应用CRISPR技术制备ATG7基因Knockout的N2a细胞的试验研究宋
敲除zDHHC17基因的N2a细胞系及其构建方法和试剂盒[发明专利]
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专利名称：敲除zDHHC17基因的N2a细胞系及其构建方法和试剂盒
专利类型：发明专利
发明人：刘慧聪,饶木顶,焦雪苗,吴灿,孔二艳,张中健
申请号：CN201910160654.3
申请日：20190304
公开号：CN109735501A
公开日：
20190510
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了敲除zDHHC17基因的N2a细胞系及其构建方法和试剂盒，所述方法为利用CRISPR‑Cas9系统的构建方法，能够兼顾质量和效率，准确而高效。
由于zDHHC17是一种重要的棕榈酰修饰酶，通过调控靶蛋白的棕榈酰化修饰修饰影响蛋白功能；zDHHC17又称为亨廷顿互作蛋白(Hip14)，与亨廷顿疾病的发病机理密切相关。
敲除zDHHC17基因的N2a细胞系易于扩增培养，方便提供大量的生物样本，易于其靶标蛋白的发现研究；易于特异的研究其靶蛋白的调节功能及相关的信号通路。
因此，敲除zDHHC17基因的N2a细胞系可用于其棕榈酰化底物的功能研究和亨廷顿疾病的发病机理研究。
申请人：新乡医学院
地址：453003 河南省新乡市红旗区金穗大道601号新乡医学院精神神经医学研究院
国籍：CN
代理机构：北京冠榆知识产权代理事务所(特殊普通合伙)
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基因敲除技术的原理及应用
基因敲除技术的原理及应用1. 什么是基因敲除技术？基因敲除技术是一种用于研究基因功能的重要工具。
它通过针对特定基因进行序列特异性的基因组改变，从而使该基因在细胞或有机体中无法正常表达。
基因敲除技术可以通过多种方法实现，包括CRISPR/Cas9技术、RNA干扰技术等。
2. 基因敲除技术的原理基因敲除技术的原理是通过引入带有特定敲除序列的DNA或RNA分子，干扰目标基因的正常表达，从而导致该基因在细胞或有机体中无法产生功能性蛋白质或RNA。
具体的原理可以通过以下步骤进行解释：•设计敲除序列：根据目标基因的DNA序列，设计敲除序列，一般是由数十个碱基组成的寡核苷酸序列。
这个敲除序列将与目标基因的DNA序列互补匹配。
•传递敲除序列：将设计好的敲除序列导入目标细胞或有机体中。
传递方式可以包括转染、电穿孔等多种方法。
•敲除序列与目标基因结合：敲除序列与目标基因的DNA序列互补配对，形成双链结构。
这种配对会触发细胞内的DNA修复系统。
•DNA修复系统介入：细胞内的DNA修复系统会介入敲除序列与目标基因的配对，将目标基因的DNA序列修复或剪切。
•基因无法表达：通过以上步骤，目标基因的DNA序列被修复或剪切，导致基因在细胞或有机体中无法正常表达。
3. 基因敲除技术的应用基因敲除技术在生物学研究和生物医学领域有着广泛的应用。
下面列举几个常见的应用领域：•基因功能研究：通过敲除目标基因，研究其对细胞生理过程和有机体发育的影响，揭示基因功能与疾病发生之间的关系。
•疾病模型构建：利用基因敲除技术，构建动物模型来模拟人类遗传疾病，研究病理机制、筛选新药物。
•基因治疗：通过基因敲除技术，研究特定疾病相关基因的功能，为基因治疗提供理论和实验依据。
•农业转基因研究：基因敲除技术在农业领域可以用于研究植物基因的功能，提高作物抗病虫害能力、调控植物生长和发育等。
4. 基因敲除技术的优势与局限性基因敲除技术具有以下优势：•高效性：基因敲除技术可以精确地靶向特定基因，对其进行敲除，从而实现高效的基因敲除。
用于CRISPR文库筛选的N2a-Cas9细胞系的构建
中国预防兽医学报Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine第42卷第12期2020年12月V ol.42No.12Dec.2020doi ：10.3969/j.issn.1008-0589.202002012用于CRISPR 文库筛选的N2a-Cas9细胞系的构建张纪文，王露露，李芳，刘杏，赵东明*，步志高*（中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室，黑龙江哈尔滨150069）摘要：为了进行CRISPR 文库筛选，本研究采用慢病毒转导的方法利用N2a 细胞构建表达Cas9蛋白的N2a-Cas9单克隆细胞系。
实验将LentiCas9-Blast 、pSPA X2和pMD 2.G 3种质粒共转染人胚胎肾细胞（HEK293T ）获取高滴度的重组慢病毒，收集重组慢病毒并感染N2a 细胞，经杀稻瘟菌素（Blasticidin ）筛选，通过有限稀释法获得含有Cas9基因的多个单克隆细胞株。
Western blot 结果显示候选细胞系高水平表达Cas9蛋白；利用慢病毒表达报告基因载体系统检测显示候选细胞系的Cas9蛋白具有很高的切割活力；利用CellTiter-Glo 试剂检测结果显示，Cas9基因在候选细胞系内高表达但不影响细胞增殖活性。
本研究利用慢病毒转导系统构建了稳定表达Cas9蛋白的N2a-Cas9单克隆细胞系，为基于CRISPR/Cas9全基因组高通量筛选技术探究神经细胞内关键宿主基因调控狂犬病病毒嗜神经性提供研究基础。
关键词：基因编辑；慢病毒；高通量筛选；鼠神经瘤母细胞中图分类号：S852.65文献标识码：A文章编号：1008-0589（2020）12-1292-04Construction of N2a-Cas9cell line for genome-wide CRISPR screeningZHANG Ji-wen,WANG Lu-lu,LI Fang,LIU Xing,ZHAO Dong-ming *,BU Zhi-gao *(State Key Laboratory of Veterinary Biotechnology,Harbin Veterinary Research Institute,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Harbin 150069,China)Abstract :In this study,mouse neuroblastoma (N2a)cells were used to construct N2a-Cas9cell line which stably expresses Cas9protein by using lentivirus transfection technology.This constrcted cells line laid the foundation for CRISPR library screening.First,three plasmids including LentiCas9-Blast,pSPA X2,and pMD 2.G were co-transfected into human renal epithelial cells (HEK293T)to obtain recombinant lentivirus with high titers.N2a cells were infected with the recombinant lentivirus,and then screened by Blasticidin.Finally,several monoclonal cell lines expressing Cas9protein were isolated by limiting dilution.The expression of Cas9expression in N2a-Cas9cell line was determined by western blot,and the high cleavage activity of Cas9was also examined by using lentivirus-based reporter vector system.By using CellTiter-Glo ®reagent,the cell proliferation activity was well detectable and not decreased in N2a-Cas9cell lines,where Cas9gene was expressed in a high level.Therefore,N2a-Cas9cell line was successfully constructed using a lentiviral transfection system,which can provide a basis for genome-wide CRISPR screening to identify crucial host factors regulating Rabies virus neuro-tropism.Key words :gene editing;lentivirus;genome-wide CRISPR screening;murine neuroblastoma收稿日期：2020-02-11基金项目：兽医生物技术国家重点实验室自主课题（SKLVBP201801）作者简介：张纪文（1993-），男，河南驻马店人，硕士研究生，主要从事兽医微生物及其分子生物学研究.*通信作者：E-mail ：****************；*********************Corresponding author张纪文，等.用于CRISPR文库筛选的N2a-Cas9细胞系的构建第12期CRISPR-Cas9（Clustered regularly interspaced short palindromic repeat sequences/CRISPR-associated protein 9）是存在于细菌或古生细菌中的一种抵御外源DNA 侵入的适应性免疫反应系统[1]。
基因敲除实验步骤
基因敲除实验步骤嘿，咱今儿就来讲讲基因敲除实验这档子事儿！你想啊，这基因就好比是生物体的一套神秘密码，而基因敲除呢，就是要去修改或者删掉其中的一些关键部分。
这可不容易，但别怕，咱一步一步来。
首先呢，得选好你要敲除的那个基因，这就像是在茫茫密码本里找到你要动的那一部分，得精准，可不能找错咯。
然后，设计出专门针对这个基因的工具，就像是一把特制的小钥匙，能准确地去开启或者关闭这个基因。
接下来，就是把这个工具送到细胞里面去。
这可不是随便就能送进去的呀，得用些巧妙的办法，比如利用一些载体，就好像给这把小钥匙找了个合适的交通工具，让它能顺利到达目的地。
到了细胞里，这工具就开始发挥作用啦！它会找到目标基因，然后按照我们的设计，要么把它删掉，要么让它失去功能。
这过程中，可得时刻留意着，看看是不是真的敲除成功了。
怎么看呢？那就得用各种检测手段啦，就像给细胞做个体检，看看那个基因是不是真的被搞定了。
你说这像不像一场和基因的小战斗？我们就是那指挥作战的将军，得精心策划每一步，稍有不慎可就前功尽弃啦！而且啊，这实验可不是一次就能成功的哟，有时候可能得反复尝试好多回呢。
就跟你学骑自行车似的，一开始总会摔倒，但多练几次不就会了嘛。
在做基因敲除实验的时候，还得特别小心，别一不小心敲错了其他基因，那可就麻烦大啦！这就好比你本来想去剪个头发，结果一剪刀下去，把耳朵给剪了，那可不行呀！总之呢，基因敲除实验是个精细活儿，需要我们有耐心、有技术、还要有那么一点点运气。
但一旦成功了，那可就太有成就感啦！说不定还能为科学研究做出大贡献呢！所以呀，别害怕，大胆去尝试，说不定你就是下一个基因敲除大师哟！。
拟南芥At4g37820基因CRISPR敲除与表型分析
拟南芥At4g37820基因CRISPR敲除与表型分析拟南芥At4g37820基因CRISPR敲除与表型分析引言：拟南芥（Arabidopsis thaliana）是一种常用的模式植物，被广泛用于植物生物学研究。
近年来，CRISPR-Cas9基因编辑技术的出现，使得研究者能够更方便地对拟南芥基因进行精确操控和功能验证。
本文通过CRISPR-Cas9技术对拟南芥基因At4g37820进行敲除，进一步研究At4g37820在拟南芥生长发育中的表型变化与调控机制。
材料与方法：首先，设计合适的CRISPR引物以定点敲除At4g37820基因。
通过体外转录和翻译后的Cas9蛋白与设计的sgRNA形成RNP复合物，并导入拟南芥野生型株系进行基因敲除。
随后，使用PCR和测序技术验证克隆株中的敲除突变，筛选出目标敲除的阳性植株。
结果与讨论：经过筛选，我们成功获得了多个At4g37820基因敲除的阳性拟南芥株系。
通过对比野生型和敲除株系的生长形态观察，发现At4g37820基因敲除株系的株高显著低于野生型株系。
同时，叶片形态也发生了明显变化，敲除株系的叶片更小且形状异常。
进一步的根系形态观察表明，敲除株系的根长和根数也减少。
这些表型变化与At4g37820基因在拟南芥发育过程中扮演的角色密切相关。
At4g37820基因是一种编码无机磷转递酶（inorganic phosphate transporter）的基因，主要参与植物对磷素的吸收和运输。
拟南芥作为一种基于土壤营养状况对营养素吸收和分配高度敏感的植物，At4g37820基因在磷素代谢中的重要性不言而喻。
敲除At4g37820基因导致根系对磷素的吸收能力下降，从而影响了植物的生长发育。
进一步的研究表明，At4g37820基因的敲除还影响了植物的叶绿素合成和光合作用效率。
叶绿素含量减少导致叶片逐渐变黄，减弱了光合作用的能力，进而影响植物的光合产物合成和生长发育。
自学自讲(基因敲除)
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治疗措施研究方面的应用
急性排斥反应的半乳糖转移酶基因敲除, 用 此方法培育的动物的器官可以移植到人体而无 排斥反应。他们已成功培育半乳糖转移酶基因 敲除猪, 且已经开展了将该基因敲除猪的心脏 移植至狒狒体内的实验,经移植后的狒狒存活了 2 -6 个月( 均值为 78天),且均未出现超急性排斥 反应的表现。
gene double knockout mice[ J] . FASEB J. 1999, 13( 6): 667-75.
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参考文献
[ 5 ] Leheste JR, Melsen F , Wellner M, et al.Hypocalcemia and osteopathy in mice with kidney-specific megalin gene defect[ J] .
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免疫学方面的应用
近年来,在免疫学方面出现了几十种免疫分子 基因敲除动物模型, 将免疫学研究特别是免疫 耐受的研究推到一个新的阶段 。例如: TCR 基 因敲除后 ,小鼠胸腺发育不全, 脾中 B 细胞增多 ; 免疫球蛋白 u链基因被敲除后 ,B 细胞发育受 阻 ; MHC I 和 II 类抗原基因敲除后, 小鼠缺乏 CD4 +、CD8 +型 T 细胞; β2
insights on the pathogenesis of ocular albinism type 1[ J] .Hum Mol
Genet . 2000, 9( 19): 2781-2788. [ 4] Witting PK, Pettersson K, Ostlund-Lindqvist AM , et al.Inhibition by a coantioxidant of aortic lipoprotein lipid peroxidation and atherosclerosis in apolipoprotein E and low density lipoprotein receptor
基因敲除方法的原理应用
基因敲除方法的原理应用1. 概述基因敲除是一种常用的遗传学实验技术，通过将目标基因从细胞或生物体中删除，以研究基因在生物体中的功能和调控机制。
本文将介绍基因敲除方法的原理和常见应用。
2. 基因敲除方法的原理基因敲除方法主要包括两个步骤：构建敲除基因载体和敲除基因导入目标细胞或生物体。
2.1 构建敲除基因载体1.确定目标基因：首先需要确定要敲除的目标基因。
可以通过文献资料和数据库查询，分析基因序列和功能等信息，选择合适的目标基因。
2.设计敲除基因：设计针对目标基因的敲除基因，通常采用DNA重组技术构建。
敲除基因通常包括选择标记基因和目标基因序列特异性引物。
3.构建敲除基因载体：将设计好的敲除基因插入适当的载体中，如质粒或病毒载体。
2.2 敲除基因导入目标细胞或生物体1.选择合适的敲除基因导入方法：根据目标细胞或生物体的特性和要求，选择合适的基因导入方法，常见的方法包括细胞转染、病毒载体导入和转基因动物等。
2.导入敲除基因：将构建好的敲除基因载体导入目标细胞或生物体中，通过基因重组等技术使敲除基因与目标基因发生相应的重组事件。
3. 基因敲除方法的应用基因敲除方法被广泛应用于基因功能研究、药物研发、疾病模型构建等领域。
以下列举几个常见的应用案例：3.1 基因功能研究通过基因敲除方法，可以在细胞或生物体中敲除目标基因，观察其对生物体的影响，以揭示目标基因在生物体中的功能和调控机制。
例如，敲除特定的转录因子基因，可以研究其对基因表达和细胞分化的影响。
3.2 药物研发基因敲除方法可以用于筛选药物靶点和评估药物疗效。
通过敲除潜在的靶点基因，观察其对疾病模型动物的影响，以评价该靶点的重要性和药物的效果。
这对于药物研发和治疗策略的选择具有重要意义。
3.3 疾病模型构建利用基因敲除方法，可以构建基因敲除动物模型，模拟特定疾病的发生和发展过程。
通过敲除与疾病相关的基因，可以研究疾病的发病机制、病理过程和药物治疗的有效性。
基因敲除技术的基本原理和应用
基因敲除技术的基本原理和应用1. 基因敲除技术的概述基因敲除技术是一种通过人为干预来改变生物体特定基因表达的方法。
它是基于基因组工程技术的基础上发展起来的。
2. 基因敲除技术的基本原理基因敲除技术的基本原理是通过人为设计和构建特定的DNA序列，通过转染或转化将其导入到目标细胞中，从而抑制或破坏目标基因的正常功能，进而实现对目标基因的敲除。
3. 基因敲除技术的方法3.1 siRNA敲除法siRNA（small interfering RNA）是一种通过RNA干扰机制来靶向特定基因的技术。
它通过设计合成与目标基因互补的双链小分子RNA，并通过导入细胞内抑制目标基因的表达。
3.2 CRISPR-Cas9系统CRISPR-Cas9系统是一种新兴的基因编辑工具，可以实现高效、精准地靶向敲除目标基因。
该系统包括CRISPR RNA (crRNA) 和转录单元结合酶Cas9。
通过引导RNA与Cas9结合，可精确指导Cas9蛋白靶向到特定的DNA序列，从而实现基因敲除。
3.3 TALEN技术TALEN（Transcription activator-like effector nuclease）技术是一种利用转录激活样结构域的蛋白质与核酸酶结合来敲除基因的方法。
它可以实现对特定DNA序列的敲除，具有较高的精准性和特异性。
4. 基因敲除技术的应用4.1 功能基因研究基因敲除技术可以帮助研究人员确定特定基因在生物体发育、生长、代谢等方面的作用。
通过敲除特定基因，可以观察到其缺失对生物体功能的影响，从而揭示出该基因的功能和作用机制。
4.2 疾病模型研究基因敲除技术可以构建疾病模型，帮助研究人员深入了解某些疾病的发生机制。
通过敲除与特定疾病相关的基因，在动物模型中观察到与人类疾病相似的表型，可以用来研究疾病的发展过程和潜在治疗方法。
4.3 基因治疗基因敲除技术可用于基因治疗，即通过敲除异常基因来恢复或调节正常基因的功能。
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应用CRISPR 技术制备ATG7基因Knockout的N2a细胞的实验研究
宋福永1小潘美贵2小松雅明2
1山东大学公共卫生学院卫生毒理学系，山东济南 250012
2 新泻大学医学部第一生化研究室，日本新泻 951-8510
（*通讯作者：宋福永，E-mail: fysong3707@）
摘要：【目的】Clustered regularly interspaced short palindromic repeats /CRISPR-associated 9 (CRISPR/Cas9) 技术是基因定点修饰的最新技术，它通过crRNA 和Cas 蛋白所形成的核蛋白复合物对靶基因的PAM和protospacer序列进行特异性识别，实现基因组的精确修饰。
Neuro-2a (N2a) 细胞是小鼠神经瘤细胞，经诱导能分化成神经元样细胞，且对有机磷毒物具有良好的反应性，因此被作为评价有机磷神经毒性的首选细胞株。
本研究拟利用CRISPR-cas 9技术制备ATG7基因Knockout 的自噬缺陷型N2a细胞，以便于深入地探讨细胞自噬与有机磷化合物的神经毒性之间的关系。
【材料和方法】⑴设计合成1对ATG7 靶向序列（上链：TGTATGAGACCACGAAGTTGAACAGTACCGCC，下链：AAACGGCGGTACTCGTTCAACTTGTGGTCTCA）；⑵ATG7靶向引物变性与Cas9 smart Nuclease Vector的连接；⑶转染E. coli，提取质粒DNA测序验证；⑷将Cas9-ATG7质粒DNA、pBHR-Vector、FuGENE HD按比例混合，转染N2a细胞；⑸荧光显微镜观察N2a细胞GFP表达，利用嘌呤霉素筛选；⑹FACS流式细胞仪单细胞分选培养；⑺提取克隆细胞的DNA，PCR 扩增ATG7 (上游引物为TGTTTTGGTAGGCTGGTAAG；下游引物为CAATATAGAACGGATGCCCT，利用异源双链泳动分析(HMA)技术检测ATG7突变体；⑻将筛选的ATG7突变细胞培养，Western Blot检测ATG7表达，将筛选出的ATG7-/-细胞扩大培养；⑼利用饥饿诱导法验证自噬活性，即EBSS处理细胞4小时，提取细胞蛋白，Western Blot检测LC3的表达。
【结果】⑴DNA测序：经DNA测序证实ATG7靶向序列插入到Cas9 smart Nuclease Vector，表明
Cas9-ATG7质粒构建成功。
⑵ HMA检测：Cas9-ATG7质粒转染的N2a细胞经过嘌呤霉素筛选，流式细胞仪单细胞分选培养96孔板5个，2周内共生长出 126个细胞克隆中，经HMA检测发现57株ATG7突变细胞。
⑶Western Blot检测ATG7表达：ATG7突变细胞扩大培养后，Western Blot检测发现有3株细胞不表达ATG7，即为ATG7-/-的N2a细胞。
⑷细胞自噬活性鉴定：上述3株细胞经EBSS处理后，WB检测仅观察到LC3-Ⅰ，未观察到LC3-Ⅱ。
在此基础上，我们又利用溶酶体抑制剂（E64d 和pepstatin A，EP）阻断自噬降解途径，进一步观察了细胞自噬流的影响，仍未观察到LC3-Ⅱ。
实验结果证实上述3株细胞均为自噬缺陷型细
胞。
【结论】ATG7是自噬体形成中ATG12泛素样连接系统的关键酶。
它通过激活ATG12，参与Atg12-Atg5-Atg16二聚体的形成，是隔离膜(isolation membrane)延伸并形成自噬体所必需的。
在本研究中，我们利用CRISPR/Cas9 技术成功制备了ATG7-/-的N2a细胞，经鉴定为自噬缺陷型细胞。
关键词：自噬，CRISPR，N2a细胞。