糖组学glycomics的背景及研究意义
蛋白质糖基化的研究及进展
展
望
由于糖蛋白本身的复杂性， 由于糖蛋白本身的复杂性，蛋白质糖基化的研究必须 采取多元化的研究策略和技术， 采取多元化的研究策略和技术，而各种新的检测方法也不 断的被采用。 断的被采用。 随着各种分离技术的不断发展，研究方法也不断 随着各种分离技术的不断发展， 翻新。 翻新。蛋白质糖基化研究也将成为翻译后修饰研究的新热 点
蛋白质糖基化的研究策略
1.凝胶技术与质谱联用 凝胶技术与质谱联用
与磷酸化之间存在 “阴阳”关系 可以 被筛选和鉴定
细胞组织
双向电泳
切割 酶切
质谱分析 糖链鉴定 数据库搜索 靶蛋白鉴定及功能分析
2.非凝胶技术与质谱联用 非凝胶技术与质谱联用
O-β-GlcNA pr 亲和层析 母离子扫描 366 数 据 库 搜 索 鉴 定
3 蛋白质糖基化常用研究方法
糖基化位点分析 糖基化蛋白分析 糖链分析
因为糖链的复杂性，很难通过单一的方法进行序列测定等研究，需 要多种方法组合完成。
单糖分析 糖链释放 蛋白酶水解 去糖基蛋白 糖链 氨基酸分析
糖蛋白
糖基肽
肽链
糖链释放
氨基酸序列分析
去糖基肽链
糖链
分馏/纯化 结构分析 酶解 糖基肽/寡糖多糖图谱 质谱 核磁共振
Mana1-6(Mana1-3)Manβ Mana1-2Mana1-6 (Mana1-3)Manβ 较强 最强
4 糖基化蛋白质的分离技术
缺少三甘露糖核心结构或含有阻碍性的3-OH， 较弱 6-OH取代基团的Mana（α1-6）
Galectin LEC-6
半乳糖苷结合凝集素是一类分布广泛，不依赖于金属离子的 可溶性凝集素 很多生物具有保守性 倾向于结合包含半乳糖且 具有分枝结构的N-连接糖链
糖生物学
糖类和血型
• 众所周知人类的主要血型是ABO型，是 1900年Landsteiner发现的。这一发现在 第一次世界大战期间对抢救伤员作出了重 大贡献Landsteiner因发现ABO血型而获得 1930年诺贝尔生理和医学奖。 • 经过许多免疫学家半个多世纪的研究， 1960年Witkins确定了ABO(H)的抗原决定 簇是糖类，并测定了有关糖类的结构。
一个分子生物学的扩展
糖类药物
• 以糖类为基础的抵抗疾病的药物来源很广，多数 是天然存在的化合物，例如糖苷类。 • 以糖类为基础的药物的作用位点是在细胞表面， 这类药物干扰整个细胞和机体。科学家认为，糖 类药物是副反应相对较小的药物之一。它们不仅 可以作为治疗疾病的药物，也可作为保健食品。 • 以糖类为基础疫苖 • 以糖类为基础的药物，不仅可用于人与动物，还 可以用作农药，比起传统的化学农药来，以糖类 为基础的生化农药对环境的污染更小。
• 己糖胺 Hexosamines ，N-乙酰半乳糖胺(GalNAc) • 五碳糖Pentoses：木糖 xylose (Xyl) • 脱氧已糖，Deoxyhexoses:岩藻糖(Fuc) • 己糖胺 Hexosamines :N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc) • 九碳糖酸: N-乙酰神经氨酸(NeuAc) • 糖醛酸，Uronic Acids：glucuronic acid (GlcA) and iduronic acid (IdA).
聚糖更新
• 像活细胞的所有组成部分，多聚糖不断更新。 • 介导反应的酶：exoglycosidases或 endoglycosidases 。 • 一些单位可被删除，然后添加到没有降解的链上。 • 最后完成降解在溶酶体内，由一系列的糖苷酶降 解。降解的单糖常出溶酶体进入细胞质再利用。 • ER -高尔基途径聚糖聚合相对缓慢，细胞核和细 胞质多聚糖可能会更动态，并迅速。
糖组学glycomics背景及研究意义
示例： 糖链的生物学功能
（1）糖链在糖蛋白新生肽链折叠和缔合中的作用
研究表明：糖蛋白N-糖链在参与新生肽的折叠，维持蛋白 质正确构象时起重要作用。
糖组学glycomics背景及研究意义
N,
缺红
乏细
则胞 不血 能凝 折素 叠， 呈如
三
（2）糖链影响糖蛋白的分泌和稳定性
糖组学glycomics背景及研究意义
●糖链与激素活性
糖蛋白激素主要有腺垂体促激素类包括FSH(促卵泡激 素),LH(促黄体生成激素)和TSH(促甲状腺 激素)以及胎盘绒毛 膜促性腺激素和肾脏红细胞生成素(erytlmpoietin,EPO)等。 FSH、LH和TSH均由α亚基和β亚基组成,两个亚基都有N一糖 链。糖链呈高度不均一性,例如LH和TSH中精链的外链末端有 些为SO4--4GalNAc β 1，有些为Sia α2 → 3Gal β 1→,而FSH中 的糖链都是以 Sia α2 → 3Gal β 1→为末端的。已经证明，带 有SO4--4GalNAc β 1→末端结构的激素对受体的亲和力比带有 Sia α2 → 3Gal β 1→末端的激素高，但在体内的半寿期前者比 后者短,因为在肝脏网状细胞表面有特异结合SO4--4GalNAc β 1→为末端的糖链的受体,而Sia为末端的糖链则必须经唾液酸 酶水解除去Sia从而暴露Gal后才能被半乳糖结合受体识别并清 除。
糖组学glycomics背景及研究意义
●与细胞粘着有关
细胞粘着(cell adhesion)是进化中随着多细胞生物出现的必 然现象。多细胞生物中细胞有相互识别而聚集成细胞群的能力— —细胞粘着。细胞群或组织(tissue)中细胞与细胞之间充满着由 糖蛋白(胶原蛋白、纤连蛋白、层粘蛋白)、蛋白聚糖、透明质酸 等组成的胞外基质(extracellular matrix,ECM)。在整个生物体 中,ECM形成一个连续的主体网络结构,所有的细胞都交织或浸泡 在这一网状基质中,网络中细胞一细胞粘着,细胞一ECM粘着都是 通过有关的膜内在蛋白质(integral membrane protein)完成的。 这些膜蛋白称细胞粘着分子(cell adhesion molecule, CAM)或 粘着蛋白,包括整联蛋白(integrin),钙粘着蛋白(cadher --in)免 疫球蛋白超家族(Ig superfamily),血管地址素(vescular addressin) 选择蛋白(selectin)等。CAM 绝大多数都是含N一 糖链的糖蛋白.例如整联蛋白是由α一和β一亚基组成的异二聚体, 两个亚基上有多个N一糖基化位点。去糖链的整联蛋白完全失去 与纤连蛋白的粘着能力。
糖基化反应的生物学意义
糖基化反应的生物学意义糖基化（Glycosylation）是指将糖基或糖类分子连接到生物分子（如蛋白质、核酸、脂质等）中的反应。
在生物体内，糖基化反应是一种非常重要的化学反应。
它可以使生物分子的功能、稳定性、适应性得到调节，从而起到调控和保护生物体的作用。
下面我们将介绍糖基化反应在生物学领域中的意义。
1. 蛋白质的糖基化反应蛋白质是生物体内最重要的分子之一。
它们在生物体内具有多种重要的功能，包括催化化学反应、结构支持、信号传递等。
蛋白质的糖基化反应能够影响这些功能。
（1）保护蛋白质不被降解。
糖基化反应能够改变蛋白质表面的电荷、立体构象等特性，从而防止其被蛋白酶等降解酶作用；（2）调节蛋白质的稳定性。
糖基化反应能够增加蛋白质的热稳定性和酸碱稳定性，提高其耐受不良环境的能力；（3）改变蛋白质的空间构象。
糖基化反应可以改变蛋白质的空间构象，从而增强其结构的支持能力；（4）增强蛋白质的溶解性。
糖基化反应能够增强蛋白质的溶解性，增加其传输和吸收能力；（5）调节蛋白质的信号传递。
糖基化反应能够调节蛋白质的信号传递功能，从而影响生物体内的细胞信号传递过程。
2. 糖基化反应在免疫学中的作用糖基化反应在生物体内的免疫系统中也有重要作用。
它可以影响免疫细胞的信号传导、细胞识别以及免疫调节过程。
（1）激活免疫反应。
糖基化反应会导致特定的免疫反应，这能够促使机体对病原体的清除更加有效；（2）识别细胞和细菌。
糖基化反应能够帮助免疫细胞识别并攻击异质体，如病原体、癌细胞等；（3）调节炎症反应。
糖基化反应能够调节炎症反应的强度和时间，保证免疫反应不会对机体产生过度伤害。
3. 糖基化反应在神经学中的作用糖基化反应在神经学中也有重要作用。
神经细胞表面的糖基化反应能够影响神经元的生长、发育以及信号传递。
（1）调节神经元的生长和发育。
神经元表面的糖基化反应能够调节其与环境之间的交互，从而影响神经元的生长和发育。
糖基化反应也能使神经元生成的突触更加稳定；（2）调节神经元的信号传递。
糖组学中糖蛋白糖链的研究技术及进展
糖组学中糖蛋白糖链的研究技术及进展1988年牛津大学Dwek教授在Annual Review of Biochemistry上发表了题为“Glycobiology”(糖生物学)的综述，首次提出了糖生物学这一概念，标志着糖生物学这门学科的诞生[1]。
在十几年后，糖生物学在糖链结构、生物合成、生理功能等方面取得了极大地进展。
作为第3种生命信息分子的糖链正越来越受到重视，于是糖组学被誉为是继基因组学和蛋白质组学后的第三领域。
糖组是指细胞内所有的糖链，包括糖复合物[2]。
糖组学是研究糖链的表达、调控和生理功能的科学，通过研究糖链确定基因所携带的遗传信息与功能之间的关系。
糖组学的研究依赖于糖组研究技术的发展，其中糖蛋白和糖链的研究技术比较成熟，本文主要对这两方面进行综述。
1.糖组学研究的内容及意义基因对生命活动的调控是由基因所编码的蛋白质及其所合成的糖链和脂类来体现的，因此基因功能的阐明不仅需要基因组学的研究，还必须开展蛋白质组学和糖组学的研究。
糖链、核酸和蛋白质都是生物大分子，但是糖链的结构远比核酸和蛋白质复杂，这是由于聚糖的糖单位之间糖苷键的链接方式的多样性[3]。
糖链参与几乎所有真核生物的每一生命过程，其功能是复杂而多样的在分子内，糖蛋白糖链影响蛋白质的折叠、溶解度、半衰期、抗原性及生物活性等。
在分子间，糖链可以通过糖基化影响蛋白的功能，更重要的是还与信号传递、细胞通讯密切相关。
.糖与糖之间的相互作用介导细胞-细胞相互作用也被证实.因此糖组学的重要研究内容之一就是作为信息分子的糖类如何在细胞识别和信号传导中发挥作用[4]。
为了研究糖类在细胞识别和信号传导中的作用首先要完成4个方面：什么是基因编码糖蛋白，即基因信息；实现被糖基化的位点，即糖基化信息；聚糖结构，即结构信息；糖基化功能，即功能信息[5]。
目前预测细胞内超过５０％的蛋白质为糖蛋白，在这些糖蛋白中蛋白质是生理功能的主要承担者，而糖链则通过改变蛋白质的折叠方式、生物活性、溶解度、疏水性、聚合、降解、电荷、粘度及质量，对蛋白质的功能起修饰作用。
课件5-糖组学
（五）糖蛋白聚糖具有分子间的识别作用
聚糖中单糖分子连接的多样性是聚糖起到分
子识别作用的基础。
受体与配体识别和结合也需聚糖的参与。
细胞表面糖பைடு நூலகம்合物的聚糖还能介导细胞-细胞
的结合。
第二节
蛋白聚糖
Proteoglycan
蛋白聚糖是一条或多条糖胺聚糖以共价键与核 心蛋白形成的大分子糖复合物化合物。
类风湿关节炎
单糖
糖类
多糖
糖蛋白(glycoprotein)
糖复合物 (glycoconjugates)
蛋白聚糖(proteoglycan) 糖脂(glycolipids)
第一节 糖蛋白
Glycoprotein
糖蛋白
一种或多种糖以共价键连接到肽链上的蛋白质。 蛋白质含量较多，糖所占比例变动大，表现为 蛋白质的特性。 分布细胞膜、溶酶体、细胞外液
胞吞作用并降解
●与细胞粘着有关
细胞粘着(cell adhesion)是进化中随着多细胞生物出现的 必然现象。多细胞生物中细胞有相互识别而聚集成细胞群的能 力——细胞粘着。细胞群或组织(tissue)中细胞与细胞之间充满 着由糖蛋白(胶原蛋白、纤连蛋白、层粘蛋白)、蛋白聚糖、透明 质酸等组成的胞外基质(extracellular matrix,ECM)。在整个生 物体中,ECM形成一个连续的主体网络结构,所有的细胞都交织或 浸泡在这一网状基质中,网络中细胞一细胞粘着,细胞一ECM粘着 都是通过有关的膜内在蛋白质(integral membrane protein)完 成的。这些膜蛋白称细胞粘着分子(cell adhesion molecule, CAM)或粘着蛋白,包括整联蛋白(integrin),钙粘着蛋白(cadher --in)免疫球蛋白超家族(Ig superfamily),血管地址素 (vescular addressin) 选择蛋白(selectin)等。CAM 绝大多数 都是含N一糖链的糖蛋白.例如整联蛋白是由α一和β一亚基组成 的异二聚体,两个亚基上有多个N一糖基化位点。去糖链的整联蛋 白完全失去与纤连蛋白的粘着能力。
多糖研究进展
酸提取法
有些多糖，含葡萄糖醛酸等酸性基团的多 糖，适合用稀酸提取。可用乙酸或盐酸使溶液 成酸性再加乙醇，使多糖沉淀析出。 由于H+的存在抑制了酸性杂质的溶出，稀 酸提取法产品纯度相对较高，但在酸性条件下 可能引起糖苷键断裂，因此，只在一些特定的 多糖提取中占有优势。
酶提取法
反应在低能量水平进行，且在温和条件下分 解组织，加速释放多糖。常用的提取酶有蛋白 酶、纤维素酶、果胶酶。 酶提法杂质易于去除，缩短提取周期，条件 温和，目标产物活性高，产物大多无毒，极大 程度提高了多糖的提取率。 一般作为辅助手段。
近年来，大量研究表明多糖除了有增强免疫 功能、抗肿瘤作用、抗氧化、抗衰老、消化系统 保护作用的生物学效应外，还有抗菌、抗病毒、 降血糖、降血脂、抗辐射、抗凝血、抗肿瘤等作 用。 随着多糖的制备、结构、合成、药理学及临 床学研究的不断深入，多糖药物将具有更广阔的 前景。
多糖的提取
多糖的生物活性倍受关注，但不少多糖的提 取方法和工艺尚未成熟，各种方法的开发、比较、 分析是研究工作的焦点之一。 目前多糖提取方法主要有溶剂提取法、酸提 法、碱提法、酶解法、超滤法、超声法、微波法、 超临界流体萃取法等。
多糖色素的去除
多糖提取过程中，会有色素物质产生（氧化或 其他），影响多糖的色谱分析和性质测定。 色素一般是酚型化合物，大多呈负性离子，不 能用吸附去除。 DEAE-纤维柱（DEAE-Sepharose Fast Flow ）是 最常用的方法，不仅可以达到脱色的目的，而且可 以进行多糖的分离。 氧化脱色：用于多糖与色素结合的情况。 （余华）：海带多糖中，H2O2 氧化脱色较吸附脱 色好，但温度不宜过高，应在低温下进行，否则其 氧化性易引起多糖的降解。
OD490nm
10 15 20 25 0 5
糖组学综述
糖组学14211030578 王志来一、糖组及其复杂性与糖组学1、1 糖组及其复杂性根据基因组与蛋白质组得定义,糖组应该被定义为单一生物体中得整套聚糖系统。
但就是相比而言,糖组比基因组与蛋白质组复杂很多。
倘若基因不发生突变,一个生物体得基因组也就是不变得,而同一个基因却可产生多种相关但就是又不同得。
此外,相当多得蛋白质在表达后,又经受了一系列得后加工。
相同得得基因组在不同得外界刺激条件后,可以产生不同得蛋白质组,做出相应得应答。
因此,一个基因组对应得不就是一个蛋白质组[1]。
蛋白质→糖类可以认为就是基因信息传递得延续。
在蛋白质得肽链上,可以挂上糖链,成为糖蛋白,使蛋白质具有更多得特性与功能。
同样结构得聚糖又可接到不同得载体上,形成不同得糖复合物:糖蛋白、蛋白聚糖与糖脂等。
不同情况下,糖复合物得糖链结构则变化更多。
在所有生物体中,基因就是由4种核苷酸构成得,因此,所有生物得基因组可以用同样得方式表述。
在不同生物体得蛋白质组,已就是各不相同得,所幸得就是,它们得结构还可以从基因组推断。
而不同生物体中得糖组,则无法统一,更无法由基因组推测。
例如,植物与微生物有细胞壁,而动物没有。
植物与微生物得细胞壁分别由不同得糖类构成。
细菌都有肽聚糖,但就是,革兰氏阴性菌还有脂多糖,而革兰氏阳性菌则没有脂多糖。
不同得真菌又因为表面得多糖组成得不同,而归属于不同得种属。
植物合成各种各样得多糖,此外,它们得次生代谢产物中有许多就是糖苷,它们得“糖组”更就是纷繁复杂。
基于以上两个原因,希望包罗万象地用一个“糖组”包括单一生物体中得整套聚糖,几乎就是不可能得。
所以,糖组得复杂性就是不言而喻得。
与此同时,与基因组不一样,不同生物糖组得可比性也极小。
因此,对糖组得研究最合适得做法就是将糖组分解为不同得小组,例如对高等动物得糖组可分为糖蛋白组、蛋白聚糖组与糖脂组。
而且,与细菌与植物相比而言,高等动物得糖组还就是比较简单得。
平林淳与笠井献一得研究组迄今所着眼得就是糖蛋白组,而且以线虫得基因组为基础[2]。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
The lectins tested recognize the following residues:
β-D-galactosyl [Ricinus communis agglutinin 120, (RCA1) and peanut agglutinin, (PNA)]; α-D-galactosyl [Griffonia simplicifolia agglutinin (GSA)]; α-D-mannosyl>α-D- glucosyl [concanavalin A (ConA) and Lens culinaris agglutinin (LcH)]; N-acetyl- and N-glycolylneuraminic acid [Limax flavus agglutinin (LFA) andLimulus polyphemus agglutinin (LPA)]; N-acetyl-glucosaminyl and sialyl [wheat germ agglutinin (WGA)]; N-acetyl-D-galactosaminyl [Helix pomatia agglutinin (HPA) and Dolichos biflorus agglutinin (DBA)] andα -Lfucosyl [Ulex europeus agglutinin (UEA-1)].
（4）糖链影响糖蛋白的生物学活性 ●糖链与酶活性 糖链在酶的新生肽链折叠、转运和保护等 方面普遍起作用。但糖链与成熟酶活性的关 系因酶而异。有些酶除去糖链活性不受影响, 如UDP-葡糖醛酸酶、酵母羧肽酶等。有些酶 的活力依赖其糖链的存在， 如溶酶体β一葡 糖苷酶除去糖链后只有免疫活性而而完全没 有酶活力。
免 疫 球 蛋 白 如 缺 乏 糖 链 则 不
N-
（3）糖链参与分子识别和细胞识别
●与血浆中老蛋白的清除有关
血清中很多蛋白质式含有以唾液酸残基为末端的N-糖链糖蛋 白，称唾液酸糖蛋白，如免疫球蛋白、蛋白质激素，载体蛋白等。
如被唾液 酸酶降解
与肝细胞膜上的去唾液酸糖蛋白受体结合
胞吞作用并降解
●与精卵识别有关
●N-糖链的分类
★复杂型N-糖链的分支
B、 O－糖链
特点：与N-糖链相比结构简单，但连接形式多。
几种糖蛋白糖链的单糖组成、异头 碳构型、糖苷键的连接位臵和糖残基的序 列分析等内容。糖蛋白糖链的结构分析包 括糖蛋白的提取分离、糖链释放和糖链结 构鉴定等多个步骤。
●糖链与激素活性
糖蛋白激素主要有腺垂体促激素类包括FSH(促卵泡激 素),LH(促黄体生成激素)和TSH(促甲状腺 激素)以及胎盘绒毛 膜促性腺激素和肾脏红细胞生成素(erytlmpoietin,EPO)等。 FSH、LH和TSH均由α亚基和β亚基组成,两个亚基都有N一糖 链。糖链呈高度不均一性,例如LH和TSH中精链的外链末端有 些为SO4--4GalNAc β 1，有些为Sia α2 → 3Gal β 1→,而FSH中 的糖链都是以 Sia α2 → 3Gal β 1→为末端的。已经证明，带 有SO4--4GalNAc β 1→末端结构的激素对受体的亲和力比带有 Sia α2 → 3Gal β 1→末端的激素高，但在体内的半寿期前者比 后者短,因为在肝脏网状细胞表面有特异结合SO4--4GalNAc β 1→为末端的糖链的受体,而Sia为末端的糖链则必须经唾液酸 酶水解除去Sia从而暴露Gal后才能被半乳糖结合受体识别并 清除。
●糖链与IgG 活性
每分子IgG 均含糖链约三条，几乎全部N一糖链都是复杂型, 非还原末端残基为Sia或Gal(去Sia),少数为GlcNAc(去Sia-Gal), IgG的N-糖链多达30余种,呈高 度不均一性。如IgG的N一糖链缺 失外链Gal (这种糖链称G0 糖链）后,可成为一种自身抗原,被免 疫系统识别而产生自身抗体。后者能与带有Go糖链的Ig G生成 免疫复合体，沉积于关节腔内,引起炎症。这种免疫复合体是由 带Go糖链的IgGFc段(作为抗原)和带末端Sia的IgG(作为抗 体)Fab段结合而成,实际上是IgG的自身聚合物。类风湿性关节 炎、红斑狼疮等都是一种与IgG的糖链结构改变有关的自身免疫 病(autoimmune disease)。
类风湿关节炎
总之
毫无疑问,如果试图深入了解生命的复杂规 律,就必须有“基因组－蛋白质组－糖组” 的整体观念,这样才有可能揭示自身全部基 因功能,从而进一步深入研究疾病的发病机 制,有效控制疾病的发生、发展及预后,以 及筛选疾病、预测诊断标记物和开发新的 药物靶标。
2、糖组学的研究策略
糖组学的研究远较基因组学、蛋白质组学复杂。 目前糖组学关注的焦点是糖蛋白,为了更好地与蛋白质组学相 关联,将研究对象锁定为糖肽。研究核心策略为: (1) 分析单物种生物所产生的所有聚糖; (2) 以糖肽为研究对象确认编码糖蛋白的基因; (3) 结合有效的理化和生化性质,研究糖蛋白糖链的性质。 研究的重点在于: (1) 编码糖蛋白的基因; (2) 实际糖基化的位点; (3) 聚糖结构; (4) 糖基化的作用。 主要分为三大部分: 结构糖组学、功能糖组学以及生物信息 学;其中结构糖组学主要包括“糖捕获”技术、前沿亲和层析 技术等,功能糖组学主要包括微阵列技术等。
示例： 糖链的生物学功能
（1）糖链在糖蛋白新生肽链折叠和缔合中的作用
研究表明：糖蛋白N-糖链在参与新生肽的折叠，维持蛋白 质正确构象时起重要作用。 缺 乏 则 不 能 折 叠 呈 三 聚 体 红 细 胞 血 凝 素 ， 如 糖 链
,
N-
（2）糖链影响糖蛋白的分泌和稳定性
能 分 泌 到 胞 外 而 留 在 内 质 网 中
（1）糖蛋白的提取和分离纯化
糖蛋白多定位于细胞表面,属于膜蛋白,水溶性不 好,其有效提取是糖组学糖链结构研究的瓶颈之 一。目前常采用先制备质膜,然后用CHAPS 等去 污剂释放或Triton X－114 相分离、有机溶剂萃 取等方法提取糖蛋白。获得的糖蛋白主要采用透 析、超滤、电泳和层析等方法来分离纯化,其中 由几种不同类型凝集素亲合柱组成的序列凝集素 亲合层析(serial lectin affinity chromatography, SLAC) 法是较好的方法。
1、糖组学(glycomics) 的背景及研究意义
20 世纪末,继基因组学、蛋白质组学之后,糖组学也日益受 到人们关注。顾名思义,糖组学是对糖链组成及其功能研究 的一门新学科,是基因组学的后续和延伸,具体内容包括研究 糖与糖之间、糖与蛋白质之间、糖与核酸之间的联系和相互 作用,其主要研究对象为聚糖。丰富多样的聚糖覆盖了生物 有机体的所有细胞,不仅体现细胞的类型和状态,也参与了许 多生物学行为,如细胞发育、分化、肿瘤转移、微生物感染、 免疫反应等;聚糖还体现生物和分子的进化作用,如糖酵解、 生物合成的保守性以及核糖的起源等。
（3）糖链的分离纯化
A、层析法 柱层析是分离纯化糖蛋白糖链的常规方法,由分离机制不 同可以有离子交换、分子筛、正相和反相等不同形式。 一般常压和低中压柱层析所需样品量较大,而高效液相层 析(HPLC) 因上样量少、灵 敏度高、重现性好、更加快 速和自动化,是目前微量糖链分析的首选。不同结构的糖 链在不同HPLC上的层析行为是不同的。 为了更充分、更准确地分离分析糖链混合物,可将几种不 同类型的HPLC 组合成多维HPLC (MD－HPLC) ,如离子交 换HPLC、正相HPLC、反相HPLC 组合就构成了3D－HPLC。 为达到最大分离效率,各维之间的分离模式应是各自独立 的,而且高维的分离速度应快于低维的分离速度,以避免 已分开组分的重新混合。
受精是精子与卵子的 融合。哺乳动物的卵子外 面有一层透明的糖蛋白外 衣，称透明带（zone pelluci da,ZP)。透明带 由ZP-1、ZP-2和ZP-3三种 糖蛋白组成,受精中起主要 作用的是ZP-3,连接在ZP-3 上的O -GalNAc糖链能被精 子表面上的凝集素受体识 别(有物种特异性)。O GalNAc糖链的非还原端是 一个α一连接的半乳糖残 基,它可能在精卵识别中起 关键作用。
●SLAC
研究发现，植物凝集素是一类能选择性地结合糖链的糖结合 蛋白。利用这种特性可以特异性地富集某种糖蛋白/糖链。 用于纯化糖蛋白/糖链的植物凝集素主要有刀豆凝集素 (concanavalin A, Con A)、麦胚凝集素(wheat germ agglutinin, WGA)、豌豆外源凝集素(pea lectin)、植物血 凝素(phytohaemagglutinin-E4 ,E4-PHA) 和网孢盘菌凝集 素(Aleuria aurantia lectin,AAL)等。单一一种凝集素并 不能够富集细胞中所有的糖蛋白/糖链，因此科学家们在上 世纪80年代发明了一种被称作连续凝集素亲和色谱(serial lectin affinitychromatography, SLAC) 的方法来分离同一 细胞中的各种糖蛋白/糖链。这种方法是将不同的凝集素亲 和柱串联排列，样品混合物依次经过这些亲和柱，这样就可 将不同的糖蛋白/糖链富集在不同的柱中，提高了糖蛋白/糖 链的回收效率和混合糖蛋白/糖链的分离效果。
（2）糖链的释放
纯化后的糖蛋白样品即可进行糖链释放。糖链释放一般 有化学释放和酶释放两种方法。 化学法主要有肼解法和β－消除法,前者可释放糖蛋白的 N－糖链和O－糖链,目前已实现仪器自动化。但因该法反 应条件剧烈,肼解后需对糖链进行乙酰化复原处理,而且 蛋白部分已经破坏,无法进行有关糖基化位点的研究。 酶法释放糖蛋白糖链因方法简单,条件温和,能够提供有 关糖链残基组成、排列顺序和糖苷键的α或β构型等信 息,目前应用较广。较常用的释放N－糖链的特异蛋白酶 有N－糖肽酶F(PNGase F) 和N－糖肽酶A(PNGase A) ,二 者具有很好的互补性,常联合使用。而PNGase F 因广谱 性好,也常单独使用。对于特异释放糖蛋白O－糖链的酶, 目前发现的较少,且广谱性不强。