第八章外源基因表达产物的分离纯化

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基质
c. 待纯化分子与亲和吸附剂结合，与杂质分离
离子交换琼脂糖：
离子交换琼脂糖是携带DEAE或CM基团的Sepharose CL-6B
具有硬度大、性质稳定，流速好，分离能力强等优点
尤其是介质受pH和离子强度的影响所引起的膨胀和收缩效应较小，因
此具有稳定的外形体积
离子交换介质的选择原则
一般而言： 酸性物质用阴离子交换剂分离 碱性物质用阳离子交换剂分离 氨基酸、核苷酸、蛋白质等两性电解质，可根据其pI值及离子化 曲线来选择
采用包涵体型战略表达重组蛋白，应先离心回收包涵体； 采用融合型战略表达重组蛋白，一般是胞内可溶性的，拟首先选
用亲和层析进行纯化 表达在细胞膜和细胞壁之间的间隙中的蛋白质，应用低浓度的溶 菌酶处理，然后再用渗透压休克法释放重组蛋白。
2. 针对不同性质的重组蛋白选择不同的层析类型
等电点处于极端区域（pI≤5 或 pI≥8）的重组蛋白应首选离子 交换法进行分离，这样很容易除去几乎所有的杂蛋白； 重组蛋白特异性的配体、底物、抗体、糖链等都是首选亲合层析 疏水层析和反相层析是根据蛋白质的疏水性差异进行分离的； 凝胶过滤层析是根据蛋白的分子量和体积差异进行分离的；
操作压控制
平衡和洗脱时应维持流速恒定
进样体积
上柱样品溶液的体积根据分离要求来确定： 进行组别分离时，样品溶液最大可为柱体积的10% 进行分级分离时，样品溶液的体积要小，使样品层尽可能
窄，这样洗脱出的峰形好
3. 亲和层析
亲和层析的基本概念 亲和层析载体的性质与选择
亲和层析配基的性质与选择
亲和层析的基本操作
应首选CM纤维素
离子交换层析的基本操作
(1) 层析柱平衡
平衡缓冲液的用量至少为柱体积的 2 倍 平衡缓冲液的流速可略高于正常操作流速 平衡终点以流出液的离子浓度、导电性、pH值与缓冲液一致 为准，其中pH值最重要 目的：保证待分离物质如蛋白质的稳定； 使各个待分离物质与离子交换剂有适当的结合； 使待分离样品和杂质与离子交换剂的结合有较大的差别。
外，即全排阻；
鉴于上述原理，凝胶层析可用于重组蛋白溶液脱盐、分子量测定 以及分离纯化。
凝胶过滤的作用机制
带网孔的葡 聚糖珠
小分子进入 葡聚糖珠内
大分子不 能进入珠 内，经珠 之间缝隙 流出
凝胶过滤层析过程示意图
凝胶 珠
凝胶基质 小分子 大分子
凝胶过滤层析过程示意图
凝胶介质的基本性质
葡聚糖凝胶（ Sephadex ）
与此柱结合，然后盐梯度洗脱。
2. 凝胶层析
凝胶层析的基本原理 凝胶介质的基本性质 凝胶介质的选用原则 凝胶层析的基本操作
凝胶层析的基本原理
凝胶层析是利用有一定孔径范围的多孔凝胶作为固定相，对混合 物中各组份按分子大小进行分离的层析技术，又称为分子筛。
分子直径比凝胶最大孔隙直径大的，会被全部排阻在凝胶颗粒之
酸及其它生物分子的非特异性吸附能力小
电离基团在母体上取代程度高，交换容量大，装柱方便，流速快 既有离子交换作用，又有分子筛效应 因而Sephadex是一类广泛应用的色谱分离介质
常用的离子交换葡聚糖包括： 阳离子交换剂 CM-Sephadex C-25，CM-Sephadex C-50
阴离子交换剂
DEAE-Sephadex A-25，DEAE-Sephadex A-50 QAE-Sephadex A-25，QAE-Sephadex A-50
强离子交换剂的电离率基本不受pH值影响，离子交换作用的pH范围宽 弱离子交换剂的电离率受pH影响很大，离子交换作用的pH范围小 弱酸性阳离子交换剂在pH值降低时，其电离率逐渐降低，离子 交换能力逐渐减弱
弱碱性阴离子交换剂在pH值升高时，其电离率逐渐降低，离子
交换能力逐渐减弱
常用的离子交换剂
离子交换树脂： 最常见的离子交换树脂是含有酸性或碱性基团的人工合成的聚苯 乙烯-二乙烯苯不溶性高分子化合物 离子交换树脂的优点是：流速快，对小分子物质的交换容量大， 因而适合用于氨基酸、核苷酸等小分子生化物质的分离纯化
离子交换剂的分类
阳离子交换剂：强酸型和弱酸型
阴离子交换剂：强碱型和弱碱型
阳离子交换剂 分为强酸型、中强酸型和弱酸型三类，强酸型含有－R－SO3H，中强 酸型含有－PO3H2、－PO2H2或－O－PO2H2，弱酸型含有－COOH或－ OH。 阳离子交换进行的反应如下：
阴离子交换剂 分为强碱型、中强碱型和弱碱型三类，含有四级铵盐 [ －N+(CH3)3] 为强碱型，三级以下铵盐 [－N(CH3)2]、[ －NHCH3]、[ －NH2] 都属弱 碱型；同时具有强碱和弱碱型基团的，为中强碱型。 阴离子交换树脂进行的反应如下：
二、常用的分离方法
1. 离子交换层析
离子交换层析的基本原理 离子交换介质的基本性质 离子交换介质的选择原则 离子交换层析的基本操作
离子交换层析的基本原理
离子交换层析是以离子交换剂为固定相，以特定的含离子溶液为
流动相，利用离子交换剂对待分离的各种离子结合力的差异，而将混合物进行分离的ຫໍສະໝຸດ 析技术。离子交换介质的基本性质
3. 多种分离纯化技术的联合运用
在选择分离纯化方法时应遵循下列原则： 应选择不同分离纯化机理的方法联合使用 应首先选择能除去含量最多杂质的方法
应尽量选择高效的分离方法
应将最费时、成本最高的分离纯化方法安排在最后阶段
4. 合适分离纯化介质的选择
常用的蛋白质分离纯化介质有Sephadex和Superose。 理想的分离纯化介质应具有下列性质：
离子交换剂的基本性能
离子交换剂亦称离子交换介质，通常是一种不溶性高分子化合物 如树脂，纤维素，葡聚糖，醇脂糖等；
离子交换剂中所含的可解离基团在水溶液中能与溶液中的其它阳 离子或阴离子起交换作用
不同蛋白质与离子交换剂之间形成离子键数目不同，即亲和力大 小有差异，因此只要选择适当的洗脱条件便可将混合物中的成分逐个 洗脱下来，达到分离纯化的目的
对目标蛋白具有较高的分离效率
对目标蛋白不会造成变性
化学性能和机械性能稳定，重复性好
价格低廉

Sephadex 是由葡聚糖通过环氧氯丙烷交联形成的三维 网状凝胶颗粒 Superose是在珠状琼脂糖颗粒的基础上经过两次交联后 得到的

5. 分离纯化过程的规模化
蛋白质分离纯化的实验室工艺、技术、方法在大规模产业化过程 未必合适，如： 实验室方法在工程上可能难以实现（超声波破细胞壁） 实验室方法在大规模生产中可能成本过高（超速离心） 因此，在很多情况下，实验室的技术路线不等于生产工艺。
质也存在等电点（pI），蛋白质在溶液中带电状况同氨基酸相同， 取决于所处溶液的pH 值。 当pI < pH时，蛋白质带净负电荷；而当 pI > pH时，蛋白质带净 正电荷。 举一例子： 已知蛋白X等电点为7，设计实验利用阴离子交换树脂纯化。 答案： 建立阴离子交换柱，比如Q-Sepharose。用 pH8.5的缓冲液平 衡柱子，同时蛋白X溶解于pH8.5的缓冲液中，在此pH值下蛋白X带 有负电，将含有蛋白X的混合液上样，然后用起始液冲洗，蛋白X会
亲和层析的基本概念
亲和层析的基本特点
亲和层析是利用待分离物质与其特异性配体之间特异性的亲和力 进行分离的一类特殊的层析技术，它有如下特点： 纯化过程简单、迅速，且分离效率高 特别适用于分离纯化一些含量低、稳定性差的生物大分子 纯化倍数大，产物纯度高 必须针对某一分离对象制备专一的配基及寻求稳定的层析条件 因此应用范围受到一定的限制
具有特异性亲和作用的生物分子
抗原与抗体 DNA与互补DNA或RNA（cDNA、mRNA) 酶与其底物、竞争性抑制剂、辅酶因子 激素或药物与其受体
维生素于其特异性结合蛋白
糖蛋白与其相应的植物凝集素
亲和层析的基本原理
亲和的一对分子中的一方以共价键形式与不溶性载体相连 作为固定相吸附剂 当含有混合组份的样品（流动相）通过此固定相时，只有 和固定相分子有特异亲和力的物质，才能被固定相吸附结
琼脂糖凝胶
琼脂糖凝胶是由琼脂中分离出来的天然凝胶，常见的有Sepharose （ Sepharose 2B、4B、6B）。
当温度高于50℃时琼脂糖凝胶便融化，只能在较低的温度下使用。 琼脂糖凝胶是一种大孔凝胶，因而适合于分离分子量较大的生物大 分子物质（如蛋白质和DNA）。
聚丙烯酰胺凝胶
聚丙烯酰胺凝胶是一种以丙烯酰胺为单位由甲叉双丙烯酰胺交联 而成的人工合成凝胶，控制交联剂的用量可制成各种型号的凝胶，交
对pI=5的某酸性蛋白质 当蛋白质为阴离子时， 在pH5.5-9.0的范围内， 应首选DEAE纤维素； 当蛋白质为阳离子时， 在pH3.5-4.5的范围内，
蛋 白 质 净 电 荷
+
等电点 吸附阴离子交换剂 pH
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
吸附阳离子交换剂
pH < pI（+） pH = pI（0） pH > pI（-）
离子交换纤维素：
离子交换纤维素是携带功能基团纤维素衍生物，具有松散的亲水 性网状结构以及较大的表面积，大分子可以自由通过，因而对生物大 分子（如蛋白质）的交换容量比离子交换树脂大
阳离子型离子交换纤维素包括羟甲基纤维素（CM纤维素）等
阴离子型离子交换纤维素包括二乙基氨基乙基纤维素（DEAE纤
维素）
离子交换葡聚糖： 离子交换葡聚糖是葡聚糖经环氧氯丙烷交联后形成的具有多孔三 维空间网状结构并带有离子交换功能基团。 Sephadex的优点如下： 亲水性强、不会引起生物分子的变性和失活，母链对蛋白质、核
分级分离
将样品中一些分子量比较接近的物质分开，这种分离叫分级分离
分级分离一般选用排阻限度略大于样品中最高分子量物质的凝胶。 在层析过程中，样品中各组份均能不同程度地深入到凝胶内部，但由 于深入凝胶空隙程度上的差异，最后得到分离。