伊马替尼治疗慢性粒细胞白血病患者ABL激酶区点突变的检测

公司产品） 。反应条件为预变性 ９４ ℃２ ｍｉｎ， 然后 ９４ ℃ １５ ｓ、６６ ℃ ３０ ｓ、６８ ℃ １ ｍｉｎ， 循环 ３２ 次。
第 二 轮 ＰＣＲ 反 应 的 引 物 为 ＡＢＬＦ： ５＇－ＧＣＧＣＡ ＡＣＡＡＧＣＣＣＡＣＴＧＴＣＴＡＴＧＧ－３＇， ＡＢＬＲ： ５＇－ＧＣＣＡＧＧ ＣＴＣＴＣＧＧＧＴＧＣＡＧＴＣＣ－３＇， 将 第 一 轮 ＰＣＲ 的 产 物 按 １∶１００ 稀释取 １ μｌ 作为模板， 反应体系为 ５０ μｌ， 包 含上、下游引物各 ０．３ μｍｏｌ／Ｌ， ｄＮＴＰｓ 各 ０．２ ｍｍｏｌ／Ｌ， ＭｇＳＯ４ １ ｍｍｏｌ／Ｌ， １×ＰＣＲ 缓冲液 ５ μｌ， 高保真 Ｔａｑ 酶 １ Ｕ／μｌ。反应条件为预变性 ９４ ℃ ２ ｍｉｎ， 然后 ９４ ℃ １５ ｓ、６５ ℃ ３０ ｓ、６８ ℃ １ ｍｉｎ， 循环 ３０ 次。ＰＣＲ 终产物为 ５７９ ｂｐ， 对应于 ＡＢＬ 激酶的第 ２１９ 至 ４１１ 个氨基酸。 １．２．４ ＰＣＲ 产物电泳及测序 ＰＣＲ 产物进行 １％琼脂 糖凝胶电泳分析。检测合格后， ＰＣＲ 产物由 Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ 公司纯化并利用 ＡＢＩ３７３０ＤＮＡ 测序仪 （ 美国应用生 物技术公司） 进行双向测序。将测序结果到美国 ＧｅｎＢａｎｋ 中 进 行 序 列 同 源 性 比 较 （ 相 应 于 美 国 ＧｅｎＧａｎｋ 中 Ｍ１４７５２） 。确定点突变， 判断相应的氨基 酸。 １．２．５ 荧光原位杂交 采用本室常规方法［３］。
第胞白血病患者 ＡＢＬ 激酶区点突变的检测
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序以探讨 ＡＢＬ 激酶区点突变的发生情况及其对伊马 替尼耐药的影响。
１ 对象和方法 １．１ 对象
选取 ２００６ 年 ７ 月至 ２００７ 年 １１ 月南方医院血液 科门诊或病房收治的 ２３ 例 ＣＭＬ 患者不同时期的 ４０ 份骨髓标本， 大部分患者为治疗效果差时采集标本， 其中耐药患者 １７ 人。开始伊马替尼治疗时， ＣＰ１０ 人， ＡＰ６ 人， ＢＰ７ 人。所有 ＣＰ 患者伊马替尼的起始剂量 为 ４００ ｍｇ／ｄ， 进入遗传学复发、ＡＰ 或 ＢＰ 后将剂量提 高至 ６００ ｍｇ／ｄ 或 ８００ ｍｇ／ｄ。对 ７ 例检测到 ＡＢＬ 激酶 区点突变及 １１ 例无突变的伊马替尼耐药患者， 分别 在 ３ 个月和 ６ 个月 行 ＢＣＲ－ＡＢＬ 基 因 的 荧 光 原 位 杂 交、巢式 ＰＣＲ、测序分析。ＣＰ、ＡＰ、ＢＰ 及伊马替尼疗 效 、耐 药 的 诊 断 均 符 合 《血 液 学 诊 断 及 疗 效 标 准 》［ １］ 。 １．２ 方法 １．２．１ 提取 ＲＮＡ 常规方法抽取骨髓并以 ＥＤＴＡ 抗 凝。用相对密度为 １．０７７ ｇ／Ｌ 的淋巴细胞分离液分离 单个核细胞。以 Ｔｒｉｚｏｌ 试剂（ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ） 提取总 ＲＮＡ。 １．２．２ 逆转录合成 ｃＤＮＡ １０ μｌ 逆转录反应体系中加 入 ５００ ｎｇ 总 ＲＮＡ， ｄＮＴＰ 终浓度为 ０．５ ｍｍｏｌ／Ｌ， 随机 引 物 ５０ ｐｍｏｌ／Ｌ， 逆 转 录 酶 （ Ｍ－ＭＬＶ） ５０Ｕ（ ＴａＫａＲａ） 。 逆转录反应条件为 ４２ ℃ ８０ ｍｉｎ， 并以 ９５ ℃ ２ ｍｉｎ 灭 活逆转录酶。 １．２．３ ＡＢＬ 激酶区扩增 参考 Ｃｈｕ 等［２］的序列及方法 并 做 部 分 调 整 。ＢＣＲ－ＡＢＬ 激 酶 区 的 扩 增 采 用 巢 式 ＰＣＲ， 第 一 轮 ＰＣＲ 扩 增 产 物 长 为 １３２７ ｂｐ， 覆 盖 ＢＣＲ－ＡＢＬ 连接处和 ＡＢＬ 激酶区。上游引物 ＢＣＲＦ： ５＇－ＧＡＡＧＣＴＴＣＴＣＣＣＴＧＡＣＡＴＣＣＧＴ－３＇， 下 游 引 物 ＡＢＬＲ： ５＇－ＧＣＣＡＧＧ ＣＴＣＴＣＧＧＧＴＧＣＡＧＴＣＣ－３＇。反应 体系为 ２５ μｌ， 包含上、下游引物各 ０．３ μｍｏｌ／Ｌ， ｄＮＴＰｓ 各 ０．２ ｍｍｏｌ／Ｌ， ＭｇＳＯ４ １ ｍｍｏｌ／Ｌ， １×ＰＣＲ 缓 冲 液 ２．５ μｌ， 模板 ｃＤＮＡ １ μｌ， 高保真 Ｔａｑ 酶 １ Ｕ／μｌ（ ＴＯＹＯＢＯ
Ａｂｓｔｒ ａｃｔ： Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ａｎａｌｙｚｅ ｔｈｅ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｏｆ ＡＢＬ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｃｈｒｏｎｉｃ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ （ＣＭＬ） ｐａｔｉｅｎｔｓ ｒｅｃｅｉｖｉｎｇ ｉｍａｔｉｎｉｂ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｎｅｓｔｅｄ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ－ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ （ＲＴ－ＰＣＲ） ｗａｓ ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ ｏｎ ４０ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｓａｍｐｌｅｓ ｆｒｏｍ ２３ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｔｏ ａｍｐｌｉｆｙ ｔｈｅ ＡＢＬ ｋｉｎａｓｅ ｄｏｍａｉｎ， ｆｏｌｌｏｗｅｄ ｂｙ ｄｉｒｅｃｔ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ａｎａｌｙｓｉｓ． Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｉｎ ｔｈｅ ２３ ｐａｔｉｅｎｔｓ ａｎａｌｙｚｅｄ， ｔｈｅ ＡＢＬ ｄｏｍａｉｎ ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｗａｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｉｎ ７ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｈｏ ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ ｗｉｔｈ ５ ｔｙｐｅｓ ｏｆ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｃｈａｎｇｅｓ， ｎａｍｅｌｙ Ｔ３１５Ｉ（ｎ＝３）， Ｙ２５３Ｈ， Ｅ２５５Ｋ， Ｆ３１７Ｌ ａｎｄ Ｇ３２１Ｗ． Ｔｈｅ ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ ｏｆ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｃｈｒｏｎｉｃ ｐｈａｓｅ （ＣＰ）， ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ ｐｈａｓｅ （ＡＰ） ａｎｄ ｂｌａｓｔ ｐｈａｓｅ （ＢＰ） ｗａｓ ２５．００％， ４０．００％ ａｎｄ ３０．００％， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ｆｏｒ ６ ｏｆ ｔｈｅ ７ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｗｈｏ ｗｅｒｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｔｏ ｉｍａｔｉｎｉｂ ｂｅｆｏｒｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ， ｔｈｅ ｄａｉｌｙ ｄｒｕｇ ｄｏｓｅ ｈａｄ ｂｅｅｎ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｔｏ ６００－８００ ｍｇ ｄａｉｌｙ ｆｏｒ ｐｏｏｒ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ４００ ｍｇ／ｄａｙ ｉｍａｔｉｎｉｂ． Ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｆｏｌｌｏｗ－ｕｐ ｆｏｒ ３－６ ｍｏｎｔｈｓ， ｏｎｌｙ ｔｈｅ ｐａｔｉｅｎｔ ｗｉｔｈ Ｆ３１７Ｌ ａｃｈｉｅｖｅｄ ｍａｊｏｒ ｃｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃ ｒｅｓｐｏｎｓｅ （ＭＣＲ）， ａｎｄ ｔｈｅ ｐａｔｉｅｎｔ ｗｉｔｈ Ｙ２５３Ｈ ａｎｄ １ ｏｆ ｔｈｅ ３ ｗｉｔｈ Ｔ３１５Ｉ ｐｒｏｇｒｅｓｓｅｄ ｔｏ ＢＰ． Ｔｈｅ ｎｅｗｌｙ ｄｉａｇｎｏｓｅｄ ｐａｔｉｅｎｔ ｗｉｔｈ Ｇ３２１Ｗ ＩＮ ｃｐ ａｃｈｉｅｖｅｄ ａ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ ｒｅｍｉｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｈａｄ ａ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｅｃｒｅａｓｅ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎ ｏｆ ＢＣＲ－ＡＢＬ－ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｅｌｌｓ． Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ ＡＢＬ ｋｉｎａｓｅ ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｉｓ ａｎ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｉｍａｔｉｎｉｂ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ． Ｔｈｅ ｔｙｐｅ ｏｆ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ｉｍａｔｉｎｉｂ， ａｎｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＡＢＬ ｋｉｎａｓｅ ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｂｙ ｄｉｒｅｃｔ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｍａｙ ｈｅｌｐ ｅｓｔｉｍａｔｅ ｔｈｅ ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ ｐｌａｎ ｆｏｒ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｓｔｒａｔｅｇｙ ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔ． Ｋｅｙ ｗｏｒ ｄｓ： ｃｈｒｏｎｉｃ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ； ＡＢＬ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ； ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎ； ｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ； ｉｍａｔｉｎｉｂ
Ｇ３２１Ｗ各 １ 例。慢性期、加速期和急变期患者点突变的例数分别为 ２ 例、２ 例和 ３ 例。其中 ６ 例患者测序前经 ４００ ｍｇ／ｄ
伊马替尼治疗无效， 加大伊马替尼剂量至（ ６００￣８００） ｍｇ／ｄ， 随访 ３￣６ 个月， 仅 Ｆ３１７Ｌ 患者获得部分 细 胞 遗 传 学 缓 解 ， 另
外 ５ 例患者均无遗传学反应， 且 Ｙ２５３Ｈ 和 １ 例 Ｔ３１５Ｉ 疾病进展至急变期。Ｇ３２１Ｗ 为初治慢性期患者， 经 ４００ ｍｇ／ｄ 伊马
ＯＵＹＡＮＧ Ｚｈａｏ， ＤＵ Ｑｉｎｇ－ｆｅｎｇ， ＬＩＵ Ｘｉａｏ－ｌｉ， ＺＨＡＮＧ Ｓｏｎｇ， ＺＨＵ Ｈｏｎｇ－Ｑｉａｎ， ＧＯＮＧ Ｊｕｎ－ｍｅｉ， ＳＯＮＧ Ｌａｎ－ｌｉｎ， ＯＵＹＡＮＧ Ｌｉｎｇ－ｙｕｎ， ＬＩＵ Ｚｈｉ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ， Ｎａｎｆａｎｇ Ｈｏｓｐｉｔａｌ， Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ ５１０５１５， Ｃｈｉｎａ
采用巢式 ＰＣＲ 扩增 ２３ 例 ＣＭＬ 患者不同时期的 ４０ 份骨髓标本的 ＡＢＬ 激酶区， 对扩增产物纯化、双向测序并进行序列
同 源 性 比 对 。 结 果 ７ 人 （ ３０．４３％） 检 测 出 点 突 变 ， 共 导 致 ５ 种 类 型 的 氨 基 酸 替 换 ： Ｔ３１５Ｉ ３ 例 ， Ｙ２５３Ｈ、Ｅ２５５Ｋ、Ｆ３１７Ｌ 及
慢性粒细胞白血病（ ＣＭＬ） 是一种起源于造血干
收稿日期： ２００８－０３－１５ 基 金 项 目 ： 国 家 自 然 科 学 基 金 （ ３０２７１４６３） ； 广 州 市 科 技 计 划 项 目 （ ２００６Ｅ３－Ｅ０４０１） Ｓｕｐｐｏｒｔｅｄ ｂｙ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｎａｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｈｉｎａ （３０２７１４６３） ａｎｄ Ｓｃｉ－ｔｅｃｈ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｐｒｏｇｒａｍ ｏｆ Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ Ｍｕｎｉｃｉｐａｌｉｔｙ （２００６Ｅ３－Ｅ０４０１） 作 者 简 介 ： 欧 阳 昭（１９８２－）， 女 ， 在 读 硕 士 研 究 生 ， 电 话 ： ０２０－６１６４１６１５， Ｅ－ｍａｉｌ： ｏｕｙａｎｇｚｈａｏ８２＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ 通讯作者： 刘晓力， 女， 教授， 博士生导师， 电话： ０２０－６１６４１６１５， Ｅ－ｍａｉｌ： ｌｘｌ２４０５＠１２６．ｃｏｍ