外泌体科学研究策略与方法
外泌体的生物学特性及临床应用的研究进展
3、工程领域的研究进展 （1）生物材料：外泌体具有理想的生物相容性和 生物活性，可以作为生物材料用于组织工程和再生医学。例如，外泌体可以作为 细胞培养的支架材料，提供细胞生长和分化的微环境；还可以作为药物载体，提 高药物的靶向性和疗效。
（2）纳米技术：外泌体具有类似于细胞膜的结构和组成，这使得它们在纳 米医学领域具有广泛的应用前景。通过将外泌体进行分离、纯化和改性，可以制 备出具有特定功能和性质的纳米颗粒，用于药物输送、成像技术和生物传感等方 面。
参考内容
外泌体是细胞分泌的一种微小膜泡，它们携带着多种生物活性分子，如蛋白 质、核酸和磷脂等，参与细胞间通讯、组织修复和神经系统等多种生物学过程。 近年来，外泌体研究取得了重大进展，本次演示将对外泌体的生物学功能和应用 进行详细阐述。
一、外泌体的背景
外泌体最初被发现于1983年，是由Weber和Wiechmann在红细胞中发现的。 它们是由细胞分泌的一种直径约30-100nm的囊泡，由单层膜构成，内含多种生物 活性分子。外泌体的分泌过程需要细胞内多分子复合物的参与，包括 ESCRT-0、 ESCRT-I、ESCRT-II和ALIX等蛋白。
结论
外泌体在医学和基础科学领域的研究取得了显著进展，其在疾病诊断、药物 输送、细胞通信和免疫调节等方面的作用逐渐被揭示。未来，随着对外泌体的深 入研究和技术创新，有望为疾病的诊疗、组织工程和再生医学等领域提供更多新 的应用和治疗方
法。因此，我们呼吁进一步深入探索外泌体的功能和应用，为人类健康事业 做出更大贡献。
然而，外泌体研究仍面临一些挑战，如外泌体的纯度问题、分泌机制的不明 确以及其在疾病诊断和治疗中的可靠性等。为了解决这些挑战，需要进一步深入 研究外泌体的分泌机制和生物学功能，并探索其在临床上的应用潜力。
exosomes外泌体实验方案
外泌体分离提纯草案By 朱旭峰一、以超高速离心的方法来分离外泌体（细胞上清）1.1细胞培养液(CM)是来自无菌的80%-90%的培植细胞，并用浓度比1:1.000的蛋白酶抑制剂混合。
（sigma）1.2快速地将CM用0.22μm 的过滤筛(Millipore)过滤，来分离完整地细胞和残渣。
超速离心于120,000_g (Sorvall WX ULTRA SERIES, rotorA-641) 4 ℃. 2 小时1.3用1mL 冷的PBS 重悬和清洗小囊泡，再次超速离心120,000_g(Sorvall WX ULTRA SERIES, rotor A-641) 4 ℃. 2 小时1.4再用100μL 冷的PBS 重悬后转移到低粘附的管中1.5快速地使用或置于-80℃中待用为检测外泌体的蛋白浓度，取2μL的样品置于卡上，用Direct Detect™(Millipore)2材料a)细胞培养液b)蛋白酶抑制（Sigma）c)过滤筛(Millipore)d)冷的PBSe)低粘附的管f)Direct Detect™(Millipore)二、以超高速离心的方法来分离外泌体（人血浆）1.1在提取外泌体之前应该向血浆里添加1;500浓度比的蛋白酶抑制剂(Sigma)1.2将上清液移至一个新的管中离心200*g 20分钟4℃1.3小心地再将上清液移至新的管中离心10000*g 30分钟于4℃来去除较大的囊泡、1.4此阶段的样品可以1.5将样品用0.22μm的注射器滤筛(Millipore)过滤并且离心110000g(Sorvall WX ULTRA SERIES, rotor F65L) 2小时4℃1.6用冷的PBS重悬后再次超速离心(110,000g, 1 h, 4 ℃).，1.7将外泌体小心干燥并且用冷的PBS重悬1.8外泌体应该立即使用或-80摄氏度冷藏2.材料a)蛋白酶抑制（Sigma）b)过滤筛(Millipore)c)冷的PBSd)低粘附的管e)Direct Detect™(Millipore)三、ExoQuick TM化学沉淀法1.1ExoQuick TM的使用要按照厂家提供的说明书来实行1.2该试剂盒可以简单地提取CM,人血浆，和血清里的外泌体，只需用倒相管按照所指示的量来加入ExoQuick TM试剂盒里的溶液1.3溶液孵化过夜，在4℃温和的摇晃1.4在流式细胞仪缓冲液中洗涤1.5试剂盒里的带荧光的免疫磁珠已经被绑定，用流式细胞仪鉴定即可(BD Biosciences) 配合使用CellQuest 的软件。
外泌体作为新型治疗手段的研究
外泌体作为新型治疗手段的研究随着科技的不断进步，越来越多的新型治疗手段被研究出来，其中外泌体作为一种新兴的治疗手段，受到了科学家们的广泛关注。
外泌体是一种由细胞分泌出来的纳米级贝壳结构的小囊泡，内部含有具有生物活性的基因信息和蛋白质等分子物质。
近年来，外泌体在治疗癌症、心血管疾病、神经退行性疾病等方面的应用研究也得到了广泛的关注。
外泌体作为新型的治疗手段，有着许多独特的特性。
首先，作为一种纳米级的小囊泡，外泌体能够穿透生物膜，有效地将其内部的物质传递到细胞内。
其次，外泌体内部含有多种生物活性物质，如蛋白质、mRNA、miRNA、DNA等，这些生物活性分子可以被利用来转化细胞功能或修饰基因表达。
最后，由于外泌体来源于自体细胞，也不涉及使用外来材料或免疫反应问题，因此具有良好的安全性和免疫学适应性。
在治疗癌症方面，外泌体已被证实具有抗癌活性。
研究人员发现，肿瘤细胞和其他细胞相比，分泌的外泌体数量更多，且含有更多的生物活性物质和生长因子，这些物质具有促进肿瘤细胞增殖和侵袭的作用。
因此，通过拦截肿瘤细胞分泌的外泌体或直接给予患者来源于其他细胞的外泌体，可以达到治疗癌症的效果。
例如，研究人员发现通过注射来源于骨髓间充质干细胞的外泌体，可以抑制恶性胶质瘤的生长，并提高患者的存活率。
在治疗心血管疾病方面，外泌体也具有广泛的应用前景。
心肌缺血后心肌细胞将大量释放外泌体，其中包含补体激活物和血小板激活因子等生物活性物质。
通过注射来源于心肌细胞外泌体的治疗方法可以提高心肌细胞的功能和心脏的整体状态。
同时，研究人员也发现，通过从骨髓间充质干细胞收集分离出的外泌体可以改善心血管纤维化、促进血管新生和心肌再生，从而有效改善心血管的健康状况。
在神经退行性疾病的治疗中，外泌体也有着潜在的作用。
神经元为了维持生命所需要的蛋白质能够从周围的胶质细胞中获得，但由于神经元本身的限制，导致神经毒性事件的发生，这也增加了神经退行性疾病的发生率。
外泌体的研究进展
外泌体的研究进展一、本文概述随着生物医学研究的深入，细胞间的信息交流机制逐渐成为研究的热点。
作为细胞间交流的重要载体，外泌体（Exosomes）的研究在近年来取得了显著的进展。
本文旨在综述外泌体的基本特征、生物学功能及其在疾病诊断和治疗中的应用，同时探讨当前面临的挑战和未来的发展趋势。
我们将简要介绍外泌体的定义、结构特点以及产生机制，帮助读者理解其作为细胞间信息传递的重要角色。
接着，我们将重点讨论外泌体在肿瘤、心血管疾病、神经退行性疾病等医学领域的研究进展，包括外泌体在疾病发生发展中的作用机制，以及作为疾病标志物的潜力。
我们还将关注外泌体在疾病诊断和治疗中的应用前景，如作为药物递送载体、肿瘤疫苗以及生物标志物等方面的研究。
我们将对当前外泌体研究面临的挑战和未来的发展方向进行深入探讨，以期为推动外泌体在生物医学领域的应用提供有益的参考。
二、外泌体的结构与功能外泌体是一种由细胞主动分泌的，直径约为30-150纳米的膜性囊泡，普遍存在于各种体液中，包括血液、尿液、乳汁、脑脊液和细胞培养基等。
这些囊泡在细胞间的物质传递、信息交流以及免疫反应等方面发挥着重要作用。
近年来，随着外泌体研究的深入，其独特的结构和功能逐渐被人们所揭示。
结构上，外泌体由磷脂双分子层膜包裹着内部的水溶液组成，其膜上嵌有多种蛋白质，包括四跨膜蛋白、热休克蛋白、整合素等。
这些蛋白质不仅参与外泌体的形成和分泌过程，还负责将外泌体与靶细胞进行特异性结合，实现精准的物质传递。
外泌体的膜上还含有丰富的糖类和脂质，这些成分对于外泌体的稳定性和功能也至关重要。
功能上，外泌体具有多种生物学活性。
外泌体可以传递信息分子，如mRNA、miRNA、蛋白质等，这些分子在细胞间的信息交流过程中发挥着关键作用。
外泌体可以参与免疫反应，通过传递抗原或免疫调节分子，影响免疫细胞的活性和功能。
外泌体还具有促进血管生成、抑制肿瘤生长等多种生物学活性。
值得一提的是，外泌体的功能与其来源细胞密切相关。
外泌体在生理与病理过程中的作用及研究进展
外泌体在生理与病理过程中的作用及研究进展外泌体是指一种细胞分泌的小囊泡，直径约为30-100纳米。
它们可以携带细胞膜、细胞器质膜和多种生物活性分子，比如蛋白质、miRNA和毒素，通过与其他细胞交互影响它们的行为。
在最近的几年，外泌体的发现引起了广泛的兴趣，因为它们被认为在生理和病理过程中扮演了关键的角色。
外泌体的形成和释放外泌体从各种类型的细胞中分泌，包括血细胞、肝细胞、上皮细胞和神经细胞等。
它们可以通过三种主要的机制来形成和释放：直接分泌、外化和内化。
直接分泌方式是外泌体在细胞膜上形成，然后释放到细胞外。
外化是指外泌体与细胞膜融合从而形成它们的过程。
内化是指细胞通过内吞作用摄取外泌体。
外泌体的功能外泌体具有多种功能，它们可以在生理和病理过程中发挥不同的作用，具体如下：1. 细胞通信：外泌体可以通过携带生物活性分子来影响接收者细胞的行为，从而参与细胞通信。
例如，蛋白质可以调节受体表达、代谢和细胞增殖等。
2. 细胞凋亡：外泌体可以参与调控细胞凋亡。
一个细胞可以释放外泌体包含有调节细胞凋亡的分子，例如Caspace9，就可以影响周围细胞的凋亡和存活。
3. 免疫调节：外泌体作为一类重要的信息介质扮演着免疫细胞之间互相沟通交流的桥梁。
外泌体中的mRNA和miRNA可以通过调节靶基因的表达，影响细胞的生物学特性和免疫反应。
外泌体在疾病发展中的作用1. 肿瘤：外泌体在肿瘤生长和转移中发挥重要作用。
外泌体在内部远程传递肿瘤信息，可以调节肿瘤细胞的生长、转移和侵染，并参与肿瘤微环境的建立。
研究发现，肿瘤患者血浆中的外泌体数量和质量都发生了改变，这提示外泌体对肿瘤病理生理过程具有极大的影响。
2. 神经性疾病：外泌体也可以在神经细胞之间传递信息。
研究显示在神经元发展中，外泌体可以调节同种或异种神经元的扩散。
这些影响也被发现与神经退行性疾病如阿兹海默症，帕金森氏病，运动神经元疾病如渐冻人有关。
3. 心血管疾病：外泌体在心血管系统中的病理过程中的作用也在不断被探究。
外泌体的研究进展
外泌体的研究进展外泌体是细胞分泌的一种重要物质，由细胞释放到细胞外环境中，参与多种生物学过程。
近年来，随着对外泌体研究的深入，越来越多的学者开始其在医学、生物和材料等领域的应用价值。
本文将对外泌体的研究现状、方法、成果和应用前景进行全面探讨。
一、外泌体的研究现状外泌体是由细胞分泌的一种小泡，直径约30-100纳米，包含多种生物活性物质，如蛋白质、核酸和脂质等。
近年来，随着对外泌体的深入研究，发现其参与了细胞间通信、物质运输等多种生物学过程。
同时，外泌体在疾病诊断、药物研发和组织工程等方面也具有广泛的应用前景。
二、外泌体的研究方法1、实验设计：外泌体的研究涉及细胞生物学、分子生物学、生物化学、医学等多个学科，因此需要进行多学科交叉的实验设计。
2、样本处理：外泌体的提取和纯化是研究外泌体的关键步骤，常用的方法包括超速离心法、免疫磁珠法、聚合物沉淀法等。
3、基因表达分析：采用基因表达谱技术对外泌体中的核酸进行分析，以揭示其基因表达特征。
4、蛋白质组学：运用蛋白质组学技术对外泌体中的蛋白质进行分析，以鉴定其蛋白质种类和功能。
三、外泌体的研究成果1、肿瘤治疗：研究发现，肿瘤细胞释放的外泌体可以传递信号给正常细胞，诱导其恶性转化。
因此，通过研究外泌体在肿瘤发生发展中的作用，有望为肿瘤治疗提供新思路。
2、药物传输：外泌体具有保护和输送物质的特性，可被用作药物载体。
通过加载抗癌药物或其他生物活性物质，外泌体可以实现药物的定向传输，提高疗效并降低副作用。
3、组织工程：外泌体具有调节细胞生长、分化和迁移的能力，因此在组织工程中具有潜在应用价值。
例如，将特定外泌体加载到生物材料中，可以促进组织再生和修复。
4、环境监测：外泌体在细胞间通信和物质运输中发挥重要作用，也参与了环境因素的响应和适应。
通过研究外泌体在环境监测中的作用，可以为环境污染的监测和治理提供新手段。
四、外泌体的应用前景1、生物治疗手段：通过调节外泌体释放的生物活性物质，有望开发新的生物治疗手段，如上文提到的肿瘤治疗和药物传输等。
人骨髓来源间充质干细胞分泌外泌体特性研究
人骨髓来源间充质干细胞分泌外泌体特性研究一、本文概述Overview of this article随着生物医学领域的快速发展，干细胞及其分泌产物的研究已成为当前生命科学领域的热点之一。
人骨髓来源间充质干细胞（hMSCs）作为一种具有多向分化潜能的成体干细胞，其在组织工程、再生医学以及疾病治疗等领域的应用潜力备受关注。
近年来，随着对外泌体（Exosomes）研究的深入，人们发现hMSCs分泌的外泌体在细胞间的信息传递、免疫调节以及组织修复等方面发挥着重要作用。
因此，本文旨在深入研究人骨髓来源间充质干细胞分泌外泌体的特性，以期为hMSCs在医学领域的临床应用提供新的思路和方法。
With the rapid development of the biomedical field, research on stem cells and their secreted products has become one of the hotspots in the current field of life sciences. Human bone marrow-derived mesenchymal stem cells (hMSCs), as an adult stem cell with multi-directional differentiation potential, have attracted much attention for their potential applications in tissue engineering, regenerative medicine, and diseasetreatment. In recent years, with the deepening of research on exosomes, it has been found that exosomes secreted by hMSCs play important roles in intercellular information transmission, immune regulation, and tissue repair. Therefore, this article aims to investigate in depth the characteristics of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells secreting exosomes, in order to provide new ideas and methods for the clinical application of hMSCs in the medical field.本文将首先介绍hMSCs的基本生物学特性及其在组织工程和再生医学中的应用。
外泌体科学研究策略与方法
外泌体科学研究策略与方法外泌体（extracellular vesicles）是一类由细胞分泌的小型膜囊泡，具有丰富的生物大分子（如蛋白质、核酸和代谢产物等）和受体分子，能够通过体液循环进入其他细胞并调控其状态。
外泌体作为一种新兴的细胞间通讯方式，已经在生物学和医学研究中受到广泛关注。
为了深入研究外泌体的功能和应用价值，科学家们采用了一系列研究策略和方法。
首先，外泌体的纯化和鉴定是外泌体研究的基础。
目前常用的外泌体纯化方法包括超速离心、滤膜浓缩、亲和析取和尺寸排除等。
其中，超速离心是最常用的方法，通过连续离心将外泌体从细胞碎片、蛋白质聚集体和其他细胞分泌物中分离出来。
纯化后的外泌体可以通过电镜观察其形态和大小，并通过蛋白质和核酸的检测确认其特征标志物。
其次，外泌体内的生物大分子是外泌体功能的关键。
外泌体中的蛋白质、核酸和代谢产物等分子可以通过质谱分析、RNA测序、代谢组学等方法进行全面的分析。
通过对外泌体中的蛋白质组学的研究，可以鉴定外泌体特有的标志物，并推测其功能和信号通路。
通过外泌体中的RNA测序，可以发现外泌体携带的mRNA和miRNA，了解其在细胞间通讯中的作用。
通过代谢组学的研究，可以分析外泌体携带的代谢产物，揭示其在代谢调控中的作用。
第三，外泌体功能研究是外泌体研究的重点之一、外泌体功能研究主要包括外泌体的分泌机制、目标细胞的识别和摄取、信号传递和功能调控等方面。
通过抑制外泌体分泌的相关因子，可以阻断外泌体的释放，从而探究外泌体的分泌机制。
通过标记外泌体表面的受体和底物，可以观察其在目标细胞上的相互作用和摄取情况。
通过干预外泌体释放和摄取的相关蛋白质和信号通路，可以揭示外泌体在细胞间通讯中的功能和调控机制。
最后，外泌体在生理和病理过程中的应用是外泌体研究的重要方向之一、外泌体作为一种重要的细胞间信号载体，可以通过改变外泌体的组成和功能来调控细胞的生理状态。
通过人工制备外泌体，可以将特定的蛋白质、核酸和药物等载体到外泌体中，改变外泌体的功能并进一步实现治疗效果。
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3、CD90+ cells express the lncRNA H19 and release it viaexosomes
4、LncRNA H19 stimulates angiogenesis and promotes the adhesion of CD90+Huh7 cells to endothelial cell monolayer
1、CD90+ cells show a mesenchymal phenotype and actively release exosomes
2、Exosomes released by CD90+Huh7 cells affect HUVECs by promoting tube formation and cell-cell adhesion
8、lncARSR Functions as a ceRNA for miR-34 and miR-449 to Facilitate AXL and c-MET Expression
9、Targeting lncARSR Restores Sunitinib Response in RCC
总结：
外泌体研究方案。
2、外泌体研究关键点： 参与外泌功能的关键生物分子——细胞因子、 mRNA、lncRNA、miRNA、circRNA以及其他。
3、外泌体设计基本思路有：关键生物分子到外泌无法改变一定或有效应受体（供体有时会忽略， 例如血清来源外泌体等
实例一 由生物分子到外泌体
2、lncARSR Is Modulated by AKT/FOXO Axis in Sunitinib-Resistant RCC Cells
3、lncARSR Is Required for Sunitinib Resistance of RCC
4、lncARSR Levels in Plasma and Tumor Tissues Correlate with Sunitinib Response in RCC Patients
Tan A Advanced drug delivery reviews, 2013, 65(3): 357-367.
外泌体研究的兴起
2018外泌体中标项目研究的主要癌症种类
2018外泌体中标项目机制研究涉及的主要非编码RNA种类
2018外泌体中标项目的主要外泌体来源
外泌体研究基础技术
1、外泌体分离 1）超速离心 2）磁珠免疫捕获 3）沉淀或过滤法，
这篇文章中外泌体不是主角，外泌体只是作为长非编RNA功能作用机制的一个重要方面， 但总体上给我们展现了外泌体研究的一系列重要方法：
1）外泌体功能探讨的基础：供体细胞（舒尼替尼抗性肾癌细胞）/受体细胞（舒尼替你敏 感性肾癌细胞）。
2）外泌体功能前期预实验：功能生物分子位于外泌体中（图5A）、外泌体电镜检测（图 5B）、不同来源外泌体中功能分子的差异表达（图5C）、功能分子被特异包裹入外泌体的 关键蛋白检测（图5D）。 3）外泌体功能实验：外泌体处理细胞、外泌体进细胞核以及受供体细胞共孵育等。
实例二由外泌体到生物分子
Endothelial microparticles mediate inflammation-induced vascular calcification
1、TNF-a up-regulates EC BMP-2 expression through activation of NF-kB and stimulates the generation of EMPs
外泌体研究策略基本逻辑
外泌体研究的本质：供体细胞对受体细胞的功能影响，通过外泌这个介质发挥作用
Journal of Hematology & Oncology December 2015, 8:83
外泌体研究基本路线图
相互作用的受/供体细胞的选择
供体细胞外泌体分离和鉴定 外泌体对受体细胞功能的影响
6、Internalization of EMPs by VSMCs
实例三
CD90+ liver cancer cells modulate endothelial cell phenotype through the release of exosomes containing H19 lncRNA
外泌体研究策略
目录
一、外泌体概述 二、外泌研究兴起 三、外泌体基础研究技术 四、外泌体研究策略基本逻辑 五、外泌体研究实例
外泌体概述
Exosome是直径约为30-150nm，密度在1.13-1.21g/m1的小囊泡。Exosome天然存在于体液 中，包括血液、唾液、尿液和母乳，外泌体(Exosome)是活细胞分泌的来源于晚期核内体 (也称为多囊泡体 )的膜性囊泡。
5、Packaging of lncARSR into Exosomes Is Mediated by hnRNPA2B1
6、Intercellular Transfer of lncARSR by Exosomes Disseminates Sunitinib Resistance
7、AXL and c-MET Are Responsible for lncARSR-Mediated Sunitinib Resistance
2、Annexin V, calcium, and BMP-2 in EMPs from HUVECs stimulated by TNF-a BMP-2表面标记流式检测；SN50 nf-kb抑制剂
3、The effect of EMPs from HUVECs stimulated by TNF-a on VSMC calcification
外泌体能够影响受体细胞功能的因素：细胞因子、mRNA、 lncRNA、miRNA、circRNA以及其他。
外泌体研究整体研究策略
1、通常来说只要是涉及到两种不同细胞甚至同一 种细胞的两种不同状态：癌与正常细胞（癌转化 与抑制）、干细胞与高分化细胞损伤与修复）以 及功能状态细胞与非激活状态细胞，就可以设计
Exosome-Transmitted lncARSR Promotes Sunitinib Resistance in Renal Cancer by Acting as a Competing Endogenous RNA
1、lncARSR Is Highly Expressed in Sunitinib-Resistant RCC Cells
A：vs. NP; b：0.05 vs.HP plus Control-EMP; c：vs. HP plus TNF-a EMP. HP高磷、SN不含外泌体上清
4、Knockdown of BMP-2 in HUVECs produces nonmineralizing TNF-a-EMPs
5、EMPs from patients with CKD stimulate VSMC calcification and osteogenesis And from senescent HUVECs induce calcification and osteogenic changes of VSMCs
2、外泌体鉴定与定量 1）鉴定：电镜或NTA来分析其大小和形态，流式细胞仪或WB检测表面标记蛋白， Western blot和ELISA检测 TSG101、CD63。 2）定量：NTA检测外泌体数量，BCA定量检测蛋白浓度。
3、外泌体功能研究 1）荧光标记外泌体检测外泌体进入细胞 2）常规实验：外泌体处理细胞检测功能 3）WB/qPCR/荧光标记技术检测外泌体中发挥关键作用的生物分子在受体细胞胞核、胞质 以及外泌体中的表达。