大蒜素对人白血病HL_60细胞生长和凋亡的影响

Effect of grow th and apoptosis on human leukaem ia cells lin e HL 60 induced by allicin
HAO Y an m e 1, i 2 , ZHANG L in jie1 , L I Y u yun2 (1 . D epartment of Immuno logy, A nhuiM edical University, H efei 230032; 2. D ep ar t m ent of Laboratory M edicine, B engbu M edica l College, B engbu 233030 , China ) [ Abstract] Ob jec tive : To study the inh ib itory effects o f a llicin and its induction o f apoptosis on hum an leukem ia ce lls HL 60. M ethods : M TT w as used to study the inh ibito ry effects o f a llic in on HL 60 cells grow th and the typica l mo rpho logy charac ters of apoptos is induced by a llicin was observed w ith light m icro scope , and the apoptosis rate w as ana lysed by flo w cy to m etry( FCM ). Resu lts : M TT showed thatH L 60 cells w ere suppressed w ith dose dependent re lationship a fter exposed to a llicin of 20, 40, 60 m g /L. A llicin induced apoptosis o fH L 60 cells and apoptotic cells w ere supposed to be in itia ted in so m e phases o f cell cyc le by flow cy tom etry . Conc lu sion s : A llicin can inh ibit the g row th ra tes o f hum an leukem ia cellsH L 60 and induce its apoptosis . [ K ey words] leuke m ia ; HL 60 cell line ; a llicin ; apoptosis ; flow cyto m e try
* * ∃∃
* * ∃∃ 038 ##
q 检验 : 与对照组比较 , * * P < 0 . 01; 与 20 mg /L 组比较 , ∃ ∃ P < 0 . 01; 与 40 mg /L 组比较 , ## P < 0 . 01
2 . 2 细胞形态学观察 吖啶橙染色 , 荧光显微镜观 察 : 正常对数生长期 H L 60 细胞直径约 23 m, 核圆 形 , 核仁 3~ 5 个 (见图 1) 。凋亡细胞体积缩小, 染 色质浓聚, 呈新月形或由膜包裹着染色质块形成凋 亡小体凸起于细胞表面 (见图 2)。
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[ 文章编号 ] 1000 2200( 2007) 03 026 l,l M ay 2007 , Vo . l 32 , No . 3 基础医学
大蒜素对人白血病 HL 60 细胞生长和凋亡的影响
郝艳梅 , 张林杰 , 李玉云
1, 2 1 2
[ 摘要 ] 目的 : 探讨大蒜素对人白血病 H L 60 细胞生长抑制和 诱导凋亡作用。 方法 : M TT 比色分析法检测大蒜素对 HL 60 细胞 生 长的抑制作用 , 光镜观察细胞凋亡形态学变化 , 流式细胞术分析大蒜素对 H L 60 细胞凋亡的影响 。结果 : 20 m g /L 、 40 mg /L、 60 mg /L 大蒜素均能抑制 HL 60 细胞生长 , 其抑 制作用呈剂量 效应关系 , 40 mg /L 大蒜 素能诱导 HL 60 细 胞出现典型 凋亡形 态学变化。大蒜素诱导 HL 60 细胞有凋亡现象和阻滞细胞周期于 G2 /M 期。 结论 : 大蒜素 对人白血病 H L 60 细胞生长有抑制 作用 , 其抑制作用与诱导 HL 60 细胞凋亡和阻抑细胞周期有关。 [ 关键词 ] 白血病 ; HL 60 细胞株 ; 大蒜 素 ; 凋亡 ; 流式细胞术 [ 中国图书资料分类法分类号 ] R 733 . 7 [ 文献标识码 ] A
2 . 3 诱导 H L 60 细胞凋亡的结果 40 m g /L 大蒜 素作用于 HL 60 细胞 48 h 后采用 FCM 检测细胞凋 亡, 结果见图 3 、 4。
大蒜素组 ( mg /L) 20 40 60
* *
17 . 54 47 . 01 63 . 81 91 . 45 < 0 . 01 0 . 002
蚌埠医学院学报 2007年 5月第 32 卷第 3 期 1 . 4 细胞 形态学观 察 取 对数生长 期细胞 经 40 m g /L 大蒜素作用 48 h, 经吖啶橙染色, 荧光显微镜 观察细胞形态变化。 1 . 5 细胞凋亡检测 用含 10 % 小牛血清的 RPM I 1640培养液将对数生长期的 H L 60细胞配制成 5 ! 5 10 个 /m l细胞悬液, 加入 40 m g /L 的大蒜素 , 同时 设阴性对照组。大蒜素作用 48 h 后收集细胞, 用冷 PBS 洗涤, 去除上清后按 A nnex in V F I TC 试剂盒说 明书操作, 加入 5 lAnnex in V F I TC 和 10 l P I , 1h 内用流式细胞仪 ( BD FACSC ailbur)检测细胞的凋亡 ( 激发光 488 nm ) 。 1 . 6 细胞周期检测 药物与 H L 60 细胞共同培养 48 h , 收集 细胞, 收集的 细胞以 PBS 洗 2 次后 , 以 70% 乙醇固定 1 h 以上, 1 500 r /m in 离心 5 m in ,弃 去乙醇 , PBS 洗 2 次 , 加入 10 g /m l的 Rnase 酶消 化 30 m in , 加入 50 g /m l的 P I避光存放 30 m in 以 上 , 加入适量 PBS , 流 式细 胞仪检 测。采用 M od if it 进行细胞周期各期的 百分比分析。相同实验重复 3 次。 1 . 7 统计学方法 采用方差分析和 q 检验及 t 检 验。 2 结果 2 . 1 大蒜素对 HL 60 细胞的生长抑制作用 对照 组 HL 60 细胞生长活跃, 大蒜素组 H L 60 细胞生长 均不同程度地减慢, 从 MTT 比色分析法得出的吸光 度 ( A )结果可以看出 , 大蒜素对 H L 60 细胞的抑制 作用随其浓度的增加而增大, 呈剂量 - 效应关系, 且 不同浓度各组之间细胞吸光度差异均有统计学意义 (P < 0 . 01) ( 见表 1) 。
2 . 4 细胞周期的影响 结果显示 , 大蒜素组与对照 组细胞周期同期比较 , 大蒜素组细胞周期 G0 /G1期 细胞 含 量 下 降 , 而 G2 /M 期 细 胞 含 量 上 升 ( P < 0 . 001) ( 见表 2及图 5 、 6) 。
表 2 大蒜素对 HL 60 细胞周期比例的影响 ( n i = 3; x ∀ s )
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J Bengbu M ed Co l,l M ay 2007 , Vo . l 32 , No . 3
3 讨论 肿瘤的发生是一个复杂的、 多步骤的过程。从 分子生物学角度看, 正常情况下细胞增殖与细胞凋 亡之间保持着一种动态平衡 , 这种平衡是维持多细 胞生物自身稳定的重要因素。一般认为肿瘤的发生 是由于某种原因导致原癌基因的激活或抑癌基因的 失活, 扰乱了细胞正常的增殖、 分化和凋亡。因此 , 要抑制肿瘤细胞的生长 , 一方面可以通过影响细胞 周期, 使其不能进行正常的有丝分裂 , 另一方面可以 促进 细 胞 凋 亡 , 以 达 到 治 疗 目 的。 本 实 验 发 现 40 m g /L 大蒜素体外作用于 HL 60 细胞 48 h 后光 镜下可见凋亡细胞形态学变化 ; 在细胞凋亡早期位 于细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸 ( Phosphatidy lserine, PS) 就可迁移至细胞膜外侧 , 记上荧光素的磷脂酰 结合蛋白 V ( Annex in V ) 对 PS 有高度的亲合力 , 结 合不能透过完整的细胞膜而能够透过凋亡中晚期细 胞和 死 细 胞 膜 的 核 酸 染 料 碘 化 丙 啶 ( prop id in e iod ide, P I), 进行凋亡细胞双染 , 本实验用流式细胞 术检测到了 HL 60 细胞经 40 m g /L 大蒜素作用 48 h 后 , 既有中晚期凋亡又有早期凋亡。 大蒜素是大蒜中主要生物活性成分的总称 , 纯 品大蒜素为无色油状物, 分子式 C6H 10 S2 O。近年来 国内外的流行病 学调查发现 , 大蒜素对胃 癌、 结肠 [ 4] 癌、 白血病等肿瘤有一定 的抑制作用 , 有些研究 提示大蒜素可以诱导细胞凋亡 , 但具体机制不明, 可 [ 5] 能的诱导凋亡途径为 : ( 1) 对端粒酶的影响; ( 2) k ip1 对 cyc linD 和 p27 表达的影响; ( 3)对 bc l 2 、 bax 蛋 白表达的影响; ( 4) 对 caspase 蛋白表达的影响; ( 5) 对第二信号系统 cAMP、 PKC 途径的影响等, 但在不 同的肿瘤细胞作用的 环节也不相同。本实验通过 M TT 比色分析法证实 大蒜素对 体外培养 的 H L 60 细胞有明显的生长抑制作用, 且在一定剂量范围内 , 随着剂量的增加 , 抑制作用逐渐增强 , 其抗增殖作用
埠医学院 免疫 实验中 心留 存 ); RPM I1640 ( GIBCO 公司 ) ; MTT 试剂 ( F luka Chem ic AG 公司 ) ; 新生小 牛血清 ( 杭州四季青生物材料有限公司 ) ; Annex in V F ITC 试 剂 盒 ( 晶 美 生 物 公 司 产 品, 批 号 20060901); 大蒜素 ( 新疆新北制药有限责任公司产 品, 批号 20050901)。 1 . 2 细胞 培养 人 白血 病 HL 60 细 胞用 RPM I 1640 培养液 ( 含 10 % 小牛血清、 硫酸庆大霉素 5 万 u /L、 p H 7. 20), 于 37 、 5 % CO2 培养箱培养。细胞 2~ 3 天传代 1 次 , 1 周 2~ 3 次。 1 . 3 MTT 检测大蒜素对 HL 60 细胞生长抑制作用 用含 10 % 小牛血清的 RPM I 1640 培养液将对数 5 生长期的 HL 60 细胞配制成 5 ! 10 个 /m l细胞悬 液, 每孔 100 l加入 96 孔培养板内。实验设阴性 对照组和 3 个不同浓度的大蒜素药物实验组, 在 96 孔培养板内 , 每孔加药, 使终浓度 分别为 20 、 40 和 60 m g /L, 每个剂量 4 个平行孔。在 37 、 5 % CO 2 箱内培养 48 h 后取出离心, 吸弃上清, 每孔加无血 清 1640 培养液 100 ,l MTT ( 5 m g /m l) 10 , l 再培养 4 h, 离心 , 弃上清。每孔加 100 l二甲亚砜 , 振摇至 结晶溶 解后 酶 联 仪测 定 吸 光 度 A 值 ( 测 试 波 长 570 nm ) 。按以下式计算实验组细胞生长抑制率 : 细胞生长抑制率 = ( 1- A实验 /A对照 ) ! 100%