聚合酶链式反应扩增和扩增产物克隆
PCR扩增DNA片段及产物检测的方法20111123
聚合酶链式反应（PCR）扩增DNA片段一、实验目的1．学习PCR基因扩增的基本原理和操作方法。
2．理解PCR基因扩增在分子生物实验技术中的重要性。
3．了解引物设计的一般要求。
二、实验原理多聚酶链式反应(Polymerase Chain Reaction, PCR )：原理类似于DNA的变性和复制过程，即在高温（93-95℃）下，待扩增的靶DNA双链受热变性成为两条单链DNA模板；而后在低温（37～65℃）情况下，两条人工合成的寡核苷酸引物与互补的单链DNA模板结合，形成部分双链；在Taq酶的最适温度（72℃）下，以引物3’端为合成的起点，以单核苷酸为原料，沿模板以5’→3’方向延伸，合成DNA新链。
这样，每一双链的DNA模板，经过一次解链、退火、延伸三个步骤的热循环后就成了两条双链DNA分子。
如此反复进行，每一次循环所产生的DNA均能成为下一次循环的模板，每一次循环都使两条人工合成的引物间的DNA特异区拷贝数扩增一倍，PCR产物得以2n的批数形式迅速扩增，经过25～30个循环后，理论上可使基因扩增109倍以上，实际上一般可达106～107倍。
PCR反应系统的组成：引物、寡核苷酸、Taq DNA聚合酶、模板DNA、缓冲液。
三、试剂与器材1、试剂10×EX Taq Buffer (Mg2+ plus) ；dNTP Mixture (各2.5 mM)TaKaRa EX Taq聚合酶5U/μl；模板DNA (已预先稀释)；上、下游引物混合物（已预先稀释）2、器材微量移液器及吸头，硅烷化的PCR小管，PCR扩增仪(PTC－100)，台式高速冷冻离心机。
四、操作方法1．编辑设定PCR扩增程序。
2．PCR管中加入灭菌水、缓冲液、四种dNTP、引物、模板、聚合酶。
3．运行程序进行扩增。
4．电泳检测扩增结果。
五、关键步骤与注意事项1．试剂湿热灭菌，小管分装，防止污染。
2．所用的PCR扩增管、微量移液器的吸头都要灭菌。
taqdna聚合酶基因的克隆实验原理
taqdna聚合酶基因的克隆实验原理聚合酶是一种重要的酶，能够催化DNA双链解旋和合成RNA的过程。
在遗传工程和分子生物学研究中，对聚合酶基因的克隆实验具有重要意义。
一、聚合酶基因的克隆实验原理1.提取DNA：首先，需要从细胞中提取DNA。
这可以通过细胞裂解和蛋白酶处理、有机物或者无机盐提取法等多种方法来实现。
经过提取后，可以得到纯净的DNA溶液。
2. PCR扩增：在得到DNA样本后，可以利用聚合酶链式反应（PCR）技术对聚合酶基因进行扩增。
PCR技术利用聚合酶酶、引物和dNTPs等原料，通过多次循环的温度变化，将特定DNA片段迅速扩增成百万甚至亿万倍。
3.消化和连接：经过PCR扩增后，得到的DNA片段需要进行酶切消化和连接。
酶切消化是通过限制性内切酶对DNA分子进行特异性切割，得到所需的DNA片段。
连接则是利用连接酶将所需的DNA片段连接到载体上自由末端的操作过程。
4.转化：连接好的质粒需要通过转化技术导入到宿主菌中，通常使用大肠杆菌等细菌作为宿主。
转化是将外源DNA导入到宿主细胞内，并使其稳定存在并得以复制。
5.筛选：经过转化后，需要对宿主菌进行相应的筛选，找到携带了聚合酶基因的阳性菌落。
通常利用抗生素筛选法或者标记基因法来选出目的菌株。
6.提取和纯化：最终需要对筛选出的阳性菌株进行DNA提取和纯化，得到纯净的含有聚合酶基因的质粒DNA。
通过以上步骤，可以成功得到聚合酶基因的克隆质粒，并可以进一步进行表达、纯化、功能验证等实验。
二、聚合酶基因的克隆实验应用1.遗传工程研究：利用聚合酶基因的克隆实验，可以获得大量的聚合酶基因，从而对其进行结构与功能的深入研究。
这对于揭示聚合酶在DNA复制、转录和修复等生物学过程中的作用具有重要意义。
2.分子生物学研究：在分子生物学研究中，聚合酶基因的克隆实验可以用于构建基因工程载体、进行基因表达调控、开展蛋白结构与功能研究等，为分子生物学研究提供了重要的工具和材料。
PCR技术简介
Mg2+浓度对PCR扩增效率影响极大，浓 度过高可降低PCR扩增的特异性；浓度过 低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失 败，出现假阴性。
PCR出现假阴性原因分析及解决方案
Mg2+浓度引起假阴性解决方案： 设置一组反应，其中每一反应中
的其他离子浓度相同（如Tris.Cl,KCl 等），而MgCl2浓度不同（由 0.5~6mmol/L,每次增加0.5mmol/L)， 由此来摸索最佳Mg2+浓度。
PCR技术的应用
研究领域：
基因克隆；DNA测序；分析突变； 基因重组与融合；检测基因的修饰； 鉴定与调控蛋白质结构的DNA序列； 转座子插入位点的绘图；合成基因的构建；
构建克隆或表达载体； 检测某基因的内切酶多态性等。
PCR技术的应用
临床诊断： 细菌；病毒；螺旋体；支原体；衣原
体；立克次氏体；分枝杆菌等病原体 的鉴定； 人类遗传病的鉴定；
PCR出现假阴性原因分析及解决方案
模板因素引起假阴性解决方案：
1.配制有效而稳定的消化处理液; 2.提取程序固定,不宜随意改动； 3.模板DNA的溶解液应固定不变。
PCR出现假阴性原因分析及解决方案
酶失活：
1.酶本身的质量问题(供应商的问题）； 2.酶存放时间太长； 3.酶存放方式不当，或其他意外原因； 4.忘记添加Taq酶。
PCR出现假阴性原因分析及解决方案
酶失活引起假阴性解决方案：
1.检查加样程序及过程，看是否忘记加Taq 酶；
2.更换新的Taq酶; 3.新旧两种Taq酶同时使用。
PCR出现假阴性原因分析及解决方案
引物：
1.引物质量； 2.引物浓度； 3.两条引物的浓度是否对称等。
聚合酶链式反应(PCR)
操作： 5份标本
Taq 酶 (5U/μl)： 0.2μl × 6 = 1.2μl 水： 共174μl，先用移液器 / 指弹混匀，后用离心机瞬时 混匀（管壁上液体沉至管底）。
2. 另取 5 支0.2ml Ep管，分别加入上述液体29μl。
3. 分别取标本模板各1μl，加入上述5支 Ep 管中，混 匀，分别加入2滴液体石蜡（防止加温过程中液体蒸 发影响反应体积），离心机瞬时离心，备用。
⑶ 延伸温度和时间：
一般位于Taq酶最适作用温度70 ～ 75 ℃之间。 引物小于16个核苷酸时，过高的延伸温度不利于引 物与模板的结合，可以缓慢升温到70 ～ 75 ℃。 延伸反应时间，可根据待扩增片段的长度而定， < 1Kb，1分钟足够；> 1Kb需加长延伸时间，10Kb 片段延伸时间可达15分钟。
0.2×30 / 10 = 0.6μl 0.4×30×2 / 10 = 2.4μl 1μl 30-3-1.8-0.6-2.4-0.2-1=21μl
Taq 酶(5U/μl)：1 / 5 = 0.2μl 模板： 水：
总体积 30μl ×6 = 180μl 1. 取一 0.5 ml Ep 管，依次加入下列试剂： 10×buffer： 3μl ×6 = 18μl MgCl2: 1.8μl×6 = 10.8μl dNTPs: 引物 P： 0.6μl×6 = 3.6μl 2.4μl ×6 = 14.4μl 21μl × 6 = 126μl
扩增的特异性取决于引物与模板DNA的特异 结合，基本反应步骤分三步： 1. 变性 (Denaturation)： 加热使模板DNA双链间的氢键断裂而形成两 条单链。94℃ 30″
2. 退火 (复性) (Annealling):
突然降温后模板DNA与引物按碱基配对原则 互补结合，也存在两条模板链之间的结合，但由 于引物的高浓度，结构简单的特点，主要的结合 发生在模板与引物之间。55 ℃ 30 ″
PCR
⑤引物3'端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要 求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。
⑥引物中有或能加上合适的酶切位点， 被扩增的靶序列最好 有适宜的酶切位点， 这对酶切分析或分子克隆很有好处。 ⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明 显同源性。 ⑧引物量： 每条引物的浓度0.1～1umol或10～100pmol，以最 低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错 配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会 。
聚合酶链式反应，简称PCR（Polymerase Chain Reaction），指在引物指导下由酶催化 的对特定模板（克隆或基因组DNA）的扩增 反应，是模拟体内DNA复制过程，在体外特 异性扩增DNA片段的一种技术，在分子生物 学中有广泛的应用，包括用于DNA作图、 DNA测序、分子系统遗传学等。
设计引物应遵循以下原则：
①引物长度：15-30bp，常用为20bp左右。 ②引物扩增跨度： 以200-500bp为宜，特定条件下可扩 增长至10kb的片段。
③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效 果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分 布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。 ④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补， 特别是3'端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异 的扩增条带。
二、退火 模板DNA与引物的退火（复性），模板 DNA经加热变性成单链后，温度降低至 55℃左右，引物与模板DNA单ห้องสมุดไป่ตู้的互补序 列配对结合。
三、延伸 DNA模板—引物结合物在TaqDNA聚合酶 的作用下，dNTP为反应原料靶序列为模板 ，按碱基配对与半保留复制原理，合成一 条新的与模板DNA链。
pcr扩增产物的分析
它利用DNA双链复制的原理，在DNA聚合酶的作用下，通 过高温变性、退火、延伸等步骤，实现DNA的快速扩增。
03
PCR技术可以在短时间内将微量的DNA片段扩增至上百万 倍，极大地提高了DNA的获取效率。
PCR技术的应用领域
基因克隆和基因组分析
PCR技术是基因克隆和基因组分析的重要工具，可以用于 基因的快速克隆、基因突变检测、基因组测序等。
产物的定量分析
标准曲线法
通过制作标准曲线，可以定量PCR产物。标准曲线可以是 已知浓度的标准品，也可以是同源基因的PCR产物。
相对定量法
通过比较目标基因与内参基因的PCR产物量，可以计算出 目标基因的相对表达量。常用的内参基因包括β-actin和 GAPDH等。
绝对定量法
通过比较已知浓度的标准品与目标PCR产物，可以计算出 目标产物的绝对量。这种方法需要精确的标准品和可靠的 校准曲线。
06
未来展望
新技术发展对PCR扩增产物分析的影响
纳米孔测序技术
利用纳米孔在单分子水平上 检测DNA序列，具有高通量 、高速度的优点，有望替代 传统的凝胶电泳和荧光定量
PCR技术。
微流控芯片技术
将PCR反应和产物分析集成在 微流控芯片上，实现快速、
准确、自动化的PCR产物分析 ，提高检测效率。
数字PCR技术
03
PCR扩增产物的检测方法
凝胶电泳检测
1 2
原理
利用凝胶电泳的分子筛效应，将不同大小的DNA 片段进行分离，通过染色后观察电泳结果判断 PCR产物的大小。
优点
操作简单、成本低，适用于大多数PCR产物检测。
3
缺点
分辨率有限，无法检测到分子量相近的片段。
聚合酶链式反应的原理
聚合酶链式反应的原理
聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是一种在体外复制DNA序列的技术。
它基于DNA聚合酶的催化作用，通过反复进行DNA的变性、引物结合和扩增，从而大量复制
目标DNA序列。
PCR的原理包括以下几个关键步骤：
1. 变性（Denaturation）：将待扩增的DNA样本加热至高温
（通常为94-98°C），使 DNA双链解开成单链，使DNA分子的双链结构解开，断开了两个链之间的氢键结合，使得DNA
的链变为单链状态。
2. 引物结合（Annealing）：将反应体温度降低（通常在50-65°C之间），使DNA引物与待扩增序列的互补部分结合。
引物是一小段与目标DNA序列两端具有互补碱基配对的DNA
片段，可为DNA聚合酶提供起始序列。
3. 扩增（Extension）：在适合DNA聚合酶活性的温度下（通
常在60-72°C之间），DNA聚合酶结合引物的3'端，并在模
板DNA上合成新的DNA链。
该酶使用单链DNA作为模板，
应用碱基匹配规则将引物与模板DNA的互补碱基配对，并在
引物3'端依次添加适当的核苷酸，即进行DNA链的延伸。
以上三个步骤组成了PCR的一个循环。
每个循环都使目标
DNA序列得以扩增。
通过反复循环PCR的三个步骤，可以在
极短的时间内（通常数小时）从很小的起始DNA样本中扩增
出大量的目标DNA序列。
PCR技术在许多生物学研究领域得到广泛应用，包括基因测序、遗传突变检测、疾病诊断、DNA指纹鉴定等。
PCR扩增的原理和操作步骤
PCR扩增一、聚合酶链式反应（PCR）的定义PCR是聚合酶链式反应的简称，指在引物指导下由酶催化的对特定模板（克隆或基因组DNA）的扩增反应，是模拟体内DNA复制过程，在体外特异性扩增DNA片段的一种技术，在分子生物学中有广泛的应用，包括用于DNA作图、DNA测序、分子系统遗传学等。
二、聚合酶链式反应（PCR）的基本原理是以单链DNA为模板，4种dNTP为底物，在模板3’末端有引物存在的情况下，用酶进行互补链的延伸，多次反复的循环能使微量的模板DNA得到极大程度的扩增。
在微量离心管中，加入与待扩增的DNA片段两端已知序列分别互补的两个引物、适量的缓冲液、微量的DNA膜板、四种dNTP溶液、耐热Taq DNA聚合酶、Mg2+等。
反应时先将上述溶液加热，使模板DNA在高温下变性，双链解开为单链状态；然后降低溶液温度，使合成引物在低温下与其靶序列配对，形成部分双链，称为退火；再将温度升至合适温度，在Taq DNA聚合酶的催化下，以dNTP为原料，引物沿5’→3’方向延伸，形成新的DNA片段，该片段又可作为下一轮反应的模板，如此重复改变温度，由高温变性、低温复性和适温延伸组成一个周期，反复循环，使目的基因得以迅速扩增。
因此PCR循环过程为三部分构成：模板变性、引物退火、热稳定DNA聚合酶在适当温度下催化DNA链延伸合成。
1．模板DNA的变性模板DNA加热到90~95℃时，一般是94℃，双螺旋结构的氢键断裂，双链解开成为单链，称为DNA的变性，以便它与引物结合，为下轮反应作准备。
变性温度与DNA中G-C含量有关，G-C间由三个氢键连接，而A-T间只有两个氢键相连，所以G-C含量较高的模板，其解链温度相对要高些。
故PCR中DNA变性需要的温度和时间与模板DNA的二级结构的复杂性、G-C含量高低等均有关。
对于高G-C含量的模板DNA在实验中需添加一定量二甲基亚砜（DMSO），并且在PCR循环中起始阶段热变性温度可以采用97℃，时间适当延长，即所谓的热启动。
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聚合酶链式反应(PCR)扩增和扩增产物克隆第一节概述PCR(Polymerase Chain Reaction,聚合酶链反应)是一种选择性体外扩增DNA或RNA的方法.它包括三个基本步骤: (1) 变性(Denature):目的双链DNA片段在94℃下解链; (2) 退火(Anneal):两种寡核苷酸引物在适当温度(50℃左右)下与模板上的目的序列通过氢键配对;(3) 延伸(Extension):在Taq DNA聚合酶合成DNA的最适温度下,以目的DNA为模板进行合成.由这三个基本步骤组成一轮循环,理论上每一轮循环将使目的DNA扩增一倍（图4）,这些经合成产生的DNA又可作为下一轮循环的模板,所以经25-35轮循环就可使DNA扩增达106 倍。
一、 PCR反应中的主要成份1. 引物：PCR反应产物的特异性由一对上下游引物所决定。
引物的好坏往往是PCR成败的关键。
引物设计和选择目的DNA序列区域时可遵循下列原则：(1) 引物长度约为16-30bp，太短会降低退火温度影响引物与模板配对，从而使非特异性增高。
太长则比较浪费,且难以合成。
(2) 引物中G+C含量通常为40%-60%,可按下式粗略估计引物的解链温度 Tm＝4(G+C)+2(A+T).(3) 四种碱基应随机分布，在3'端不存在连续3个G或C,因这样易导致错误引发。
(4) 引物3'端最好与目的序列阅读框架中密码子第一或第二位核苷酸对应, 以减少由于密码子摆动产生的不配对。
(5) 在引物内, 尤其在3'端应不存在二级结构。
(6) 两引物之间尤其在3'端不能互补, 以防出现引物二聚体, 减少产量。
两引物间最好不存在4个连续碱基的同源性或互补性。
(7) 引物5'端对扩增特异性影响不大, 可在引物设计时加上限制酶位点、核糖体结合位点、起始密码子、缺失或插入突变位点以及标记生物素、荧光素、地高辛等. 通常应在5'端限制酶位点外再加1-2个保护碱基。
(8) 引物不与模板结合位点以外的序列互补。
所扩增产物本身无稳定的二级结构, 以免产生非特异性扩增,影响产量。
(9) 简并引物应选用简并程度低的密码子, 例如选用只有一种密码子的Met, 3'端应不存在简并性。
否则可能由于产量低而看不见扩增产物。
一般PCR反应中的引物终浓度为0.2-1.0μmol/L。
引物过多会产生错误引导或产生引物二聚体, 过低则降低产量。
利用紫外分光光度计, 可精确计算引物浓度, 在1cm光程比色杯中,260nm下,引物浓度可按下式计算：X mol/L＝ OD260/ A(16000)+C(70000)+G(12000)+T(9600)X: 引物摩尔浓度,A、C、G、T: 引物中4种不同碱基个数。
2. 4种三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)：dNTP应用NaOH 将pH调至7.0,并用分光光度计测定其准确浓度.dNTP原液可配成5-10mmol/L并分装,-20℃贮存。
一般反应中每种dNTP的终浓度为20-200μmol/L。
理论上4 种 dNTP各20μmol/L,足以在100μl反应中合成2.6μg 的DNA。
当dNTP终浓度大于50mmol/L时可抑制Taq DNA聚合酶的活性.4种dNTP的浓度应该相等,以减少合成中由于某种dNTP的不足出现的错误掺入。
3. Mg2+：Mg2+浓度对Taq DNA聚合酶影响很大,它可影响酶的活性和真实性,影响引物退火和解链温度, 影响产物的特异性以及引物二聚体的形成等。
通常Mg2+ 浓度范围为0.5-2mmol/L.对于一种新的PCR反应,可以用0.1-5mmol/L的递增浓度的Mg2+ 进行预备实验,选出最适的Mg2+浓度。
在PCR反应混合物中, 应尽量减少有高浓度的带负电荷的基团, 例如磷酸基团或EDTA等可能影响Mg2+ 离子浓度的物质,以保证最适Mg2+ 浓度。
4. 模板：PCR反应必须以DNA为模板进行扩增, 模板DNA可以是单链分子,也可以是双链分子,可以是线状分子,也可以是环状分子(线状分子比环状分子的扩增效果稍好).就模板DNA而言,影响PCR 的主要因素是模板的数量和纯度.一般反应中的模板数量为102 -105 个拷贝,对于单拷贝基因,这需要0.1μg的人基因组DNA,10ng的酵母DNA,1ng的大肠杆菌DNA.扩增多拷贝序列时,用量更少.灵敏的PCR 可从一个细胞,一根头发,一个孢子或一个精子提取的DNA中分析目的序列.模板量过多则可能增加非特异性产物.DNA中的杂质也会影响PCR的效率。
5. Taq DNA聚合酶：一般Taq DNA聚合酶活性半衰期为92.5℃130min,95℃ 40min, 97℃ 5min.现在人们又发现许多新的耐热的DNA聚合酶,这些酶的活性在高温下活性可维持更长时间.Taq DNA聚合酶的酶活性单位定义为74℃下,30min,掺入10nmol/L dNTP到核酸中所需的酶量.Taq DNA聚合酶的一个致命弱点是它的出错率,一般PCR中出错率为2×10-4 核苷酸/每轮循环,在利用PCR克隆和进行序列分析时尤应注意.在100μl PCR反应中,1.5-2单位的Taq DNA聚合酶就足以进行30轮循环.所用的酶量可根据DNA、引物及其它因素的变化进行适当的增减.酶量过多会使产物非特异性增加,过少则使产量降低.反应结束后,如果需要利用这些产物进行下一步实验,需要预先灭活Taq DNA聚合酶, 灭活Taq DNA聚合酶的方法有：(1) PCR 产物经酚:氯仿抽提,乙醇沉淀。
(2) 加入10mmol/L的EDTA螯合Mg2+ 。
(3) 99-100℃加热10min.目前已有直接纯化PCR产物的Kit 可用。
6. 反应缓冲液：反应缓冲液一般含10-50mmol/L Tris〃Cl (20℃下pH8.3-8.8), 50mmol/L KCl和适当浓度的Mg2+ . Tris〃Cl在20℃时pH为8.3-8.8,但在实际PCR反应中,pH为6.8-7.8. 50mmol/L的KCl有利于引物的退火.另外,反应液可加入5mmol/L的二硫苏糖醇(DDT)或100μg/ml的牛血清白蛋白(BSA),它们可稳定酶活性,另外加入T4噬菌体的基因32蛋白则对扩增较长的DNA片段有利.各种Taq DNA聚合酶商品都有自己特定的一些缓冲液。
二、PCR反应参数1. 变性：在第一轮循环前,在94℃下变性5-10min非常重要,它可使模板DNA完全解链,然后加入Taq DNA聚合酶(hot start),这样可减少聚合酶在低温下仍有活性从而延伸非特异性配对的引物与模板复合物所造成的错误。
变性不完全,往往使PCR失败,因为未变性完全的DNA双链会很快复性,减少DNA产量.一般变性温度与时间为94℃ 1min。
在变性温度下,双链DNA解链只需几秒钟即可完全,所耗时间主要是为使反应体系完全达到适当的温度。
对于富含GC的序列,可适当提高变性温度.但变性温度过高或时间过长都会导致酶活性的损失。
2. 退火：引物退火的温度和所需时间的长短取决于引物的碱基组成，引物的长度、引物与模板的配对程度以及引物的浓度.实际使用的退火温度比扩增引物的Tm值约低5℃。
一般当引物中GC含量高,长度长并与模板完全配对时, 应提高退火温度。
退火温度越高, 所得产物的特异性越高。
有些反应甚至可将退火与延伸两步合并,只用两种温度(例如用60℃和94℃)完成整个扩增循环, 既省时间又提高了特异性。
退火一般仅需数秒钟即可完成,反应中所需时间主要是为使整个反应体系达到合适的温度。
通常退火温度和时间为37℃-55℃,1-2min。
3. 延伸：延伸反应通常为72℃,接近于Taq DNA聚合酶的最适反应温度75℃.实际上,引物延伸在退火时即已开始,因为Taq DNA聚合酶的作用温度范围可从20℃-85℃.延伸反应时间的长短取决于目的序列的长度和浓度.在一般反应体系中,Taq DNA聚合酶每分钟约可合成2kb长的DNA。
延伸时间过长会导致产物非特异性增加.但对很低浓度的目的序列, 则可适当增加延伸反应的时间。
一般在扩增反应完成后,都需要一步较长时间(10-30min)的延伸反应,以获得尽可能完整的产物, 这对以后进行克隆或测序反应尤为重要。
4. 循环次数：当其它参数确定之后, 循环次数主要取决于DNA 浓度。
一般而言25-30轮循环已经足够。
循环次数过多,会使PCR产物中非特异性产物大量增加。
通常经25-30轮循环扩增后, 反应中Taq DNA聚合酶已经不足, 如果此时产物量仍不够, 需要进一步扩增, 可将扩增的DNA样品稀释103-105倍作为模板, 重新加入各种反应底物进行扩增, 这样经60轮循环后, 扩增水平可达109-1010 。
扩增产物的量还与扩增效率有关,扩增产物的量可用下列公式表示:C＝C0 (1+P)n 。
其中：C为扩增产物量,C0 为起始DNA量, P为增效率, n为循环次数。
在扩增后期,由于产物积累,使原来呈指数扩增的反应变成平坦的曲线,产物不再随循环数而明显上升,这称为平台效应。
平台期会使原先由于错配而产生的低浓度非特异性产物继续大量扩增，达到较高水平。
因此，应适当调节循环次数，在平台期前结束反应，减少非特异性产物。
三、PCR产物的克隆在许多研究中,需要将PCR产物克隆,以获得目的DNA片段。
此时,所用PCR循环数应尽量小,以减少平台效应或非特异性扩增产物的干扰。
通常将PCR产物插入到载体中有下列一些方法。
1. 平末端连接：由于Taq DNA聚合酶往往在PCR产物3'端加上多余的非模板依赖碱基,在用平末端连接克隆PCR产物前,可用Klenow片段或T4 DNA聚合酶处理补平末端。
2. 在PCR产物尾部加dT或ddT：Taq DNA聚合酶会在3'端加上多余的非模板依赖碱基,而且对A优先聚合,所以PCR产物末端的多余碱基大部分都是A.。
利用这一特点,可以经限制酶切割产生的平末端用酶加上dT或ddT,使载体与PCR产物末端互补并进行连接.载体末端加dT尾可直接用Taq DNA聚合酶和dTTP或ddTTP,ddTTP因缺少3-OH而不能再形成磷酸二酯键,保证在载体3'端只加上一个ddTTP,而其5'端所含的磷酸基团可与PCR产物的3'端OH连接,连接产物在载体和PCR产物之间的双链上带两个切口,这种重组DNA仍可转化合适的受体菌,并在细菌体内修复.目前一些公司已开发出可直接用于克隆PCR产物的带3'-T的T-Vector。
3. 粘性末端连接：利用引物中附加在5'端的限制酶位点,直接将PCR产物经适当的限制酶切割后产生粘性末端,与载体连接,产生重组DNA.如果下游两个引物中含有两个不同的限制酶位点.经酶切后定向克隆到载体中。