广东紫珠核糖体DNA ITS序列分子鉴定

第10期收稿日期：2014-01-10基金项目：江西省教育厅青年基金项目（GJJ10252）；江西省天然药物活性成分研究重点实验室开放基金项目作者简介：李家敏（1979-），女，贵州福泉人，讲师，硕士，主要从事药用植物生物技术和鉴定研究，（电话）1510516228（电子信箱）jiaminligz@㊂广东紫珠核糖体DNA ITS 序列分子鉴定李家敏，姜琼，汪剑鸣（宜春学院化学与生物工程学院，江西宜春336000）摘要：采用改良CTAB 法提取广东紫珠（Callicarpa kwangtungensis Chun.)植物总DNA ，以通用引物ITS4和ITS5PCR 扩增核糖体DNA ITS 序列，并运用MEGA5.2软件分析ITS 序列和构建系统发育树㊂结果表明，广东紫珠的核糖体DNA ITS 序列长度为658bp ，ITS1和ITS2的长度分别为229㊁267bp ，G+C 含量分别为67.39%㊁70.30%㊂用NJ 法根据ITS1与ITS2序列构建系统发育树，ITS 片段在种间存在差异，可区分紫珠属中不同的种㊂测序分析和系统发育树构建，能够对广东紫珠进行准确的分子鉴定，为紫珠属中药材的种类鉴定和种间的分类地位提供分子生物学理论依据㊂关键词：广东紫珠（Callicarpa kwangtungensis Chun.)；ITS 序列；分子鉴定中图分类号：Q78文献标识码：A文章编号：0439-8114（2014)10-2435-05Identification of Callicarpa kwangtungensis Chun.with ITS Sequencesof Nuclear Ribosomal DNALI Jia-min ，JIANG Qiong ，WANG Jian-ming（College of Chemical and Biological Engineering，Yichun University，Yichun 336000，Jiangxi，China）Abstract ：To identify C.kwangtungensis Chun.with ITS of rDNA，the total DNA of the sample was extracted with modified CTAB.The ITS of rDNA was amplified using a pair of primers ITS4and ITS5then was cloned，sequenced and analyzed by MEGA5.2.The results showed that the length of ITS of rDNA was 658bp.The DNA sequence of ITS4was 229bp with the content of G+C of 67.39%.The DNA sequence of ITS5was 267bp with the content of G+C of 70.30%.The phylogenetic treebased on ITS data was constructed.Molecular identification could be performed on Callicarpa kwangtungensis Chun.It willprovid molecular evidence for taxonomy and identification of different species of Callicarpa .Key words ：Callicarpa kwangtungensis Chun.；ITS sequences；molecular identification广东紫珠（Callicarpa kwangtungensis Chun.）为马鞭草科紫珠亚属多年生落叶植物，适合生长于海拔100~1000m 的丘陵山地，主要分布于江西㊁湖南㊁福建㊁贵州等省，广东和广西等地也有少量分布㊂广东紫珠的干燥茎㊁枝㊁叶均可入药，具有收敛止血㊁清热解毒等功效，收载于‘中国药典“（2010年版），可用于治疗咯血㊁便血㊁肺胃出血㊁崩漏㊁肺热咳嗽㊁咽喉肿痛㊁烧伤㊁热毒疮㊁外伤出血等㊂化学成分研究表明，广东紫珠富含熊果酸㊁槲皮素㊁没食子酸㊁水杨酸等化学成分[1]；药理研究显示具有较强的抑菌作用和显著的止血效果[2]，临床上广东紫珠主要用于治疗宫颈糜烂出血㊁阴道炎㊁宫颈炎等，是抗宫炎片㊁抗宫炎颗粒和抗宫炎胶囊等中成药的主要成分[3]㊂目前，市场上对广东紫珠资源需求量很大，原料药材供不应求，由于大量采挖，野生资源锐减，且遭到严重破坏，加上野生药材质量难以控制，野生资源已不能满足社会需求，对广东紫珠进行资源鉴定和育种成为解决这一问题的关键㊂准确鉴定广东紫珠有利于指导其育种，因此，有必要在DNA 分子水平上鉴定广东紫珠与其他紫珠属植物的种间关系㊂ITS（Internal transcribed spacer，ITS）序列是核糖体DNA 转录单位的一部分，包括了ITS1㊁ITS2和5.8S rDNA 基因，在被子植物中ITS 序列既具有核苷酸序列的保守性和高度变异性㊂ITS 序列分析是第53卷第10期2014年5月湖北农业科学Hubei Agricultural SciencesVol.53No.10May.，2014湖北农业科学2014年近年来国际上植物多样性研究的热点，并在药用植物种质资源研究中得到广泛应用，如药用植物品种的鉴定㊁亲缘关系鉴定㊁药用植物分类㊁遗传多样性㊁药用植物DNA条形码分析等[4]㊂本研究采用ITS 序列标记对广东紫珠的核糖体DNA ITS序列进行分子鉴定，构建其系统发育树，从DNA水平上为广东紫珠的地位分类和种间鉴定提供分子证据和为广东紫珠的选育提供试验依据㊂1材料与方法1.1材料广东紫珠于2013年3月采集自江西省宜春市，经宜春学院化学与生物工程学院汪剑鸣教授鉴定为马鞭草科紫珠属广东紫珠，保存于江西省天然药物活性成分研究重点实验室㊂1.2主要试剂与仪器NaCl㊁CTAB㊁EDTA㊁Tris㊁氯仿㊁异戊醇㊁异丙醇均为分析纯，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，PCR反应试剂购自于宝生物工程（大连）有限公司㊂总CTAB提取缓冲液为2.5mol/L NaCl㊁2%CTAB（W/V）㊁0.05mol/L EDTA㊁0.1mol/L Tris[5]㊂超低温冰箱（7010702）㊁水浴锅（HH-4）㊁离心机（Eppendorf-G5415R）㊁XP基因扩增仪（BYQ602101-174）㊁双稳定时电泳仪（DYY-6C）㊁紫外分光光度计（UV-2000）㊁凝胶成像系统（Gel Media System）㊂1.3方法1.3.1广东紫珠总DNA的提取新鲜幼嫩叶片，清水冲洗，后以体积分数为70%的乙醇消毒，去离子水冲洗3次，于-80ħ冰箱保存㊂取0.2g叶片组织用液氮研磨成粉末，放入1.5mL离心管中；加入600μL65ħ预热的CTAB提取缓冲液，轻轻摇匀，65ħ水浴60min，期间轻晃3次；再加700μL氯仿-异戊醇（体积比24：1），轻轻颠倒混匀10min，10000r/min离心10min，转移上清液至另一新管中；加入等体积-20ħ预冷的异丙醇混匀，-20ħ放置30min，10000r/min离心15min，弃上清液，70%的乙醇沉淀，无水乙醇洗涤，室温挥干乙醇；以去离子水在4ħ下溶解DNA，-20ħ保存㊂1.3.2核糖体DNA ITS区片段的PCR扩增采用核糖体DNA ITS序列通用引物扩增整个ITS片段（ITS1-5.8S rDNA-ITS2区段），ITS4：5ᶄ-TCCTCCGC TTATTGATATGC-3ᶄ，ITS5：5ᶄ-GGAAGGAGAAGTC GTAACAAGG-3ᶄ[6]㊂PCR反应体系：10ˑPCR Buffer 5μL，MgCl2（25mmol/L）4μL，dNTPs（2mmol/L）5μL，ITS4与ITS5引物各5μL（1μmol/L），Taq DNA 聚合酶（5U/μL）1μL，DNA模板（约70~80ng）5μL，ddH2O20μL㊂PCR反应程序为：95ħ预变性4min；95ħ变性1min，55ħ退火1min，72ħ延伸1min，35个循环；72ħ延伸5min，PCR产物以1.0%琼脂糖凝胶进行电泳检测㊂PCR产物用TaKaRa Mini BEST Agarose Gel DNA Extraction kit Ver.3.0（宝生物工程有限公司）进行纯化，按照说明书操作㊂1.3.3核糖体DNA ITS序列的克隆与测序将纯化后的PCR产物克隆至大肠杆菌pMD18-T载体上，经氨苄青霉素抗性筛选后，将所得菌落接种到LB液体培养基（含氨苄青霉素）上进行过夜培养，提取质粒进行PCR扩增，以1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，并将阳性菌株送往生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序㊂1.3.4核糖体DNA ITS序列分析DNA序列使用MEGA5.2软件进行分析，采用Pairwise distances法计算遗传距离，采用NJ邻接法构建紫珠属多个物种的NJ系统发育树；系统发育树各分支的置信度用自举检验法（Bootstrap test）检验，共进行2000次循环，以评价各分支的系统学意义与可靠性2结果与分析2.1广东紫珠总DNA提取结果将提取的总DNA稀释200倍后，取5μL样品，以1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1所示㊂不同样本DNA的电泳带均有清晰明确的目的条带，无降解现象，样本DNA质量比较稳定㊂2.2核糖体DNA ITS PCR扩增结果以1.5%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，结果如图2所示㊂由图2可以看出，PCR扩增产物条带明亮，片段完整，分子量约750bp左右，与报道中ITS 片段大小相符㊂将PCR扩增产物进行切胶，并用试剂盒（TaKaRa Mini BEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0）进行回收㊂2.3核糖体DNA ITS序列分析用MEGA5.2软件对核糖体DNA ITS序列进行分析，以来源于英国皇家植物园的紫珠属植物Calli-carpa japonica的核糖体DNA ITS序列（FM163230）作为参比序列，进行序列拼接，结果如图3所示㊂广东紫珠的核糖体DNA ITS片段长度为658bp，ITS1长为229bp，G+C含量为67.39%；5.8S rDNA长为162bp；ITS2长为267bp，G+C含量为70.30%㊂由于5.8S rDNA序列比较保守，本研究仅分析ITS序列㊂将样本的ITS序列与在GenBank中已提交的紫珠属物种的ITS序列（表1）进行多序列BLAST比对分析㊂多序列同源比对后的ITS长度为2436第10期M.DNA Marker；1，2.紫珠总DNA图1广东紫珠总DNA琼脂糖凝胶电泳结果M.DNA Marker；1，2.扩增产物图2广东紫珠核糖体DNA ITS 序列PCR扩增结果2000bp 1000bp 750bp 500bp513bp，保守位点为428个，占83.43%；变异位点76个，占14.84%，序列比对中Callicarpa japonica 的核糖体DNA ITS 序列与其他物种的ITS 序列出现9bp 缺失（图4）；简约信息位点25个，占4.87%，单个位点50个，占9.75%㊂ITS1的变异位点为32个，简约信息位点数为12个，ITS2的变异位点数44个，简约信息位点数13个㊂本试验结果与厚朴的ITS 序列变异趋于一致[7]㊂从序列比对可见，ITS 序列发生了碱基的替换，ITS2发生次数更多，同时在ITS2区域，发生了碱基的1个㊁3个㊁4个的缺失，而ITS1出现缺失相对少㊂可见，就变异位点而言，ITS2序列所含信息量高于ITS1㊂2.4基于ITS 序列的紫珠属亲缘关系分析由于核糖体DNA ITS 中ITS1和ITS2两个片段长度有限，各自提供的信息量有限，因此，多数研究者将两个片段综合起来分析㊂因此，将样本广东紫珠的ITS 序列与紫珠属物种的ITS 序列通过序列对比，利用MEGA 5.2软件基于Pairwise distances （p-distances）计算样本的遗传距离如表2所示㊂11Identical=.Missing=？Indel=-图3广东紫珠rDNA ITS序列图李家敏等：广东紫珠核糖体DNA ITS 序列分子鉴定2437湖北农业科学2014年Identical=.Missing=？Indel=-图4广东紫珠及紫珠属物种ITS 序列变异位点图个紫珠属样本的遗传距离介于0.022~0.088，广东紫珠与日本紫珠（FM163230）的遗传距离最近，为0.028，与Callicarpa pentandra （FM163237）的遗传距离最远，为0.080㊂根据样本的ITS 序列采用NJ 法构建系统发育树，如图5所示，11个样本被分为两支㊂一支为木紫珠（FM163233）㊁Callicarpa pentandra （FM163237）与白毛紫珠（AF478942）聚为一支，另一支由8个种组成，其中红紫珠（FM163231）㊁老鸦糊（FJ593347）㊁日本紫珠（FM163230）被聚为一支，然后广东紫珠再与其聚为一亚支；狭叶红紫珠（FM163240）㊁大叶紫珠（FM163246）㊁长叶紫珠（FM163252）聚为一亚支；白棠子树（FM163242）与以上两亚支聚为一支，说明以上紫珠属种的遗传距离相近，从分子水平上支持了广东紫珠的分类地位㊂3小结与讨论核糖体DNA ITS 序列能成为被子植物系统与进化研究中的重要分子标记㊂ITS 片段作为18S~26S rDNA 的一个组成部分在核基因组中是高度重复的，通过不等交换和基因转换，不同ITS 拷贝间的序列趋于相近或完全一致，为PCR 扩增产物直接测序奠定了理论基础[8]㊂ITS1和ITS2作为非编码区，承受的选择压力较小，其长度保守，但核苷酸序列变化大，可提供详尽的遗传学信息[9]，同时ITS 序列长度比较稳定，包括5.8S rDNA 在内，总长度只表1紫珠属样本序号1234567891011物种拉丁名Callicarpa japonica Callicarpa kwangtungensis Chun.Callicarpa rubella Callicarpa arbora Callicarpa angusta Callicarpa macrophylla Callicarpa longifolia Callicarpa giraldii Callicarpa candicans Callicarpa dichotoma Callicarpa pentandra中文名日本紫珠广东紫珠红紫珠木紫珠狭叶红紫珠大叶紫珠长叶紫珠老鸦糊白毛紫珠白棠子树无序列号FM163230本试验样本FM163231FM163233FM163240FM163246FM163252FJ593347AF478942FM163242FM163237表2基于ITS 序列的紫珠属种间的遗传距离种号123456789101110.0280.0220.0330.0280.0250.0250.0220.0330.0510.06820.0410.0460.0410.0380.0380.0410.0460.0650.08030.0400.0410.0380.0380.0000.0410.0650.07640.0250.0250.0200.0400.0280.0570.04950.0100.0100.0410.0230.0490.06060.0100.0380.0170.0460.06270.0380.0200.0460.06380.0410.0650.07690.0540.063100.08811注：1.Callicarpa japonica ；2.Callicarpa kwangtungensis Chun.；3.Callicarpa rubella ；4.Callicarpa arbora ；5.Callicarpa angusta ；6.Callicarpa macrophylla ；7.Callicarpa longifolia ；8.Callicarpa giraldii ；9.Callicarpa candicans ；10.Callicarpa dichotoma ；11.Callicarpa pentandra2438第10期有600~700bp，为测序带来了很大方便㊂核糖体DNA ITS 已被广泛地应用到中药植物的鉴定研究中，如当归㊁牛蒡子㊁钩藤等中药植物的鉴定[10-12]㊂广东紫珠的ITS 序列片段总长为658bp，其中G+C 含量较高，相同现象出现在柳属物种上[13]；ITS 的变异位点中，ITS2变异位点比例㊁信息量高于ITS1，结论与不同产区厚朴的ITS 序列分析结果一致[7]；在紫珠属物种中ITS1㊁ITS2的变异都有碱基替换外，但ITS2还出现多个碱基缺失，ITS2片段的差异可用于紫珠属种间鉴定㊂根据植物形态区分，广东紫珠与日本紫珠（FM163230）属于紫珠亚属的孔裂药系，其他9个样本属于纵裂药系㊂基于ITS 基因序列的系统聚类而言，广东紫珠与日本紫珠遗传距离最近，聚类结果与形态学分类不一致，可作为广东紫珠系统发育的支持㊂作为重要原料药，广东紫珠资源不足，市场上采用大叶紫珠（FM163246）代替，两者在形态上有一定差异[14]，ITS 序列分析结果表明，两者遗传距离0.038，聚类分析不在一分支，表明采用ITS 序列能很好将两者分开，但仅根据凭ITS 序列研究紫珠属种系关系是不够全面的，有关其系统分类与亲缘关系的研究尚结合其他DNA 分析手段做出更科学的评价㊂致谢：本研究得到江西省普通本科高校中青年教师发展计划访问学者专项支持，中国药科大学中药学院陆续博士在数据分析中给予指导，在此一并致谢㊂参考文献：[1]王振华，杜勤.紫珠属化学成分研究及其临床应用[J].广东药学，1998，8（3）：5.[2]马延升，朱兰翠.抗宫炎片临床进展[J].中国现代医学杂志，2004，14（10）：69.[3]国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[Z].北京：中国医药科学技术出版社，2010.[4]于华会，杨志玲，杨旭，等.药用植物种质资源ITS 序列研究进展[J].中草药，2010，41（3）：491-496.[5]李家敏.基于SRAP 分析的盘龙参DNA 提取[J].种子，2012，31（12）：32-34.[6]CHEN S L，YAO H，HAN J P，et al.Validation of the ITS2re-gionas a novel DNA barcode for identify ing medicinal plantspecies[J].PLoS One，2010，5（1）：e8613.[7]王洁，杨旭，杨志玲.不同产区厚朴nrDNA ITS 序列分析及亲缘关系鉴定[J].广西植物，2013，33（1）：35-41.[8]王建波，张文驹，陈家宽.核rDNA 的ITS 序列在被子植物系统与进化研究中的应用[J].植物分类学报，1999，37（4）：407-416.[9]SCHMIDT G J，SCHILLING E E.Phylogeny and biogeography ofEupatorium （Asteraceae：Eupatorieae）based on nuclear ITSsequence data[J].American Journal of 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Phylogeny and biogeography of Eupatorium(Asteraceae:Eupatorieae)based on nuclear ITS sequence data 2000(05)10.张春;王晓丽;朱烨中药当归及其混伪品的rDNA ITS序列分析与鉴别 2011(02)11.许亮;窦德强;王冰牛蒡子及其伪品的ITS序列分子鉴定研究 2011(03)12.朱爽;周林;黄楷鸿毛钩藤和无柄果钩藤的ITS序列分析研究 2010(10)13.刘明航;朱芳明;刘峥柳属植物ITS序列分析 2012(04)14.周日宝;刘笑蓉;唐丽君RP-HPLC 法测定不同采收期广东紫珠、大叶紫珠中木犀草素的含量 2011(23)引用本文格式：李家敏.姜琼.汪剑鸣.LI Jia-min.JIANG Qiong.WANG Jian-ming广东紫珠核糖体DNA ITS序列分子鉴定[期刊论文]-湖北农业科学 2014(10)。