第六章 连续培养动力学
发酵工程原理与技术_陈坚_思考题
发酵工程原理与技术_陈坚_思考题第一章的复习思考题1，发酵及发酵工程的定义2，发酵工程的特点3，发酵的分类4，发酵产品的类型5，微生物代谢产物的类型及其之间的关系6，发酵过程的组成7，发酵生产成立的条件8，发酵工业发展的阶段及大致年代9，和国际先进水平相比较，我国发酵工业的不足之处主要表现在哪些方面第二章的复习思考题1，微生物代谢调节和微生物代谢调控的概念2，为何要进行微生物的代谢调控3，微生物代谢调节的方式4，从本质上来说，微生物的代谢是通过哪两种方式来进行的5，酶合成调节的方式及其定义、机制6，酶活性调节的定义、方式7，有分支代谢途径的调节方式有哪些8，酶活性的调节机制可用什么理论来解释9，初级代谢的调节有哪几种方式10，次级代谢的调节方式11，提高初级和次级代谢产物产量的方法12，高浓度细胞培养的目的、原理、优点、方法及存在的问题第三章的复习思考题1，次级代谢和次级代谢产物的概念2，次级代谢产物的分类3，次级代谢产物的生物合成模式4，在微生物的氢代谢过程中，关键的酶是什么酶，它有哪些类型5，氢效应的概念及产生的原因6，二氧化碳固定的概念、方式、生理意义7，什么是卡尔文循环，它由哪几个部分组成第四章的复习思考题1，原料的定义及选择原则2，培养基设计的基本原则及如何进行培养基的设计3，为何要进行原料预处理及原料预处理的方法4，原料粉碎的目的和方法5，垂式粉碎机生产能力的计算6，干法粉碎和湿法粉碎工艺的比较7，原料输送的方法8，气流输送的原理、流程和优点9，颗粒在垂直管道和水平管道中悬浮输送的机理10，气流输送中常用除尘装置有哪几种11，淀粉原料水-热处理的定义及目的12，淀粉的膨胀、糊化和液化13，在淀粉的水-热处理过程中有哪些反应（变化）是我们所不希望的14，淀粉的酶法液化和糖化工艺常用到的酶有哪些及各自的作用专一性15，酶法液化的工艺有哪几种及各自的优缺点16，淀粉液化效果的标准17，淀粉糖化的定义和目的18，淀粉糖化的理论收率、实际收率和淀粉转化率的定义及计算19，DE值的定义20，淀粉糖化的工艺有哪几种，比较各自的优缺点21，糖蜜原料的来源、特点及常用的处理方法22，在发酵培养基中添加前提物质、抑制剂和促进剂为何能提高产物的产量第五章的复习思考题1，何谓培养基的灭菌，它和消毒有和区别2，常用的灭菌方法3，致死温度、微生物热阻的定义4，湿热灭菌的原理和优点5，从工程角度看，设计一个培养基的湿热灭菌过程首先要解决的问题是什么6，根据微生物的热死灭动力学方程和温度对微生物热死灭常熟（K）的影响，论述为什么采用高温短时间灭菌既有利于杀灭微生物又有利于减少营养物质的破坏7，间歇灭菌的成功的要素及注意事项8，常用的连续灭菌工艺有哪几种9，连续灭菌和间歇灭菌的比较10，影响灭菌的因素第六章的复习思考题1，何谓无菌空气，发酵工业对空气无菌程度的要求2，空气含菌量的测定方法3，空气除菌的方法有哪些、这些方法的原理和优缺点4，介质过滤除菌的定义，机理；过滤介质的类型5，常见的空气过滤除菌工艺流程的分析计算6，过滤效率、对数穿透律7，传统空气过滤除菌工艺中的主要设备有哪些8，新型的空气过滤器有哪些，有何优点9，空气贮罐的作用是什么，其大小如何确定第七章的复习思考题1，种子的扩大培养的定义。
6第六章 发酵动力学
2.随着时间的延长，培养液中微生物细胞的 量c’(X)增加，但细胞的浓度却保持不变，即
dc(X) dt
= 0
3.因而µ≌D
这种微生物细胞的培养状态称为 ——“准恒定状态”
在“ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ恒定状态”下
c(S) ≈ DKs µm - D (4)
c’(X) ＝ c0’(X) + F · Yx/s · c ’0 (S) · t 补料液浓度
动力学方程
c0(S)——开始时培养基中限制性基质的浓度 g/L F——培养基的流速 L/h V——培养基的体积 L F/V＝D——稀释率 c0(X)——刚接种时培养液中的微生物细胞浓度 g/L c(X)——某一瞬间培养液中微生物细胞浓度 g/L c(X) = c0(X) + Yx/s [c0 (S) -c (S)]
v =
µ
YG
v =
+ m +
Qp Yp
+
(6)
µ Yx/s
(5)
少量的其他代谢产物和其他忽略 1 Yx/s 1 m + µ (7)
=
YG
YG和m很难直接测定，只要得出细胞在不同 比生长速率下的Yx/s，可根据(7)式用作图法 求出YG和m值。 YG和m值用于衡量发酵时限制性营养基质的 起始最低浓度。
µ µm
b µm/2
c
µ ＝
a
µm c(S)
Ks + c(S)
c(S)
Ks
Ks的物理意义
Ks的大小表示了微生物对营养物质的吸收亲 和力大小 Ks越大，表示微生物对营养物质的吸收亲 和力越小； Ks越小，表示微生物对营养物质的吸收亲 和力越大
发酵工程 第6章 发酵动力学
■将细胞作为与培养液分离的生物相处理所建立的模 型为分离化模型。在细胞浓度很高时采用。
如果把细胞和培养液视为一相，建立的模型为均一化 模型。
非结构模型
结构模型
最理想情况
确定论模型 不考虑细胞内部结构
各种细胞均一
均衡 细胞之间无差异， 生长 是均一的，细胞内
如果在考虑细胞组成变化的基础上建立的模型，称为结 构模型，一般选取RNA、DNA、糖类及蛋白含量做为过 程变量。
■菌体视为单组分的模型为非结构模型，通过物料平 衡建立超经验或半经验的关联模型。
如果细胞内的各种成分均以相同的比例增加，称为 均衡生长。
如果由于各组分的合成速率不同而使各组分增加比 例不同，称为非均衡生长。
（3）质量平衡法（质量守恒定律）
发酵系统中物 物质进入系统的速度＋物质在系统生成的速度 ＝
质积累的速度 －物质排出系统的速度－物质在系统消耗的速度
研究发酵动力学的步骤
(1). 为了获得发酵过程变化的第一手资料，要尽 可能寻找能反映过程变化的各种理化参数。
(2). 将各种参数变化和现象与发酵代谢规律联系 起来，找出它们之间的相互关系和变化规律。
S ——基质量，mol；
t ——发酵时间，h
注：这里的“维持”是指活细胞群体没有净生长和产物没有净合成的生 命活动，所需能量有细胞物质氧化或降解产生，这种用于“维持”的物 质代谢称为维持代谢（内源代谢），代谢释放的能量叫维持能。
（2）得率系数(或产率，转化率，Y)： 是指被消耗的物质和所合成产物之间的量的关系。包括生
基于关键生化反应限速步及其关键酶的动力学特征及其影响因素采用一系列分子水平的方法?细胞层次代谢网络与细胞工厂基于细胞信号传导代谢网络细胞物质运输的系列关键生化反应的综合表现采用一系列细胞水平的方法包括细胞群体行为分析?反应器层次过程工程基于细胞群体生长及产物合成对外部环境综合响应采用一系列优化反应器发酵条件的方法主要针对微生物发酵的表观动力学通过研究微生物群体的生长代谢定量反映细胞群体酶促反应体系的宏观变化速率主要包括
微生物工程简介(精)
《微生物工程》简介Microorganism Engineering一、课程编号：060342二、课程类型：限选课课程学时：48（其中，理论教学36学时/2学分，实践教学12学时/1学分）：适用专业：生物技术先修课程：本课程的先修课是微生物学、生物化学、有机化学、分析化学、细胞生物学等三、内容简介：微生物工程是生物工程的重要组成部分，是生物技术产业化的重要环节，是一门利用微生物的生长和代谢活动来生产各种有用物质的工程技术。
通过学习该课程，可以使了解我国发酵工业的实际情况和当前世界发酵工业发展的趋势和研究动态及发酵工程在生物技术产业化钟的作用。
本课程内容主要包括生产菌种的选育，发酵条件的优化和控制，反应器的设计和产物的分离、提取与精制等。
通过本课程的学习，学生能够掌握微生物的基本原理和基本操作流程，并初步具备开发新菌种、新工艺和新技术的能力。
四、选用教材：《微生物工程》，曹军卫、马辉文编著，科学出版社，2002年8月出版《微生物工程》教学大纲一、课程编号：060342二、课程类型：限选课课程学时：48（其中，理论教学36学时/2学分，实践教学12学时/1学分）：适用专业：生物技术先修课程：本课程的先修课是微生物学、生物化学、有机化学、分析化学、细胞生物学等三、课程性质与任务本课程为生物技术专业本科生指定选修课程。
生物技术包括基因工程、蛋白质工程、细胞工程、发酵工程（包括微生物工程）等领域。
在生物技术领域里，由于微生物生物技术的高速发展和对其他生物技术发展的重要影响，所以一直处于领先地位，并且还将在相当长的时期内处于领先地位。
本课程的任务为在微生物工程领域内将理科的有关知识与必要的工程技术知识有机地结合起来，在微生物学领域里给学生传授比较专业的理论知识，在工程技术领域里，使理科学生能够掌握基本的计算和设计工艺流程的原理和方法。
四、教学主要内容及学时分配理论教学内容及具体学时（36学时）分配如下表：第一部分微生物工程原理[目的要求]第一部分微生物工程原理包括9章，目的是介绍微生物工程的上游工艺原理。
发酵工程课程总结
代谢过程错综复杂，但受体内调 节系统严格控制，并按照顺序、协调 有效地进行，维持体内代谢平衡。
对微生物而言：
代谢过程----细胞内自我调节
微生物代谢调节方式:
生理碱性物质:
某些物质被微生物利用、氧化还原 后，可使pH上升，这些物质称为生理 碱性物质。
如有机氮源、硝酸盐、有机酸等。
生理酸性物质:
某些物质被微生物利用、氧化还原后， 使pH下降，这些物质称为生理酸性物质。
碳源代谢往往起到降低pH作用，例如， 糖类氧化不完全时产生的有机酸；脂肪不 完全氧化产生的脂肪酸、硅盐氧化后产生 的硫酸等。
pH影响结果
1.菌体大小、长度缩短、直径和数量。
2.pH影响细胞膜的电荷状态，进而引起 膜的渗透性发生改变，再进而影响菌体对 营养物质吸收和代谢产物的形成。对产物 的稳定性同样有影响。
3.pH对某些生物合成途径有显著影响
引起pH变化原因：
①取决于微生物自身的代谢， ②还与培养基的成分有极大关系。
最适发酵温度选择与控制
选择最适发酵温度应该考虑两个方 面：①微生物生长最适温度，②产物 合成最适温度。
不同菌种、菌种不同生长阶段以 及不同培养条件，最适温度都不同。
微生物发酵时间控制
发酵时间： 是指菌种接入发酵基质起至发酵结
束为止的时间间隔。 发酵时间尽可能短、考虑提高产物
收得率、降低底物消耗率、提高经济 效益、利于后序处理及产品质量等。
过度延长发酵时间缺点：
①生产效率降低；
②对后续提取工序不利，如菌体自溶释 放出菌体蛋白或体内的酶，改变发酵 液性质，使发酵液过滤困难，会使一 些不稳定产物遭到破坏，降低不稳定 发酵产物的产量。
最大比生长速率μm
1、单级恒化器的发酵动力学
X：反应器内菌体浓度（g/L） P：产物浓度（g/L） V：反应器内发酵液体积（L）
X0 S0
F
F
X S P
So: 流加发酵液中基质的浓度(g/L) S: 反应器内基质的浓度(g/L) F: 补料速度(L/h)
X S P
17
对菌体
积累的细胞=(进入-流出)的细胞+(生长-死亡)的细胞
单细胞的微生物可进一步简化为
N—培养基中的细胞密度。
6
Monod方程
max
S Ks S
KS一底物相关常数，为μ等于 1/2μm时限制性营养物质的浓度。
S crit 临界底物浓度，比生长 速率μ达到最大比生长速率 μmax时的最低底物浓度。 对于任一营养物质 S> S crit，为非限制性底物 S< S crit，为限制性底物
11
(二)部分生长连动型产物形成(II型发酵)
12
(三)非生长连动型产物形成(Ⅲ型发酵)
13
第二部分 连续培养动力学
连续培养： 以一定的速率向发酵液中添加新鲜 培养基的同时，以相同的速率流出 培养液，从而使发酵罐内的液量维 持恒定不变，使培养物在近似恒定 状态下生长的培养方法。
14
一、连续培养概述
积累的底物=（进入-流出）的底物-（生长+形成产物 +维持代谢）消耗的底物
ds 1 dx 1 dp F ( s0 s) V ( ms x) dt Y x / s dt Y p / s dt (5.1.4)
V
或 rp ds D( s0 s) ( ms ) x dt Y x/s Y p/s (5.1.5)
第六章 连续式操作反应器
一、单级CSTR的生化反应特征 单级CSTR的生化反应特征 CSTR
1、酶促反应的单级CSTR的反应方程 对均相的酶促反应，且反应符合M-M的动力学方程，则：
τm =
CS 0 − CS CS 0 − CS = rmax ⋅ CS rS K m + CS
CS 0 − CS rmax ⋅τ m = (CS 0 − CS ) + K m CS
dC P dC P VR = V0 ⋅ C P 0 − V0 ⋅ C P + VR dt dt 生成
dC P =0 dt
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第6章 >> 6.2 连续完全返混型反应器（CSTR） 连续完全返混型反应器（CSTR）
XS CS 0 2 rmax ⋅τ m = CS 0 ⋅ X S + K m + XS − XS 1− X S KI
P163式6-9
2
(
)
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第6章 >> >> 6.2 连续完全返混型反应器（CSTR） 连续完全返混型反应器（CSTR）
一、单级CSTR的生化反应特征 单级CSTR的生化反应特征 CSTR
V R = V L + VS
τ m = τ L +τ S
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τ L = ε Lτ m
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连续培养动力学
Pt m 1
K S K s m 1 S K KS 0 S Y x / s S 0 S0 K S KS m m 1 S K 0 S KS K s 1 S0 K S KS S0 S0 K S KS S0 K S
2
m
D
K S m S0 K S
2
D m m D m 1
KS S0 K S
KS S0 K S
KS Dopt m 1 S0 K S 因Ks S 0，可知Dopt 就在Dcrit附近 细胞最大生产强度 Pt Dopt X Pt Dopt K s Dopt Y x / s S 0 m Dopt
KS S0 2 m D S0 S0
m
D 2D D2 0
KS 2 0 2 D D m 2 m D KS 2 m D
2
m
D m
2
2
0
S0 K S
K S m 0 2 m D
例题6.1
以葡萄糖为限制性基质，连续培养E. coli，在此 培养条件下( 流加基质浓度S0=0.968g/L)，测得 试验数据如下：
D(h-1) S(mg/ L) 0.06 0.12 0.24 0.31 0.43 6 13 33 40 64 X(mg/L) 427 434 417 438 422 D(h-1) S(mg/ L) 0.6 0.66 0.69 0.71 0.73 122 153 170 221 210 X(mg/L) 434 422 430 390 352
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KS K s 1 S0 K S KS S0 Pt Y x / s m 1 S K KS 0 S S0 K S
KS Pt Y x / s m 1 S K 0 S KS Pt Y x / s m 1 S K 0 S
解（1）根据题意，单级CSTR在稳态下有， μ＝D = F/V =1/5 = 0.2 min-1 依据莫诺方程μ＝μmS/(Ks+S)得， 0.2=1.2S / (2+S) S = 0.4 g/L 由 X＝Yx/s (S0 – S) 得， X=0.1×（6 – 0.4）＝0.56 g/L 由 dX/dt =μX 得， dX/dt = 0.2×0.56＝0.112 g/(L· min)
S0 K S K S
Pt Y x / s m
S
0
K S K S S 0 K S S0 K S
2
Pt Y x / s m
S0 K S K S
2 2
S0 K S KS Pt Y x / s m S 0 S0 S0 如果S 0 K s，则Pt Y x / s m S 0
对函数Pt＝D· Yx/s · [S0 –Ks·D/(μm –D)]求极值
令Pt’(Dopt)=0
K S D D YX / S S0 D 0 m 2 KS D D S0 D 0 m 2 KS D D S 0 D 0 m KS 2 2 S0 m D D D m D 0 2 m D
连续培养类型
恒化器：具有恒定化学环境的反应器。以恒定不变的 速率加入某一必需的限制性营养物。 恒浊器：维持细胞密度恒定不变。 营养恒定反应器 pH自动恒化器 CER恒化器 溶氧恒化器 摄氧恒化器
一、 单级连续培养 1、菌体平衡
对于细胞： 体系积累速率=（进入-流出）速率+（生长-死亡）速率 （g/h） V·dX/dt = F·(X0–X) + V·(μ –ε )·X (1) 对于普通的单级恒化器 X0=0， ε =0，培养液体 积不变 dX/dt =(μ –D)·X (2) 其中 D 0.2 g/L Yx/s =0.5 gX / g S S0=10 g/L
例题6.1
以葡萄糖为限制性基质，连续培养E. coli，在 此培养条件下( 流加基质浓度S0=0.968g/L)， 测得试验数据如下：
D(h-1) S(mg/ L) 0.06 0.12 0.24 0.31 0.43 6 13 33 40 64 X(mg/L) 427 434 417 438 422 D(h-1) S(mg/ L) 0.6 0.66 0.69 0.71 0.73 122 153 170 221 210 X(mg/L) 434 422 430 390 352
（2）生产强度Pt=D · Yx/s · [S0 – Ks · D/(μm – D)] 令dPt/dD=0，此时Pt为极大值，相应的稀释率为 Dopt =μm · [1 –(Ks/(Ks+S0))1/2] =1.2×[1 –(2/(2+6))1/2] = 0.6 min-1 最佳加料速率 F = Dopt · V = 0.6×5 = 3 L/min
2）生物代谢、生理、生化、遗传、生态等特性 的研究。 特征：连续培养进入稳定状态后，细胞的比 生长速率与稀释率相同，培养液中的细胞、 基质和产物浓度恒定，不随时间变化。
分批培养:底物一次装入罐内，在适宜条件下接种 进行反应，经过一定时间后将全部反应系取出。
补料发酵:先将一定量底物装入罐内，在适宜条件 下接种使反应开始。反应过程中，将特定的限制 性底物送人反应器，以控制罐内限制性底物浓度 保持一定，反应终止取出反应系。
Pt m 1
K S K s m 1 S K KS 0 S Y x / s S 0 S0 K S KS m m 1 S K 0 S
单级恒化器在稳态条件下的物料平衡方程： 细胞：D=μ 基质：D · (S0 – S) –(μ/YG+qp/Yp+m) ·X = 0 产物：Yp/x· X – P = 0 或 q p· X – D ·P = 0 在只培养细胞的特定连续培养过程中，设：产 物的形成忽略不计，维持代谢忽略不计。 则有： (1) D =μ (2) D · (S0 – S) –μ/YG·X=0 (10) X = YG · (S0 – S) = Yx/s · (S0 – S) (11) X=? Yx/s = YG
第六章 连续培养动力学
在培养过程中，不 断向反应器流加培 养基，同时以相同 流量从反应器中取 出培养液，这种操 作方式称为连续培 养。
D=F/V 其中F：体积流率（体积/时间) 流速 稀释率（D）： 体积流率与培养液体积之比。 应用：
1）单细胞蛋白、乙醇、溶剂、啤酒、废水处
理、动物细胞培养、酶催化等领域
2
m
D
K S m S0 K S
2
D m m D m 1
KS S0 K S
KS S0 K S
KS Dopt m 1 S0 K S 因Ks S 0，可知Dopt 就在Dcrit附近 细胞最大生产强度 Pt Dopt X Pt Dopt K s Dopt Y x / s S 0 m Dopt
KS S0 2 m D S0 S0
m
D 2D D2 0
KS 2 0 2 D D m 2 m D KS 2 m D
2
m
D m
2
2
0
S0 K S
K S m 0 2 m D
dX/dt = 0.6×0.1×[6 – 2×0.6/(1.2 – 0.6)] = 0.24 g/(L.min)
二、多级连续培养
把几个生物反应器串连起来，前一级反应器的出 料作为下一级反应器的进料，即组成了多级连续 培养系统。进行多级连续培养时，也可以向第二 级以后的各级反应器补充新培养基。
第二级反应器反应动力学
0.53
102
427
试比较连续培养的S 、X和Pt的理论计算值和实验值。
根据莫诺方程有： 1/μ=1/μm+Ks/μm×1/ S 对1/μ—1/ S作线性回归曲线，求得： μm=1.05h-1，Ks=0.0997g/L=99.7mg/L
将实验数据X、S和D代入方程X=Yx/s · (S0 –S)和 Pt=D ·X，计算对应的Yx/s和Pt，结果见下表：
根据莫诺方程μ=μm · S/(Ks +S) S = Ks·μ/(μm – μ)
(12)
代入上式(11)得：X=Yx/s · {S0 – Ks·D/(μm – D)} (13) 在一定培养条件下，Yx/s、S0、Ks和μm均为定值， 连续培养状态下培养液中的菌体浓度X和限制性底物 浓度S取决于稀释率D。 S = Ks / (μm/μ –1) = Ks / (μm/D –1) (14) 当D＜μm ,提高D，增大S，则降低X。 当D→ μm时，S→S0，此时X→0，临界稀释率Dcrit为： Dcrit =μm· S0 / (Ks+S0) 通常情况下，Ks＜＜S0，故有： Dcrit=μm
生产强度(生产率）： Pt =产物浓度（g/L）/发酵时间（h） Pt = X/t = F X / V = X / (V/F) = D ·X Pt＝D· Yx/s · [S0 –Ks·D/(μm –D)] （16） 令 Pt 对 D 的一阶导数为零，可获得最大生产强度 下的稀释率 Dopt： Dopt =μm{1 – [Ks/(Ks+S0)]1/2} （17）
S0 S0
KS S0 K S K S 1 S K 0 S
S0 K S K S
Ks
K S S 0 K S S0 K s Pt Y x / s m 1 S K 0 S
当连续培养处于稳态时，反应器中的细胞积累为 零，即： dX/dt = 0 D =μ 即在恒定状态时，比生长速率等于稀释速率
2、限制性底物的物料平衡
对于限制性底物： 体系积累速率＝（进入– 流出）速率 – （生长＋形成产物＋维持代谢）所消耗速率 (g/h, mol/h) V· dS/dt =F · (S0 –S) –(dX/dt /YG+dP/dt/Yp+m· X) · V (3)
D ＜0.25Dcrit，不 可忽略维持代谢 D ＞ 0.75Dcrit,可能 产生代谢产物。
例6.2
在甘露糖醇中培养大肠杆菌，其动力学方程为： dX/dt = 1.2×S×X/(2+S) g/(L· min)。已知 S0 ＝6 g/L，Yx/s = 0.1。试问（1）当甘露糖醇溶 液以1 L/min的流量进入体积为5L的CSTR中进 行反应时，其反应器内细胞的浓度及其生长速 率为多少？（2）如果寻求使大肠杆菌在CSTR 内的生长强度达到最大，试问最佳加料速率应 为多少？大肠杆菌的生长速率为多大？
dS/dt = D · (S0 –S) – (μ/YG+qp/Yp+m) · X (4) 当连续培养处于稳态时，反应器中的基质的积累为零， 即：dS/dt =0 D· (S0 –S) – (μ/YG+qp/Yp+m) · X= 0 (5)
3、产物的物料平衡
对于产物形成： 体系积累速率=（生成 – 流出）速率 V· dP/dt = V · (dP/dt)生成 – F · P dP/dt = Yp/x·μ·X – D · P (6) 或 dP/dt = qp· X – D ·P (7) 当连续培养处于稳态时，反应器中的产物的积累为零， 即：dP/dt = 0 Yp/x · X–P=0 (8) 或 q p· X – D ·P = 0 (9)