新型磷酸酯表面活性剂的合成,表征及其反胶束体系对蛋白质的提取

融合蛋白表达系统

研究者们在分离到某一基因后，要对其编码蛋白质进行研究最理所当然的工作就是表达，即：有目的性地合成外源基因产物。在重组 DNA技术的发展早期，人们认为在基因的前面有一个强启动子和一个起始密码子就足以在大肠杆菌中获得很好的表达。随后，认识到获得有效的翻译所需的条件要复杂得多，除了要有强启动子和起始密码子外，良好的表达尚需编码目的蛋白的mRNA中含有核糖体结合位点，表达水平受密码子喜好程度的影响，也受编码序列中其他目前尚未明了的因素影响。通过改变起始密码子前端的序列，或者在不改变蛋白质序列的条件下利用密码子的简并性改变5’末端编码序列往往有助于解决问题。通常，两个基因之间的融合表达能更快地解决这些问题。在这种方式中，目的基因被引入某个高表达蛋白序列(fusion tag)的3’末端，比如大肠杆菌的一段序列，或者任一可在大肠杆菌中高度表达的基因，它提供良好表达所必需的信号，而表达出的融合蛋白的N末端含有由fusion tag编码的片段。fusion tag所编码的可能是整个功能蛋白或是其中的部分。比如6x His Tag、β-半乳糖苷酶融合蛋白和trpE融合蛋白、谷胱甘肽S-转移酶(GST)融合蛋白以及硫氧还蛋白(Trx)融合蛋白等。由于利用tag 选择融合表达是为了简化重组一是fusion tag位于目的蛋白的N端，这时tag 帮助提高目的蛋白的表达，缺点是纯化的表达产物中可能会有不完整的目的蛋白，原因是在翻译过程中意外中断的少量(C端)不完整的表达产物会一起被纯化。另一是fusion tag位于目的蛋白的C端，这可以保证只有完整的表达产物才会被纯化。当目的蛋白的功能区位于N端时，fusion tag位于C端可能减少对其功能的影响，反之亦然。进行融合蛋白的表达经常会遇到三个问题，它们是：表达蛋白的溶解性、稳定性和fusion tag的存在。前两个问题在融合蛋白表达系统和非融合蛋白表达系统都会遇到，而第三个问题是融合蛋白系统所独有的。裂解融合蛋白以除去fusion tag 为了对目的蛋白进行生化及功能分析，通常要从目的蛋白上去除fusion tag部分。早期已建立了数种对融合蛋白进行位点特异性裂解的方法。化学裂解如溴化氰(Met↓)、BNPS-3-甲基吲哚(Trp↓)、羟胺(Asn↓Gly)等，不但便宜且有效，往往还可以在变性条件下进行反应。但由于裂解位点的特异性低和可能对目的蛋白产生的不必要修饰，使该法渐渐被酶解法取代。酶解的方法相对来说反应条件较温和，更重要的是，普遍用于此用途的蛋白酶都具有高度的特异性。其中有用的酶有：Xa因子、凝血酶、肠激酶、凝乳酶、胶原酶。所有这些酶都具有较长的底物识别序列(如在凝乳酶中为7个氨基酸)，从而降低了蛋白质中其他无关部位生断裂的可能性。而酶解法存在成本高(这些蛋白酶价格一般都相当昂贵)，反应时间长等问题，更重要的是蛋白酶本身不可避免地会混入目的蛋白中，造成新的污染，提高纯化的复杂性。

电导法测定表面活性剂临界胶束浓度(CMC)模板

一.实验目的与要求 (1)了解表面活性剂的特性及胶束形成原理。（2)用电导法测定十二烷基硫酸钠的临界胶束浓度。 (3)掌握电导率仪的使用方法。二.实验仪器及药品仪器:DDS-307型电导率仪2台；电导电极2支；恒温水浴1套；500mL容量瓶4只，100mL 容量瓶12只。试剂:0.050mol/L十二烷基硫酸钠(分析纯)；0.050mol/L十二烷基苯磺酸钠（分析纯）； 0.050mol/L十六烷基三甲基溴化铵（分析纯）；0.050mol/L十二烷基三甲基溴化铵（分析纯）；氯化钾(分析纯)，电导水。三.实验原理 1.表面活性剂的特性及胶束形成原理。能使溶液表面张力明显降低的溶质称为表面活性剂，表面活性剂分子是由亲水性的极性基团(通常是离子化)和憎水性的非极性基团(具有8-18个碳原子的直链烃或环烃)所组成的有机化合物。按离子的类型可将其分为三大类： (1)阴离子型表面活性剂如羧酸盐(肥皂，C17H35COONa)，烷基硫酸盐[十二烷基硫酸钠，CH3(CH2)SO4Na],烷基磺酸盐[十二烷基苯磺酸钠，CH3(CH2)11C6H5SO3Na]等。 (2)阳离子型表面活性剂

主要是胺盐，如十二烷基二甲基叔胺盐酸盐[叔胺盐，CH3(CH2)11N(CH3 )2 HCL]和十二烷基二甲基苄基氯化铵[季铵盐，C12H23(CH3)2(C6H5CH2)NCL]. (3)非离子型表面活性剂如聚乙二醇类[HOCH2(CH2OCH2)N CH2OH]。表面活性剂为了使自己成为溶液中的稳定分子，有可能采取两种途径:一是当它们以低浓度存在于某一体系中时，可被吸附在该体系的表面上，采取极性基团向着水，非极性基团脱离水的表面而向着空气，形成定向排列的单分子膜，从而使表面吉布斯自由能明显降低；二是当溶液浓度增大到一定值时，表面活性剂离子或分子不但在溶液表面聚集而形成单分子层，而且在溶液本体内部表面活性剂的非极性基团相互靠在一起，以减少非极性基团与水的接触面积，当溶液浓度增大到一定程度时，许多表面活性物质的分子立刻聚集成很大的基团，形成“胶束”，如图4-16所示。表面活性物质在水中形成胶束所需要的最低浓度称为临界胶束浓度(critical micelle concentration),以CMC表示。随着表面活性剂在溶液中浓度的增加，球形胶束还有可能变成棒形胶束，以致层状胶束，如图4-17所示。后者可用来制造液晶，它具备各向异性的性质。在CMC点上，由于溶液的结构改变，导致其物理和化学性质(如表面张力、电导、渗透

反胶束体系在药学领域中的应用

反胶束体系在药学领域中的应用沈阳药科大学药学院，许琼明，莫凤奎【摘要】反胶京体系亦称W/O型微乳液，是由表面活性剂（有时需加助表面活性剂）形成的无数的具有纳米尺寸的含有水核的微小胶团分散在有机溶剂（下称油相）中构成的体系。它具有以下一些特点：（1）是宏观均相的透明的并具有高度分散性的热力学稳定体系。（2）具有极低的粘度和界面张力，并具有非常大的亚相（以下简称相）接触面积。（3）对脂溶性的有机物和水溶性的极性化合物都具有良好的溶解性能。（4）内相是一具有纳米尺寸的微小水核，而且该水核中的水同生物膜中的水类似，可分为三种情况：一级束缚水，二级束缚水，自由水。由于反胶束体系的外相一般生物相容性较差，不能直接应用于人体，放过去在药学领域的应用研究不多，近几年随着对反胶束体系研究的深入，反胶束体系在药学领域的应用研究已成为一新的热点。 1反胶束体系在药物合成方面的应用在药物合成研究中，许多产物或中间体的合成反应因为原料相溶性较差，或因为相接触面积过小，而难以发生反应或反应较慢。反胶束体系不仅具有非常大的相接触面积，而且对油溶性和水溶性的原料都具有良好的溶解性能，以其作为反应介质则可使上述反应易于进行或大大加快。其特点是：操作步骤简单，反应过程温和，产物分高简单，而且可以通过改变反胶束体系的组成来调节反应速度。Blandamer 等通过优选反胶束体系的组成，使水杨酸与苯酚之间的酯化反应速率比在普通乳状液中快1000倍。近几年来，酶促反应在药物合成中的应用研究已取得一些重要进展，其应用前景备受关注，特别是在一些采用普通的有机化学方法难于合成的药物或手性药物的合成及拆分方面，与常规合成方法相比具有许多优点：（1）反应条件温和、速度快。（2）副反应少，产物易分离纯化。（3）底物专一性强，具有高度立体和光学选择性。（4）反应步骤少，反应产物收率高。反胶束体系在结构和许多性质上同生物膜类似，绝大部分酶在反胜束体系中可以很好地保持其生物活性，有的甚至表现出超活性。石屹峰等利用来自Xanthomonas citri的酰化酶由D-α-苯甘氨酸甲酯和7－ADCA在AOT/异辛烷中合成头形力新，并研究了该反应的动力学过程，发现反胶束体系作为此反应的介质时，不仅提高了酶的催化速度，而且提高了转移酶活力对水解酶活力的选择性，在合成头孢力新时，使水解副反应被抑制，合成途径被强

反胶束体系中的酶催化反应

反胶束体系中的酶催化反应1 曾家豫，唐功，周兴辉，高亚娟西北师范大学生命科学学院，兰州（730070） E-mail: sdeztg@https://www.360docs.net/doc/0816403840.html, 摘要：反胶束是新的酶催化反应的介质工程，酶在反胶束体系中的性质与在水溶液中相比有较大区别。本文综述了含酶反胶束体系的制备、反胶束体系中影响酶催化化学反应的因素，以及在反胶束体系中酶的活性及动力学特性，介绍了反胶束体系下酶催化反应的优点及应用，并展望了其发展前景。关键词：反胶束，酶催化反应，介质工程传统的酶学实验都是在生物体外的水溶液介质中进行的，而酶起作用却发生在生物体特定的微环境中。介质工程(medium engineering)反胶束为生物催化过程提供理想的溶剂体系，能保持或提高生物催化剂的活性和稳定性。自1974年Wells[1]发现磷酸酯酶A2在卵磷脂/乙醚/水反胶束体系中具有卵磷脂水解活性以来，国外有二十多个实验室50 多种酶在反胶束中的酶学性质进行了广泛而深入的研究[2、3、4]，由此促进了一个新的研究领域-----胶束酶学(micellar enzymology) 的兴起。分散在有机相中的含酶水滴作为微型反应器(microreactor) 的概念已普遍为人们所接受。胶束酶学研究的权威Martinek[5]预言：反胶束体系有可能成为生物转化的通用介质。酶催化的介质工程的研究经历了从水→有机溶剂→反胶束(reversemicelles)的过程。在水/有机溶剂两相体系和微水有机溶剂单相体系中，仅有少数酶能够保持催化活性。由于反胶束体系能够较好地模拟酶的天然环境，因而在反胶束体系中, 大多数酶能够保持催化活性和稳定性，甚至表现出“超活性”(superactivity)[6、7]。本文综述了酶催化反应在介质工程反胶束体系中的研究。 1 反胶束体系研究 1.1 反胶束体系概述反胶束是表面活性剂分子在非极性溶剂中自发形成的纳米级的油包水胶体分散系，反胶束体系中，表面活性剂分子在界面上定向排列，碳氢链伸向有机相，极性头或荷电头部及抗衡离子则向内排列，形成极性核[8]。在反胶束体系内部，水可溶解到极性核中形成一个纳米级“水池”（Water pool）[9]，该“水池”可增溶水和酶等极性物质。水含量Wo（Wo为反胶束体系中水和表面活性剂S的物质的量之比即Wo=[H2O]/[S]）它影响反胶束的大小、结构和酶活性。反胶束内部独特“水池”的存在使得其内部环境接近于细胞内环境。这样，包埋于反胶束中的酶不仅避免了与周围有机溶剂直接接触而可能导致的失活，而且为高度分散的反胶束提供了巨大的相界面，使得通过反胶束内外间的传质阻力变的很小。 1.2 反胶束体系的制备反胶束体系具有三种溶解环境：连续有机相、胶束界面、胶束水池。有机溶剂参与的酶反应常应用于该体系，酶增溶于反胶束体系的方法主要有：（1）注入法这是将含有酶的缓冲液注入到表面活性剂有机溶剂中，然后搅拌至形成透明溶液即反胶束酶体系，这是一种常用的方法，该方法可很好的控制反胶束的水含量（Wo）。 1本课题得到基金项目：甘肃省教育厅科研项目（0601-28，0501B-16）的资助。

蛋白表达步骤

1．培养基的配制原理步骤 LB培养基，是微生物学实验中最常用的培养基，用于培养大肠杆菌等细菌，其分为液态或是加入琼脂制成的固态培养基。加入抗生素的 LB 培养基可用于筛选以大肠杆菌为宿主的克隆。尽管该培养基的名称被广泛解释为Luria-Bertani 培养基，然而根据其发明人贝尔塔尼(Giuseppe Bertani)的说法，这个名字来源于英语的 lysogeny broth，即溶菌肉汤。 LB培养基的配制：成分胰蛋白胨(tryptone) 10g 酵母提取物(yeast extract) 5g 氯化钠(NaCl) 10g 固体培养基另加琼脂粉 15-20g 加双蒸水至1000mL, 用5mol/L NaOH（约）调pH至，121℃灭菌30min 配制方法（1）称量分别称取所需量的胰化蛋白胨、酵母提取物和NaCl，置于烧杯中。（2）溶化加入所需水量2/3的蒸馏水于烧杯中，用玻棒搅拌，使药品全部溶化。（3）调pH 用1mol/L NaOH溶液调pH至。（4）定容将溶液倒入量筒中，加水至所需体积。（5）加琼脂加入所需量琼脂，加热融化，补足失水。（6）分装、加塞、包扎。（7）高压蒸汽灭菌100Pa灭菌20min。

2、大肠杆菌菌种活化原理菌种的活化就是将处于保藏状态的菌种放入合适的培养基中进行培养，逐级增大培养是为了得到纯而壮的培养物，可以理解为就是为了获得活力旺盛的、接种数量足够的培养物进行培养。菌种发酵一般情况下需要2-3代的复壮过程，因为保存时的条件往往和培养时的条件不相同，所以要活化,让菌种逐渐适应培养环境中药标准对照品研究中心建议实验要明白菌种活化的情况就首选需要了解菌种保藏的方式和方法。目前国际和国内常用的菌种保存方法包括：定期移植法、液体石蜡法、沙土管法、真空冷冻干燥法、80℃冰箱冻结法、液氮超低温冻结法。对于不同的保存方式活化的方式也不同： 1 定期移植法的菌种复苏较简单，直接转接即可； 2 液体石蜡法保存的菌种在复苏时，挑取少量菌体转接在适宜的新鲜培养基上，生长繁殖后，再重新转接一次； 3 沙土管法保存菌种在复苏时，在无菌条件下打开沙土管，取部分沙土粒于适宜的斜面培养基上，长出菌落后再转接一次。或取沙土粒于适宜的液体培养基中，增殖培养后再转接斜面； 4 真空冷冻干燥法保存菌种在复苏时先用70%酒精棉花擦拭安瓿上部，将安瓿管顶部烧热，用无菌棉签沾冷水，在顶部擦一圈，顶部出现裂纹，用挫刀或镊子颈部轻叩一下，敲下已开裂的安瓿管的顶端，用无菌水或培养液溶解菌块，使用无菌吸管移入新鲜培养基上，进行适温培养； 5 -80℃冰箱冻结法保存菌种复苏时，从冰箱中取出安瓿管或塑料冻存管，应立即放置38℃-40℃水浴中快速复苏并适当快速摇动。直到内部结冰全部溶解为止，约需50秒-100秒。开启安瓿管或塑料冻存管，将内容物移至适宜的培养基上进行培养 6 液氮超低温冻结法保存菌种复苏与-80℃冰箱冻结法保存菌种复苏相似，从液氮罐中取出安瓿管或塑料冻存管，应立即放置在38℃-40℃水浴中快速复苏并适当摇动。直到内部结冰全部溶解为止，一般约需50秒-100秒。开启安瓿管或塑料冻存管，将内容物移至适宜的培养基上进行培养。步骤

反相胶束萃取

反相胶束萃取 Reversed Micelle Extraction 一、反相胶束萃取概况随着生物工程技术的发展，传统的分离方法(如溶剂萃取)无法满足活性蛋白质等生物大分子物质的提取和分离。因为生物大分子物质一般在40～50℃以上开始变性，且绝大多数生物大分子物质不溶于有机溶剂，有机溶剂也易引起生物大分子物质的变性。同时生物大分子表面带有许多电荷，普通离子缔合型萃取剂很难奏效。因此研究和开发易于工业化、高效的生化活性物质分离方法就成为生物工程技术发展的当务之急。反相胶束萃取技术是在这一背景下产生的新型分离技术。反胶束萃取技术的起源可追溯至1977年。Lujsi等人首次提出用反相微胶束萃取蛋白质的概念，当时未引起重视。到20世纪80年代，生物学家开始认识到该技术的优越性，荷兰、美国的科学家首先进行了反相微胶束萃取蛋白质的研究。近年来该项研究已在国内外深入展开。由于反胶束萃取具有成本低、溶剂可反复使用、萃取率和反萃取率高；能降低蛋白质(胞内酶)在非细胞环境中的迅速失活；且构成反胶束的表面活性剂具有溶解细胞能力，可直接用于从整体细胞中提取蛋白质和酶。所以反相微胶束萃取技术为活性蛋白质和其他活性物质的分离开辟了一条具有工业前景的新途径，得到快速发展。二、反相胶束萃取的概念

?正常胶束：表面活性剂在极性溶液中形成的胶束或微胶团结构中，表面活性剂的亲水性基团朝外，而疏水性基团则靠内相互聚集成一种微胶团结构（图a），这种微胶束（团）称为正常胶束(normal micelle)。正常微胶束存在于极性溶剂中(多数情况为水)，较为常见。 ?反相微胶束：当表面活性剂在非极性溶液中形成胶束或微胶团时，表面活性剂的排列方向正好与在极性溶剂中的情况相反，即疏水性基团朝外，而亲水性基团则朝内并形成一个极性核区，由于这种微胶团结构（图b）与正常微胶束结构相反，所以称这种微胶束称为反相微胶束（reversed micelle）。 ?水池(water pool) ：在反相微胶束中，表面活性剂的亲水基团所围成的一个极性核心，称为水池。 ?微胶束萃取：如待分离组分是采用形成微胶束的形式进行萃取的过程，称为微胶束萃取或微胶团萃取。 ?反向微胶束萃取：如待分离组分是以反相微胶束（团）的形式被萃取的过程，就称之为反向微胶束萃取或反向微胶团萃取。

重组蛋白表达系统的选择

重组蛋白表达系统的选择、表达策略和方法学研究张宁

1. 前言在生命科学的很多研究和应用领域中，如何获得大量、均一、高纯、有活性的蛋白质都是一个关键问题。现代重组蛋白表达技术为我们提供了多种选择：传统的大肠杆菌、酵母、昆虫和哺乳动物细胞表达系统以及较新的植物和体外表达系统。每种表达系统都有很多成功的例子，但重组蛋白的个性不尽相同，没有任何一个系统和方法是普遍适用的，为目的蛋白选择一个恰当的表达系统也就成为表达工作的重中之重。关于目的蛋白的一切信息，对表达系统的选择都是有帮助的，有几个最基本的问题一定要在表达之前回答清楚：目的蛋白的来源是原核还是真核生物具有什么样的功能分子量和聚合状态是膜蛋白还是水溶蛋白胞内表达还是分泌表达是否需要以及需要何种翻译后修饰有没有配体、底物或产物类似物可以利用对蛋白酶是否敏感有多少分子内及分子间二硫键对目的蛋白的表达量、活性、表达速度和成本有怎样的要求除了摸清目的蛋白的脾性，还要清楚各个表达系统的特点、优势和局限性，才能找到表达工作的大略方向，要获得最适合目的蛋白的表达方案，还需要在具体实验中调整优化。表1比较了目前常用的表达系统的特点，并给出了粗略的适用范围。大肠杆菌酵母昆虫细胞哺乳动物细胞流程简单简单复杂复杂培养基简单简单复杂复杂成本低低中高产率高中中低表达量高高较高较低蛋白折叠中较好较好好胞外表达周质空间分泌至培养基分泌至培养基分泌至培养基细胞增殖周期30min90min18H24H 折叠常有错误折叠偶有不当折叠正确折叠正确二硫键难以形成有有有 N-糖基化无甘露糖残基，高无唾液酸，简单复杂 O-糖基化无有有有磷酸化无有有有酰化无有有有 γ-羧基化无无无有适用原核蛋白、简单真核蛋白真核蛋白、分泌表达蛋白真核蛋白、分泌表达蛋白复杂高等真核生物蛋白表1：常用表达系统比较 2. 原核表达系统原核表达系统发展完善、流程简单快速、成本低、产量高，对大部分蛋白来说都值得一试，尤其适宜于表达原核来源的以及不需要翻译后修饰的真核蛋白。表达菌株原核表达系统刚用的宿主菌有E. coli，Bacillus等。其中革兰式阳性的Bacillus更适宜在其周质空间分泌表达重组蛋白；革兰氏阴性的E. coli能够广谱表达异源蛋白。大肠杆菌表达系统是目前发展最完善的重组蛋白表达系统。常用大肠杆菌菌株有BL21（DE3）、

(整理)《表面活性剂》名词解释.

表面活性剂化学复习资料名词解释 1. 表面：物质和它产生的蒸汽或者真空接触的面。（液体或固体和气体的接触面） 2. 界面：任意两种物质接触的两相面。（液体与液体，固体与固体或液体的接触面） 3.表面张力：指垂直通过液面上任一单位长度、与液面相切的收缩表面的力（N/m）。 4. 表面自由能：单位表面上的分子比体相内部同分子量所具有的自由能过剩值，称为表面自由能（J/m2）。 5. 表面活性：在液体中加入某种物质使液体表面张力降低的性质叫表面活性。 6. 表面活性剂：是指在某液体中加入少量某物质时就能使液体表面张力急剧降低，并且产生一系列应用功能的物质。 7. 吸附：表面上活性剂这种从水内部迁至表面，在表面富集的过程叫吸附。 8. 低表面能固体：表面活性剂的表面能<100mJ/m2的物质 9. 高表面能固体：表面活性剂的表面能>100mJ/m2的物质。 10. 胶束：两亲分子溶解在水中达一定浓度时，其非极性部分会互相吸引，从而使得分子自发形成有序的聚集体，使憎水基向里、亲水基向外，减小了憎水基与水分子的接触，使体系能量下降，这种多分子有序聚集体称为胶束。 11. 反胶束：表面活性剂在有机溶剂中形成极性头向内，非极性头尾朝外的含有水分子内核的聚集体，称为反胶团。 12. 临界胶束浓度：表面活性剂溶液的表面张力随着活性剂浓度的增加而急剧地降低，但是当浓度增加到一定值后，表面张力随溶液浓度的增加而变化不大，此时表面活性剂从分子或离子分散状态缔合成稳定的胶束，从而引起溶液的高频电导、渗透压、电导率等各种性能发生明显的突变，这个开始形成胶束的最低浓度称为临界胶束浓度(CMC)。 13. 亲水-亲油平衡值（HLB）：是表面活性剂中亲水和亲油基团对油或水的综合亲合力，是用来表示表面活性剂的亲水亲油性强弱的数值。 14. Krafft点：它是指1%的表面活性剂溶液在加热时由浑浊忽然变澄清时相变的温度。 15. 浊点：是指一定浓度的非离子表面活性活性剂溶液在加热过程中突然析出使溶液变浑浊的温度点。 16. 增溶作用：是指由于表面活性剂胶束的存在，使得在溶剂中难溶乃至不溶的物质溶解度显著增加的作用。 17. 增溶量：向100ml已标定浓度的表面活性剂溶液中由滴定管滴加被增溶物，当达到饱和时被增溶物析出，溶液变浑浊，此时已滴入溶液中的被增溶物的物质的量（mol）即为增溶量。 18. 胶团催化：反应速度对环境极为敏感，表面活性剂在溶液中形成胶团使介质的性能发生变化，其中发生的化学反应速度的明显的影响，这种现象称为胶团催化。 19. 多重乳状液：在乳状液分散相液滴中若有另一种分散相液体分布其中，这样形成的体系称为多重乳状液。 20. 乳化作用：是在一定条件下使互不混溶和两种液体形成有一定稳定性的液液分散体系的作用。 21. 相转变温度（PIT）：是指在某一种特定的体系中，表面活性剂的亲水亲油性质达到平衡时的温度。 22. 润湿作用：指加入表面活性剂后，由于表面活性剂的双亲结构，可在界面处发生定向吸附，降低液体的表面张力，从而改变体系润湿性质的作用。 23. 沾湿：指液-气界面和固-气界面上的气体被液体取代的过程。 24. 浸湿：指固体浸入液体的过程。 25. 铺展：液体取代固体表面上的气体，将固-气界面用固-液界面代替的同时，液体表面能够扩展的现象即为铺展。 26. 自憎液体：不能在自己的吸附膜自发展开的液体称为自憎液体。 27. 临界表面张力：以接触角θ的余弦 cosθ对液体的表面张力γL作图，可得一直线，将此直线延长到cosθ＝1处,其对应的液体表面张力值即为此固体的临界表面张力。 28. 起泡性：是指表面活性剂在外界作用下产生泡沫的难易程度。 29. 稳泡性：是指在表面活性剂水溶液产生泡沫之后，泡沫的持久性或泡沫“寿命”的长短。 30. 分散：将固体以微小粒子形式于分散介质中，形成的具有相对稳定性体系的过程 31. 分散作用：一般是指把一种物质分散剂于另一种物质中以形成分散剂体系的作用。 32. 聚集：悬浮液中微细粒子相互粘附团聚。 33. 聚集作用：分散剂粒子以任意方式或受任何因素的作用而结合在一起，形成有结构或无特定结构的集团的作用。 34. 絮凝：乳化剂中分散相的乳滴发生可逆的聚集现象。 35. 絮凝作用：在体系中加入一定的电解质可能中和微粒表面的电荷，降低液体表面的扩散双电子层的厚度，降低表面电贺荷的电量，使

如何选择合适的蛋白表达系统

如何选择合适的蛋白表达系统？金开瑞拥有原核/真核/无细胞等六大重组蛋白表达系统，提供从基因合成到蛋白表达的一站式蛋白服务，并通过表达载体的改造和实验流程的优化，可在最短时间获得最高的产量，满足您的各项需求。目前，金开瑞已成功为全球各地客户提供3000余种重组蛋白产品，涵盖人类疾病相关蛋白（细胞因子、激素、酶、病毒抗原）、动植物和微生物蛋白等。根据您所需要表达蛋白的特点，可选择合适的表达系统：表达系统系统优势适用于金开瑞特色原核大肠杆菌目的基因表达量高、成本低、培养条件简单、生产迅速、可拓展性强、转化操作简单、容易形成二硫键原核蛋白、简单真核蛋白在表达包括可溶性蛋白、包涵体、融合蛋白等方面，拥有丰富的经验和专业技术，能解决蛋白表达过程中的各种瓶颈问题枯草芽孢杆菌非致病性、无内毒素、可大量分泌某些胞外蛋白、培养条件简单、生产迅速、无明显的密码子偏爱性、不易形成包涵体胞外蛋白采用基因工程突变改造的枯草芽孢杆菌做为表达宿主；采用自己改造的载体，可以提供胞内或胞外、组成型或诱导型的表达真核酵母细胞经济高效，放大培养基廉价、培养条件简单、生产迅速、可拓展性强、分泌蛋白或细胞工业菌种改良、放自行改造的高效分泌载体和宿主组合，可在最大程度上实现最高质量的蛋白表达；专利

内表达的良好选择、蛋白分泌高效且允许简单纯化、广泛的翻译后修饰、无内毒素大的Biobrick技术，可成功用于工业菌种的改良优化杆状病毒-昆虫细胞基因容量大，外源基因表达效率高，有效的细胞折叠、中度可扩展性、广泛的翻译后修饰、糖基化与哺乳动物细胞类似、相对容易地酶促的去糖基化、无内毒素病毒疫苗、信号蛋白、细胞因子、激酶等采用AcNPV-sf9细胞和BmNPV-BmN细胞两种表达系统，多表达系统、多宿主、多载体的选择性极大的提高了蛋白表达的成功率哺乳动物细胞较高的表达水平、中度的可扩展性、细胞的悬浮培养特性可大规模生产、有效的蛋白折叠、适合分泌蛋白、充分的翻译后修饰、无内毒素复杂高等真核生物蛋白采用特有的哺乳动物细胞表达载体和多种转染方法的组合方式，优化表达条件，提高转染效率，大大缩短实验周期，显著提高表达量无细胞操作简便，需时短，表达量高，系统开放较灵活，轻松表达特殊蛋白，制备蛋白复合物，及平行合成多种不同蛋白等膜蛋白、毒蛋白小量表达条件摸索，专业解决相关难题，大大缩短实验周期，提高表达量。

表面活性剂临界胶束浓度测定

表面活性剂临界胶束浓度测定应化118班于正风 1102010801 摘要本文主要介绍了表面活性剂（以SDS为例）的几种物理性质以及其临界胶束浓度的几种测定方法。包括测定原理、实验方法及方法特点, 并指出了SDS的林临界胶束浓度。对于理解表面活性剂的性质有较好的参考价值。关键词表面活性剂; 临界胶束浓度; 测定方法; 测定原理引言表面活性剂的临界胶束浓度(CMC)作为表面活性剂的表面活性的一种量度, 是其溶液性质发生显著变化的一个分水岭。由于表面活性剂的一些理化性质在胶束形成前后会发生突变, 因而, 可借助此类变化来表征表面活性剂的CMC。在药学领域中, 表面活性剂的大量研究工作都与各种体系的CMC测定有关。常用的CMC测定方法有表面张力法、光散射法、染料增溶性、电导率法等。但是, 不同理化性质对表面活性剂总浓度变化的响应范围和灵敏度不同, 导致用不同方法测得的CMC的值也各有不同。本文介绍CMC测定技术的原理及简单的操作方法, 提供大量的物理参数及国内外的最新研究动态, 为表面活性剂在药学中的应用与开发提供理论支持。临界胶束浓度的形成机制进入水中的表面活性剂分子随着其碳氢链逐渐增长, 它在水中达到一定浓度时, 溶液表面张力不再下降。为了使整个溶液体系的能量趋于最低, 在溶液内部的双亲分子会自动形成极性基向水碳氢链向内的集合体, 这种集合体称为胶束或胶团 (M icelle), 形成胶束所需的最低浓度称为临界胶束浓度。图 1 表面活性剂的排列情况与浓度关系图一表示表面活性剂的浓度变化时, 表面活性剂分子在溶液表面和内部的分布情况。在浓度很稀时, 若稍增加表面活性剂的浓度, 表面活性剂的一部分很快地聚集在水面, 使水和空气的接触面减小, 从而使表面张力急剧下降, 如图 1( a); 增大表面活性剂浓度, 达到饱和状态时, 液面上刚刚排满一层定向排列的单分子膜, 如图 1( b); 若再增加浓度, 则只能使水溶液中的表面活性分子开始以几十或几百个聚集在一起,排列成憎水基向里,亲水基向外的胶束, 如图 1( c)。说明浓度大于临界胶束浓度时,液面上早已形成紧密、定向排列的单分子膜, 达到饱和状态。若再增加表面活性剂的浓度,只能增加胶束的个数。由于胶束是亲水的, 不具有表面活性,不能使表面张力进一步降低。图 1 表面活性剂的排列情况与浓度关系在CM C附近,由于胶束形成前后,水中的双亲分子排列情况以及总粒子数目都发生了急剧的变化,反映在宏观上,就会出现表面活性剂溶液的理化性质(如表面张力、溶解度、渗透压、导电度、密度可溶性、去污、增溶等)发生跃

蛋白质表达经验

如何做原核表达之所以首先介绍Novagen公司的产品是因为用过它的pET系列载体，感觉很好用。Novagen的母公司是德国默克（Merck）公司，它是国际著名的化学及制药公司总部位于德国的Darmstadt，已有300多年的历史。已在全世界55个主要国家设立了分公司，其中在28个国家建有62个生产基地。Novagen公司出品的pET系列载体是目前应用最为广泛的原核表达系统，已经成功地在大肠杆菌中表达了各种各样的异源蛋白。pET系列载体是利用大肠杆菌T7噬菌体转录系统进行表达的载体，其表达原理见下图。 T7噬菌体具有一套专一性非常强的转录体系，利用这一体系中的元件为基础构建的表达系统称为T7表达系统。T7噬菌体基因编码的T7RNA聚合酶选择性的激活T7噬菌体启动子的转录。它是一种高活性的RNA聚合酶，其合成mRNA 的速度比大肠杆菌RNA聚合酶快5倍左右。并可以转录某些不能被大肠杆菌RNA聚合酶有效转录的序列。在细胞中存在T7 RNA聚合酶和T7噬菌体启动子的情形下，大肠杆菌宿主本身基因的转录竞争不过T7噬菌体转录体系，最终受T7噬菌体启动子控制的基因的转录能达到很高的水平。

T7噬菌体启动子的转录完全依赖于T7 RNA聚合酶，因此T7 RNA聚合酶的转录调控模式就决定了表达系统的调控方式。噬菌体DE3是λ噬菌体的衍生株，一段含有lacⅠ，lacUV5启动子和T7 RNA聚合酶基因的DNA片段倍插入其int基因中，用噬菌体DE3的溶源菌，如BL21(DE3)、HMS174(DE3)等作为表达载体的宿主菌，调控方式为化学信号诱导型，类似于Lac表达系统。从开始涉及表达的时候可以根据是否要用基因本身的起始密码子进行选择，Novagen公司仅提供三个载体：pET-21(+)，pET-24(+)和 pET-23(+)。如果你打算利用载体的起始密码子，那么就有许多选择。根据是否要可溶性表达，选择加有不同标记的载体。一般说来在大肠杆菌中不加标记外源蛋白都会以不溶的包涵体形式表达。为了让外源蛋白融合表达一般说来有三个策略： 1. 与一个高度可溶的多肽联合一起表达，比如：谷胱甘肽S 转移酶（glutathione S transferase, GST）、硫氧还蛋白

反胶束萃取在食品中的研究与进展

分离工程期末论文反胶束萃取在食品中的研究与进展Research Progress of Reversed Micellar Extraction in Food Science 学院：化学工程学院专业班级：化学工程与工艺化工081 学生姓名：林佳楠学号： 050811129 指导教师：戴卫东（副教授） 2011年6月

1 引言或绪论随着现代生物工程技术的不断发展，传统的溶剂萃取方法难以满足生化分离的要求。1977年Luisi等人[1]首次发现胰凝乳蛋白酶可以溶解于含表面活性剂的有机溶剂，提出反胶束概念，短短几十年，反胶束萃技术已经广泛应用于蛋白质、酶、氨基酸和细胞色素等生物活性大分子的分离提纯。反胶束萃取技术基于液-液相转移，萃取条件温和，萃取效率高且反胶束体系能模拟细胞天然环境作为酶催化反应介质，在食品工业领域有良好的应用前景。 2 反胶束萃取原理和制备 2.1 基本原理表面活性剂溶于水中，当其浓度超过临界胶束浓度(CMC)时，便形成聚集体，称为正常胶束。表面活性剂溶于有机溶剂，当浓度大于临界胶团浓度时，会在有机相中形成聚集体，称为反胶束。反胶束中极性头朝内，非极性尾朝外排列形成亲水内核，称为“水池”。如图1所示。萃取时，待萃取的原料液以水相形式与反胶束体系接触，调节各种参数，使其中要提取的物质以最大限度转入反胶束体系(前萃取)，后将含该物质的前萃液与另外一个水相接触，再次调节pH、离子强度等参数分出要提取物质。 2.2 体系性质反胶束体系的性质常用参数W0(或R)，θ与N来表示，其中W0为水与表面活性剂的摩尔比，θ是增溶水相对总体积的浓度，N是组成每个反胶柬微粒的表面活性剂分子个数(聚焦数)。当W0一定时，θ与N决定了胶柬微粒的相对浓度。其中最重要的参数为W0 。 2.3 增溶动力学蛋白质在反胶束中增溶，普遍认为动力是蛋白质表面的电荷与形成反胶束内

蛋白质表达的性质

蛋白质表达的性质关键词：大肠杆菌，细胞，试剂，标准物质，北京标准物质网 1.所需要的蛋白表达量如果只是需要少量蛋白，比如筛选一系列点突变体的酶活性，酶学检测可以在大肠杆菌粗提物中进行，采用多数通用表达质粒即可，没有必要花很大精力去优化方案来提高表达量。如果实验蛋白需要量大，就有必要尝试不同宿主载体系统和纯化方法，从中找出大批量表达蛋白的可行方案。外源蛋白水平与生理状态下的内源蛋白相仿，有助于蛋白功能或蛋白相互作用研究。 2.表达蛋白的可溶性在抗体制备时不一定要求蛋白可溶，而研究蛋白功能时可溶性蛋白是关键。利用大肠杆菌表达的融合蛋白常常形成包涵体，相对容易进行纯化，不易被降解。若需要的是可溶性蛋白，可以采用降低复性温度，降低表达水平，改变携带蛋白和尝试不同宿主菌株等方法提高蛋白溶解性。 3.表达蛋白的稳定性在大肠杆菌中表达的外源蛋白尤其是真核蛋白常常稳定性不足。将融合蛋白以包涵体形式表达，或者采用缺失已知蛋白酶的大肠杆菌菌株作为宿主，可减少不稳定蛋白质的降解。由于不同菌株内蛋白酶的水平不同，对于某一特定融合蛋白来说，尝试不同菌株有助于提高蛋白稳定性。 4.蛋白质分子量在哺乳动物细胞中，不加标签的外源蛋白和内源蛋白由于分子量相同在免疫印迹上难以区分，表达融合蛋白有助于两者的区分。一般来说小于5kD或者大于100kD的蛋白表达比较困难。蛋白越小，越容易被内源蛋白水解酶所降解，在这种情况下可以采取融合蛋白表达，在每个单体蛋白之间设计蛋白水解或者是化学断裂位点。如果蛋白较小，可以加入GST、Trx、MBP等较大的标签蛋白可能促进蛋白正确折叠：如果蛋白大于60kD则建议用6×His、HA等较小的标签。对于结构研究清楚的大蛋白可以根据实验目的表达截短蛋白(truncated protemin)，如果是为抗体制备，一定要保证截取抗原性较强的部分。 5.是否需要活性蛋白如果蛋白表达的目的仅仅是获得一些制备抗体的材料，就没有必要获得活性蛋白。如果目的蛋白表达是用于功能研究，那么保持或者恢复蛋白的活性是非常重要的，纯化难易相对不重要。如果需要表达具有生物学功能的膜蛋白或分泌性蛋白，例如细胞膜表面受体或细胞外的激素和酶，则更需要利用真核细胞表达。当表达蛋白是用于结构研究，最好是以可溶性蛋白的形式。在不同大肠杆菌菌株尝试表达蛋白，减少体内蛋白异常折叠，尽可能减少体外变性从而保持正常蛋白构象。

表面活性剂

第三章表面活性剂表面活性剂在药物制剂的制备中被广泛应用，其结构特征是具有亲水性与亲脂性两种基团，其作用是能显著降低分散系的表面（界面）张力，因此可用作乳化剂、助悬剂、增溶剂、促吸收剂、润湿剂、起泡剂与消泡剂、去污剂等，是药用乳剂、悬浊剂、脂质体等的重要辅料。本章重点讨论表面活性剂的基本性质（如CMC值、HLB值、Krafft点与昙点等）与测定方法等。第一节表面活性剂分类一、表面活性剂(surfactant)：具有很强表面活性，加入少量就能使液体表面张力显著下降的物质。 1.①纯液体在一定温度有一定的表面张力，是液体的物理常数。 ②当在水中加入无机盐或糖类物质时，则水的表面张力略有升高； ③当在水中加入低级脂肪醇、脂肪酸时，则水的表面张力下降，称此类物质为水的表面活性物质。 ④当在水中加入油酸钠、十二烷基硫酸钠（高级脂肪酸）时，则水的表面张力能够显著的降低，称此类物质为该溶剂的表面活性剂(surfactant)。 2.表面活性剂分子的结构特征：是由具有极性的亲水基和非极性的亲油基组成，而且两部分分处两端。因此，表面活性剂具有既亲水又亲油的两亲性质，但具有两亲性的分子不一定都是表面活性剂。 3.表面活性剂的吸附性：表面活性剂由于其特殊结构可以在两相界面发生定向排列，来改变两相界面性质。从而起到润湿、乳化、增溶、絮凝、反絮凝、起泡、消泡的作用。（1）在溶液中的正吸附：表面活性剂在溶液表面层聚集的现象为正吸附，正吸附改变了溶液表面的性质。最外层疏水，表现低表面张力，产生较好的润湿性、乳化性、增溶性、起泡性。（2）在固体表面的吸附：表面活性剂溶液与固体接触时，表面活性剂分子可能在固体表面发生吸附，使固体表面性质发生改变，易于润湿。二、表面活性剂的类型 1.表面活性剂分类方法有多种，根据来源可分为天然表面活性剂与合成表面活性剂； 2.根据溶解性质可分为水溶性表面活性剂与油溶性表面活性剂； 3.根据极性基团的解离性质分为离子型表面活性剂与非离子型表面活性剂两大类；再根据离子型表面活性剂所带电荷，又分为阳离子、阴离子、两性离子表面活性剂。每类中又可根据亲水或亲油基团分为不同的种类。 4.高分子表面活性剂：较强的表面活性的水溶性高分子。如海藻酸钠、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、聚乙烯醇、聚维酮等，但与低分子表面活性剂相比，高分子表面活性剂降低表面张力的能力较小，增溶力、渗透力弱，乳化能力较强，常用做保护胶体。常用的表面活性剂分类如下：（一）阴离子表面活性剂：起表面活性作用部位是阴离子，带有负电荷。 1.高级脂肪酸盐（肥皂类）：易被酸破坏，碱金属皂还可被钙、镁盐等破坏，电解质可使之盐析，只用作外用制剂通式：RCOO－M＋, 如硬脂酸钠、钙、镁等。根据M的不同可分为碱金属皂（可溶性皂，O/W型乳化剂）；碱土金属皂（不溶性皂，W/O）；有机胺皂（脂肪酸+有机胺-硬脂酸三乙醇O/W软膏乳化剂）

蛋白质表达技术

蛋白表达技术已渗透到生命科学研究的各个领域。越来越多的基因被发现，其中多数基因功能不明，利用蛋白表达系统表达目的基因是研究基因功能及其相互作用的重要手段。常见的蛋白表达系统包括大肠杆菌/原核蛋白表达系统、酵母/真核蛋白表达系统、哺乳动物细胞蛋白表达系统、昆虫细胞蛋白表达系统、植物蛋白表达系统。在此针对一些常见的问题进行总结，与大家共享，共同学习。 Q1：为什么蛋白表达出来了，SDS-PAGE检测时大小不符？ A1：进行SDS-PAGE检测的时候蛋白的净电荷会影响迁移率。带电量高的蛋白会结合较少的SDS，因此阻碍了蛋白的泳动。富含脯氨酸的蛋白会在SDS-PAGE胶中移动得特别慢。但是如果蛋白的等电点在5-9之间，并且组成的氨基酸组分没有明显的偏好，那么目的蛋白迁移率与预期相差较远就很有可能不是由于凝胶电泳造成的。这个时候最好利用C-端或者N-端的标签进行Western Blot，看是否由于蛋白被蛋白酶降解而导致多条目的条带或者比预期小很多的条带出现。如果蛋白酶过高可以尝试换个缺陷菌株。 Q2：如何得到可溶的蛋白？ A2：如果希望得到能行使功能的蛋白，蛋白应该以可溶形式表达。避免包涵体形成的方法很多，比如：选用表达量不高的蛋白表达系统，选择有助于可溶性表达的融合蛋白表达系统等，使用基本培养基等也有助于可溶性表达。另外一个容易忽视的问题是大肠杆菌内还原性过高会导致二硫键不能正确形成，同样容易导致表达产物不溶，更换菌株有助于解决这个问题。 Q3：大肠杆菌蛋白表达实验中需要注意的事项？ A3：（1）所有操作尽量在冰上操作，以避免蛋白质发生变性；（2）根据自己的需要选择不同的表达载体，并注意不同的表达载体上的融合标签和携带的抗性基因，其中有些标签是可以去除的。（3）构建好的载体最好进行测序验证，保证读码框正确，即没有移码。（4）长期保存的pET重组子在高浓度甘油中会导致质粒不稳定。（5）37 ℃生长常常会使一些蛋白累积形成包涵体，而30 ℃生长则可能产生可溶的和有活性的蛋白。在某些情况下，低温（15－20℃）延长诱导时间可以使溶解性蛋白的产量达到最大。（6）进行SDS-PAGE分析时，需优化电泳上样体积。 Q4：毕赤酵母系统具有哪些优点？ A4：（1）含有特有的强有力的启动子，这是目前最强、调控机理最严格的启动子之一，用甲醇可严格地调控外源基因的表达； 2）表达水平高，既可在胞内表达，又可分泌型表达。毕赤酵母中，报道的最高表达量为破伤风毒素C为12 g/L，一般大于1 g/L。一般毕赤酵母中外源基因都带有指导分泌的信号肽序列，使表达的外源目的蛋白分泌到发酵液中，有利于分离纯化；（3）发酵工艺成熟，易放大。已经有大规模工业化高密度生产的发酵工艺，且细胞干重达100 g/L以上，表达重组蛋白时，已成功放大到10000 L；（4）培养成本低，产物易分离。毕赤酵母所用发酵培养基十分廉价，一般碳源为甘油或葡萄糖及甲醇，其余为无机盐，培养基中不含蛋白，有利于下游产品分离纯化；（5）外源蛋白基因遗传稳定。一般外源蛋白基因整合到毕赤酵母染色体上，随染色体复制而复制，不易丢失；（6）作为真核表达系统，毕赤酵母具有真核生物的亚细胞结构，具有糖基化、脂肪酰化、蛋白磷酸化等翻译后修饰加工功能。 Q5：一个理想的可诱导蛋白表达系统需要符合哪几个方面的要求？

实验六用反胶束萃取技术提取胰蛋白酶

实验六用反胶束萃取技术提取胰蛋白酶 Ⅰ反胶束萃取法提取胰蛋白酶一、实验目的和要求 1、加深对反胶束萃取基本原理的理解。 2、了解反胶束萃取的工艺过程及影响因素。 3、了解胰蛋白酶酶话的测定方法和原理。 4、研究pH对萃取率和反胶束率的影响规律，求出适宜的萃取pH值。二、实验原理反胶束萃取技术是近年来发展的具有开发前景的新型分离技术。他是由表面活性剂分散在有机溶剂（连续相）中，自发形成纳米级的聚集体，称反胶束（或称反胶团）。在反胶束溶液中，组成反胶束的表面活性剂定向排列，其非极性尾向外伸入非极性有机溶剂的有机主体中，而极性头向内排列，形成一个极性核，核内充满水溶液，具有溶解蛋白质之类大分子物质的能力。当含有反胶束的有机溶剂与蛋白质水溶液接触时，蛋白质在静电引力、疏水作用或亲和力等推动作用力下溶入极性核，从而被萃取，然后再控制适当的条件使蛋白质从负载有机相中重新反萃取到水相，达到纯化的目的。影响反胶束萃取的因素很多，主要有水相溶液的pH、离子强度、表面活性剂和有机溶剂的种类、浓度和温度等。胰蛋白酶（trypsin）广泛存在于动物的胰中，是由胰腺腺泡细胞合成的肽链内切酶，分Ⅰ型和Ⅱ型两种，其相应前体分别胰蛋白酶原Ⅰ（CTN）和胰蛋白酶原Ⅱ（ATN）。正常胰液中胰蛋白酶原占总蛋白质含量的19%，CTN 是AT N 的2倍.胰蛋白酶为白色或类白色结晶性粉末，等电点pI = 10.8。胰蛋白酶是生物化学尤其是蛋白质组学研究的重要试剂。它具有分解肽链的作用，能消化溶解变性蛋白质，对未变性的蛋白质无作用，因此能使浓痰液、血凝块等消化变稀，易于引流排除，加速创面净化，促进肉芽组织新生，而不损伤正常组织或损伤极微（因血清内有胰蛋白酶抑制物）。可帮助创伤或手术后伤口愈合，治疗烧伤，具有多种药用价值。此外，还有抗炎作用。临床上可用于脓胸、血胸、外科炎症、溃疡、瘘管等所产生的局部水肿、血肿、脓肿等。喷雾吸入，