤纸折叠成合适的形状，放入漏斗中，用水润湿并贴紧 漏斗内壁。
搅拌、过滤和蒸发操作要点
• 过滤操作：将待过滤的液体沿玻璃棒慢慢倒入漏斗中，注 意液面不要超过滤纸边缘。
仪器的准备
标准溶液的配制
按照准确称量的基准物质的质量，配 制一定浓度的标准溶液。
准备好滴定管、容量瓶、移液管等仪 器，并进行校准。
滴定分析法原理及操作过程
待测溶液的取样和处理
准确移取一定体积的待测溶液，并进行必要 的预处理。
终点判断
根据指示剂的颜色变化或电位突跃等信号判 断滴定终点。
滴定操作
将标准溶液逐滴加入待测溶液中，同时搅拌 并观察反应现象。
待测溶液的取样和处理
准确移取一定体积的待测溶液，并进 行必要的预处理。
吸光度或发光强度的测定
将待测溶液置于比色皿中，在分光光 度计上选择合适的波长和测量模式， 测定其吸光度或发光强度。
数据处理
根据标准曲线和待测溶液的吸光度或 发光强度计算待测组分的含量。
06
实验数据处理与结果表 达技巧
总糖和还原糖的测定及葡萄糖标准曲线的绘制-3,5-二硝基水杨酸法
2、样品中总糖的水解、提取
准确称取0.2g山芋粉置于100ml三角烧瓶中
加3ml蒸馏水，调成糊状
取1～2滴于六凹 反应盘中，加1滴 I2-KI溶液，如果 完全不显蓝色，
即可进行下面的 操作。
再加12ml蒸馏水，5ml 6mol/L HCl 沸水浴，30min (不时搅拌)
冷却至室温 用6mol/L NaOH调pH7.0（ pH试纸）
五、操作
1、样品中还原糖的提取
准确称取0.5g山芋粉置于100ml三角烧瓶中
加3ml蒸馏水，调成糊状 再加30ml蒸馏水
50℃水浴，30min (不时搅拌)
转移至50ml离心管中，4000rpm，5min
上清液1 沉淀
加20ml蒸馏水，洗涤沉淀，4000rpm，5min
上清液2 沉淀(弃) 置于容量瓶中，蒸馏水定容至100ml,混匀， 取1ml即可进行还原糖的测定。
还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及 其它产物，3,5-二硝基水杨酸则被还原为 棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。
NaOH 加热
黄色
棕红色
在过量的NaOH碱性溶液中， 3-氨基-5-硝 基水杨酸呈橘红色，在540nm处有最大吸 收，在一定的浓度范围内，还原糖的量与 光吸收值成线性关系。利用比色法，在 540nm 波长下测定光密度值，查对标准曲 线并计算，便可求出样品中还原糖和总糖 的含量。
实验一、总糖和还原糖的测定
——3,5-二硝基水杨酸法
一、实验目的
1、掌握还原糖和总糖测定的基本原理； 2、学习用3,5-二硝基水杨酸法测定还原
糖的方法。
二、实验原理
还原糖是指含有自由醛基或者酮基的糖类， 单糖都是还原糖，双糖和多糖不一定是还 原糖；利用糖的溶解度不同，可将植物样 品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来； 对没有还原性的双糖和多糖，可用酸水解 法使其降解成有还原性的单糖进行测定， 再分别求出样品中还原糖和总糖的含量 （还原糖以葡萄糖含量计）。
实验七标准曲线制作(AST赖氏法)(精)
AST L 天门冬氨酸 酮戊二酸 草酰乙酸 L 谷氨酸
经60分钟反应后，加入2,4-二硝基苯肼终止反 应，并与反应液中的二种α -酮酸生成相应的 2,4-二硝基苯腙。在碱性条件下，两种苯肼的 吸收光谱曲线有差别，在500nm～520nm处 差异最大，草酰乙酸生成的苯腙的呈色强度显 著大于α -酮戊二酸苯腙。据此可用比色法测 定AST活力。
标准曲线制作（AST赖氏法）
【实验要求】 掌握血清天冬氨酸氨基转移酶测定（赖氏法） 的原理 熟悉操作方法及标准曲线的绘制； 了解实验注意事项，方法评价及临床意义。 【实验任务】 一大组绘制二条标准曲线 2个同学一组测出样品管中吸光度值，并在曲 线上查值。
【实验原理】
AST催化天门冬氨酸与α -酮戊二酸间的氨基移 换反应，生成草酰乙酸和谷氨酸：
【注意事项】
1. 本法的缺点是标本AST活性高时，草酰乙酸对AST有反馈 抑制，使测定结果偏低；酮血症中乙酰乙酸及β-羟丁酸，因 设对照管不会引起测定结果假性增高。 2. 血清中AST在室温下可保存2天，在4℃冰箱可保存1周，在 -25℃可保存1个月。严重溶血、黄疸及脂血血清可增加测定 的吸光度。
【实验评价】
1.本法为终点法，难以确定酶促反应30～60min内产物生成 量与时间成正比。同时也存在底物和2，4-二硝基苯肼用量不 足的问题，由于标本AST活性高时，草酰乙酸对AST显示反馈 抑制，使AST活性下降，测定结果偏低。 2.重复性差 血清中含有多种酶对AST测定产生负干扰现象， 如耦联转氨基作用，即AST作用生成的产物草酰乙酸会不可 逆地转变为丙酮酸而成为ALT的底物影响AST的测定；产物旁 路效应，生成的草酰乙酸可被血清内源性苹果酸脱氢酶催化 而消耗，草酰乙酸自发转变成的丙酮酸可被血清中的LD催化。 本法最适条件下的变异系数为8%，常规条件下的变异系数＜ 16%。 3.操作简便，实验条件要求不高，便于基层医疗单位开展。
经60分钟反应后，加入2,4-二硝基苯肼终止反 应，并与反应液中的二种α -酮酸生成相应的 2,4-二硝基苯腙。在碱性条件下，两种苯肼的 吸收光谱曲线有差别，在500nm～520nm处 差异最大，草酰乙酸生成的苯腙的呈色强度显 著大于α -酮戊二酸苯腙。据此可用比色法测 定AST活力。
标准曲线制作（AST赖氏法）
【实验要求】 掌握血清天冬氨酸氨基转移酶测定（赖氏法） 的原理 熟悉操作方法及标准曲线的绘制； 了解实验注意事项，方法评价及临床意义。 【实验任务】 一大组绘制二条标准曲线 2个同学一组测出样品管中吸光度值，并在曲 线上查值。
【实验原理】
AST催化天门冬氨酸与α -酮戊二酸间的氨基移 换反应，生成草酰乙酸和谷氨酸：
【注意事项】
1. 本法的缺点是标本AST活性高时，草酰乙酸对AST有反馈 抑制，使测定结果偏低；酮血症中乙酰乙酸及β-羟丁酸，因 设对照管不会引起测定结果假性增高。 2. 血清中AST在室温下可保存2天，在4℃冰箱可保存1周，在 -25℃可保存1个月。严重溶血、黄疸及脂血血清可增加测定 的吸光度。
【实验评价】
1.本法为终点法，难以确定酶促反应30～60min内产物生成 量与时间成正比。同时也存在底物和2，4-二硝基苯肼用量不 足的问题，由于标本AST活性高时，草酰乙酸对AST显示反馈 抑制，使AST活性下降，测定结果偏低。 2.重复性差 血清中含有多种酶对AST测定产生负干扰现象， 如耦联转氨基作用，即AST作用生成的产物草酰乙酸会不可 逆地转变为丙酮酸而成为ALT的底物影响AST的测定；产物旁 路效应，生成的草酰乙酸可被血清内源性苹果酸脱氢酶催化 而消耗，草酰乙酸自发转变成的丙酮酸可被血清中的LD催化。 本法最适条件下的变异系数为8%，常规条件下的变异系数＜ 16%。 3.操作简便，实验条件要求不高，便于基层医疗单位开展。
标准曲线法测定含量(中药制剂检验课件)
法测定含量
必备知识
在做精密测量时，用对照品溶液的浓度进行线性回归，求出回归 直线方程（相关系数r≥0.999），绘出回归直线代替标准曲线， 以尽量消除偶然误差。
亦可利用计算器将一系列对照品溶液的浓度与相应的吸光度进行 一元线性回归，求出回归方程（相关系数≥0.9990），将供试品 溶液的吸光度代入回归方程，算出供试品溶液的浓度。
中药制剂的含量测定技术
——标准曲线法测定含量
1 基础知识 2 必备知识 3 拓展知识
目录
基础知识
紫外-可见分光光度法的定量分析依据是朗伯-比尔定律。其物理意义是：当一 束平行的单色光通过均匀的非散射体系的低浓度溶液时，在单色光强度、溶液温 度等条件不改变的情况下，吸光度与液层的厚度(光程长度)和吸光物质浓度的乘 积成正比。其数学表达式为：A=KCL
式中，A为吸光度；K为吸收系数；C为溶液浓度；L为液层厚度。
吸收系数是指吸光物质在单位浓度及单位厚度时的吸光度。 吸收系数K ：百分吸收系数、摩尔吸收系数。《中国药典》采用百分吸收系 数。
定量方法有吸收系数法、对照品法、标准曲线法。
标准曲线法测定含量
必备知识
配制一系列不同浓度的对照品溶液，选择合适的 参比溶液，在相同条件下分别测定各对照品溶液 的吸光度。以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标绘 制AC曲线，称为标准曲线或工作曲线。然后在完全 相同的条件下测定样品溶液的吸光度，从标准曲
必备知识
标准曲线法测定含量
回归方程：A=a+bC
式中，A为被测溶液吸光度；C为被测溶液浓（g/ml）；a为截距 ；b为斜率。
拓展知识
标准曲线法多用于可见分光光度法，由于显色时影响颜色深浅的 因素较多，有的仪器单色光纯度较差，故测定时应用对照品同时操 作。 本法适用于批量供试品的分析，当仪器和测定条件固定时，标准 曲线可多次使用。
必备知识
在做精密测量时，用对照品溶液的浓度进行线性回归，求出回归 直线方程（相关系数r≥0.999），绘出回归直线代替标准曲线， 以尽量消除偶然误差。
亦可利用计算器将一系列对照品溶液的浓度与相应的吸光度进行 一元线性回归，求出回归方程（相关系数≥0.9990），将供试品 溶液的吸光度代入回归方程，算出供试品溶液的浓度。
中药制剂的含量测定技术
——标准曲线法测定含量
1 基础知识 2 必备知识 3 拓展知识
目录
基础知识
紫外-可见分光光度法的定量分析依据是朗伯-比尔定律。其物理意义是：当一 束平行的单色光通过均匀的非散射体系的低浓度溶液时，在单色光强度、溶液温 度等条件不改变的情况下，吸光度与液层的厚度(光程长度)和吸光物质浓度的乘 积成正比。其数学表达式为：A=KCL
式中，A为吸光度；K为吸收系数；C为溶液浓度；L为液层厚度。
吸收系数是指吸光物质在单位浓度及单位厚度时的吸光度。 吸收系数K ：百分吸收系数、摩尔吸收系数。《中国药典》采用百分吸收系 数。
定量方法有吸收系数法、对照品法、标准曲线法。
标准曲线法测定含量
必备知识
配制一系列不同浓度的对照品溶液，选择合适的 参比溶液，在相同条件下分别测定各对照品溶液 的吸光度。以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标绘 制AC曲线，称为标准曲线或工作曲线。然后在完全 相同的条件下测定样品溶液的吸光度，从标准曲
必备知识
标准曲线法测定含量
回归方程：A=a+bC
式中，A为被测溶液吸光度；C为被测溶液浓（g/ml）；a为截距 ；b为斜率。
拓展知识
标准曲线法多用于可见分光光度法，由于显色时影响颜色深浅的 因素较多，有的仪器单色光纯度较差，故测定时应用对照品同时操 作。 本法适用于批量供试品的分析，当仪器和测定条件固定时，标准 曲线可多次使用。
血清ALT标准曲线法课件
10.点击“确定”，标准曲线画好，如图10：
11.计算回归方程：点击趋势线（也就是标准曲线）然后 按右键，选趋势线格式，在显示公式和显示R平方值 （直线相关系数）前点一下，勾上。如图11：
12.点击“确定”，公式和相关系数都出来了。如图12：
13. 如图输入公式 “=31.46*B11-0.0897”, 回 车即得出所求浓度值，如图13；
的乘积成正比关系
A=KCL
式中K为一常数，其大小随溶液的性质和 入射光的波长而定
朗伯-比尔定律应用
标准品法测定未知样品含量
A标准=KC标准L A测定=KC测定L
A测定 C测定= × C A标准 标准
朗伯-比尔定律应用
标准曲线法测定未知样品含量
用标准品配制成不同 浓度的标准溶液，测其相 应的吸光度值，以标准品 的浓度作为X 坐标，以吸 光度值为Y 坐标，绘制标 准曲线（通常为直线）。 可用未知样品的吸光 度在标准曲线上查找出相 应的浓度 。
硫酸铜溶液浓度(g/L)
10 8 6 4 2 0 0 0.1 0.2 吸光度值A 0.3 0.4 0.5
【实验原理】
谷丙转氨酶 ALT
【实验操作】
取试管6支，按下表加入试剂：
丙酮酸标准液的制备和样品测定
加入物(mL) 标准品 丙氨酸氨基转移酶基质 液 0.1mmol/L磷酸盐缓冲液 (pH=7.4) 待测血清 置３７℃水浴中保温３０分钟 ２,４－二硝基苯肼溶液 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 空白管 0 0.5 0.1 标准1 0.05 0.45 0.1 标准2 0.1 0.4 0.1 标准3 0.15 0.35 0.1 标准4 0.2 0.3 0.1 标准5 0.25 0.25 0.1 0.1 0.5 测定管
生物化学试验课件
目录
实验一 氨基酸的分离鉴定——纸层析法 (操作性) 4学时 实验二 考马斯亮蓝结合法测定蛋白质浓度 (操作性) 3学时 实验三 血清蛋白的醋酸纤维薄膜电泳 (验证性) 5学时 实验四 动物肝肝脏DNA的分离与鉴定 (操作性) 3学时 实验五 血液中葡萄糖的测定 (操作性) 3学时 实验六 血清中总胆固醇的测定 (操作性) 4学时 实验七 唾液淀粉酶活性的观察 (综合性) 4学时 实验八 维生素C的定量测定 (操作性) 4学时 实验九 脂肪酸的β-氧化 (操作性) 4学时
【注意事项】
1．醋酸纤维素薄膜的质量对结果影响很大，最好选用 同一批号、薄膜厚度均匀、质量良好的醋酸纤维素薄膜。 2．血清或其他电泳样品应新鲜。 3．点样应细窄、均匀、集中。点样量不宜过多，点样 位置要合适。 4．盐桥要放置平整，保证电场均匀。 5．电泳槽盖应密封，盖内空间不宜过大。 6．较低温度下电泳一般能获得较好的图谱，故室温不 宜过高。 7．选择合适的缓冲液离子强度。
【实验步骤】
1．薄膜准备 2．点样
3．电泳
4．染色和漂洗 +
白蛋白(A)
α2
β
γ
α1
5．薄膜和透明
6．定量
（1）洗脱法
每种蛋白占总蛋白量的
百分数（%）
该种蛋白管光密度读数 各管光密度读数之和
100 %
注意！白蛋白因加入NaOH的量比其他管多，其光密度值 应乘以稀释倍数，得到数值再代入上式中计算。
8．两电泳槽内缓冲液面应在同一水平。 9．要控制好电流，电压和电泳时间。 10．电泳槽内缓冲液可以多次使用。但操作时应尽量减 少缓冲液的污染、水分蒸发、pH及离子强度的改变， 并应防止霉菌的滋长。 11．染色、漂洗及洗脱时间要控制好，才能获得重复性 良好的定量结果。
校准曲线的绘制
• 2、检测器光能也在不断的衰弱，因此其每 天的相应值也有所不同，其峰面积也有差 异。
• 基于以上原因，原则上应该是每天都要进 行标准曲线校正的。
• 标准曲线不要每次都做，但是每次必须进 标准品样品；因为每次你的流动相和原来 的不可能完全一样，同时仪器的状态也在 变化，所以不同批次间的保留时间是不一 致的，所以你必须用随行标准品来定位与 定量。
• 我们一般的做法是，根据检测的频率来做， 如果该项目天天都要检测，并且检测量较 多时，要求至少每周做一次曲线。如果检 测量上，一个月都没有几单的话，就一个 月做一次曲线。当然，仪器如果出现故障 并大修后回来的，经过检定后，需要重新 做曲线。
9、标准曲线是否必须过原点
标准曲线不一定非要过原点，只要线性好就可以了。因为做空白 的话基本上不会过原点。过原点是强制过的，实际曲线可能不过， 就会造成误差。不过原点是因为有系统误差。 针对是否过原点(0，0)问题，可以从原点(0，0)代表的意义来考虑： 即所测组分浓度为零的时候，信号响应值（液相色谱也就是峰高 或者峰面积）是否也为零。通常来说色谱分析是属于这种情况的， 因而可以把（0，0）点作为一个浓度水平计入标准曲线（甚至不 需要真的去配一个浓度为零的标准溶液来进样），这也是单点法 定量的一个依据；而类似的情况在光谱法测定时就讲不通了，浓 度为零的标准溶液（本底）响应信号（吸光度）往往不是零，这 个时候标准曲线就不一定过原点了。
4、标曲R值是几个9才合格？
• 实验室应按检测标准（方法）的要求使用标准溶液或标准物质建 立标准曲线。所用标准溶液或标准物质应覆盖被测样品的浓度范 围。检测标准（方法）如无具体的要求，至少使用5个标样（除空 白外）建立线性标准曲线，每个点重复测定1-3次，对于筛选方法， 线性回归方程的相关系数不应低于0.98，对于确证方法，相关系 数不应低于0.99。
• 基于以上原因，原则上应该是每天都要进 行标准曲线校正的。
• 标准曲线不要每次都做，但是每次必须进 标准品样品；因为每次你的流动相和原来 的不可能完全一样，同时仪器的状态也在 变化，所以不同批次间的保留时间是不一 致的，所以你必须用随行标准品来定位与 定量。
• 我们一般的做法是，根据检测的频率来做， 如果该项目天天都要检测，并且检测量较 多时，要求至少每周做一次曲线。如果检 测量上，一个月都没有几单的话，就一个 月做一次曲线。当然，仪器如果出现故障 并大修后回来的，经过检定后，需要重新 做曲线。
9、标准曲线是否必须过原点
标准曲线不一定非要过原点，只要线性好就可以了。因为做空白 的话基本上不会过原点。过原点是强制过的，实际曲线可能不过， 就会造成误差。不过原点是因为有系统误差。 针对是否过原点(0，0)问题，可以从原点(0，0)代表的意义来考虑： 即所测组分浓度为零的时候，信号响应值（液相色谱也就是峰高 或者峰面积）是否也为零。通常来说色谱分析是属于这种情况的， 因而可以把（0，0）点作为一个浓度水平计入标准曲线（甚至不 需要真的去配一个浓度为零的标准溶液来进样），这也是单点法 定量的一个依据；而类似的情况在光谱法测定时就讲不通了，浓 度为零的标准溶液（本底）响应信号（吸光度）往往不是零，这 个时候标准曲线就不一定过原点了。
4、标曲R值是几个9才合格？
• 实验室应按检测标准（方法）的要求使用标准溶液或标准物质建 立标准曲线。所用标准溶液或标准物质应覆盖被测样品的浓度范 围。检测标准（方法）如无具体的要求，至少使用5个标样（除空 白外）建立线性标准曲线，每个点重复测定1-3次，对于筛选方法， 线性回归方程的相关系数不应低于0.98，对于确证方法，相关系 数不应低于0.99。
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谢谢观看
• 仪器：722N分光光度计、比色皿、比色管、移液管、 洗耳球 • 试剂：高锰酸钾溶液
• 1、取 5支25ml 比色 管，分别加入2.00ml， 4.00ml，6.00ml， 8.00ml，10.00ml KMnO4 溶液，用蒸馏 水稀释到刻度，摇匀。
• 2、将分光光度计调到最大吸收波长530nm以开盖调“0” 关盖调“100”原则调试。用蒸馏水作为空白对比，依次 测定各溶液的吸光度A，然后以浓度C（mg/ml）为横坐标， 相应的吸光度A为纵坐标，绘制标准曲线。
标准曲线的绘制
• 标准曲线法是仪器分析和其它分析应用中非常常用的数据 处理方法，很多情况下采用作图法得到分析结果，作图方 法的正确与否对结果影响很大。 • 在分析化学试验中，常用标准曲线法进行定量分析，通常 情况下的标准曲线都是一条直线。
• 1. 熟悉分光光度计的使用方法。 • 2. 熟悉标准曲线的绘制方法和检测方法。
1 KMnO4 （mL） 2.00
2 4.00
0.163 6.Biblioteka 00.244 8.00
0.32
5 10.00
0.40
C（mg/mL）0.08
A（吸光度） 0.046
0.094
0.132
0.189
0.231
• • • •
1、可见分光光度计需要提前预热20分钟。 2、可见分光光度计需要开盖调0，闭盖调100。 3、拿比色皿的时候一定要拿毛玻璃面。 4、要保证比色皿的洁净。