实验二 霉菌产蛋白酶发酵培养基条件的确定

实验二雅致放射毛霉产蛋白酶培养基本的确定

1、种子培养基（实验老师准备4个100ml种子）

培养基组成：

100ml：豆粕粉3g，饴糖0.5g，酵母膏0.1g，MgSO40.2g，KH2PO40.2g。

高压灭菌锅，121℃，20min灭菌。灭菌操作完毕，将上述物品并洗耳球转入超净台，接种前20min进行紫外空气灭菌。

接种前4小时从冰箱取出1支菌种，在25℃条件下活化。在超净台内，以无菌生理盐水洗涤菌种斜面。孢子悬浮液以每瓶10ml的接种量，接入种子培养基。从超净台取出接好的种子三角瓶，转入摇床，在28℃、250rpm的条件下培养14～16小时，至种子瓶内呈粘稠浆糊状为止。

2、产酶培养基确定（学生确定，每组做三瓶，250ml三角瓶中装100ml培养基）

2.1培养基的配制，每班分六组，各组分别选择以下六种培养基配方：

（1）基础培养基：（100ml）豆粕粉3g，蔗糖0.8g，酵母膏0.1g，MgSO4 0.36g，KH2PO4 0.12g，CaCl2 0.1g。（第一组）

（2）第二组，将基础培养基中蔗糖按成等例葡萄糖；

（3）第三组，将基础培养基中蔗糖按成等例马铃薯淀粉；

（4）第四组，将基础培养基中去掉酵母膏；

（5）第五组，将基础培养基中去掉豆粕粉，并将酵母膏添加量增至0.5％。

（6）第六组，将基础培养基中去掉MgSO4和CaCl2。

2.2培养基灭菌

高压灭菌锅，121℃，20min灭菌。冷却至室温，将上述物品并洗耳球转入超净台，接种前20min进行紫外空气灭菌。

2.3接种

冷却到室温开始接种，接种量10％，然后在在28℃、250rpm的条件下培养18小时，至发酵液颜色变深、澄清为止。

2.4蛋白酶活力测定

根据各组测定酶活结果，比较确定最适培养基组成。

（1）定义：1 g固体酶粉，在一定温度和pH值条件下，1 min水解酪素产生1 ug酪氨酸为一个酶活单位，以u/g表示。

（2）原理：蛋白酶在一定温度与pH条件下，水解酪素底物，然后加入三氯乙酸终止酶反应，并使未水解的酪素沉淀除去，滤液对紫外光有吸收，可用紫外分光光度法测定。根据吸光度计算其酶活力。

（3）试剂和溶液

①三氯乙酸c（CCl3.COOH）=0.4 mol/L：称取三氯乙酸32.7 g，用水溶解并定容至500 mL

②磷酸缓冲溶液（pH=7.5）适用于中性蛋白酶：称取磷酸氢二纳（Na2HPO4·12H2O）3.01 g

和磷酸二氢纳（NaH2PO4·2H2O）0.25 g，加水溶解并定容至500 mL。

③ 100 ug/mL L—酪氨酸标准溶液：

a.称取预先于105 ℃干燥至恒重的L-酪氨酸0.100 g，精确至0.001 g，用1 mol/L盐酸

60 mL溶解后定容至100 mL，即为1 mg/mL酪氨酸标准溶液。

b.吸取1 mg/mL酪氨酸标准溶液10.00 mL，用0.1 mol/L盐酸定容至100 mL，即得到

100 ug/mL L—酪氨酸标准溶液。

④ 10 g/L酪素溶液：称取酪素1.000 g，精确至0.001 g，用少量0.5 mol/L氢氧化钠湿润后，

加入适量的缓冲溶液约80 mL，在沸水域中边加热边搅拌，直至完全溶解，冷却后，转入100 mL容量瓶中，用缓冲溶液稀释至刻度。

⑤待测酶液：1ml发酵液稀释5倍。（1个试管）

（4）分析步骤

①求K值（K取135）

②测定

a. 先将酪素溶液放入（40±0.2）摄氏度恒温水域中，预热5 min；

b. 按下列程序操作：

试管A（空白）（第二试管）试管B（酶试样，作三个平行样）（第三试管）

↓ ↓

加酶液2.00 mL （移液管2ml）加酶液2.00 mL

↓（40±0.2℃），2 min ↓（40±0.2℃），2 min 加三氯乙酸4.00 mL（摇匀）（移液管5ml）加酪素2.00 mL（摇匀）↓（40±0.2℃），10 min ↓（40±0.2℃），10 min 加酪素2.00 mL（摇匀）（移液管2ml）加三氯乙酸4.00 mL（摇匀）↓ ↓

取出静止10 min，过滤（第四试管，小漏斗）取出静止10 min，过滤

↓ ↓

在275 nm波长下，用10 mm 在275 nm波长下，用10 mm

比色皿测其吸光度比色皿测其吸光度

（5）计算（=135）

X=A×K×8/2×1/10×n×E=2/5×A×K×n×E

式中X——样品的酶活力（u/g）A——试样溶液的平均吸光度

K——吸光常数（K=135）8——反应试剂的总体积（mL）

2——吸取酶液2.00 mL，以1 mL计1/10——反应时间10 min，以1 min 计

n——稀释倍数E——紫外法与福林法的换算系数（取0.50）